邵莉 1，劉德軍 1，賀玲 2，陶弘武

（1.遼寧中醫(yī)藥大學附屬第三醫(yī)院制劑中心，遼寧沈陽 110003；2.沈陽紅旗制藥有限公司，遼寧沈陽 110179；3.遼寧中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院/遼寧省中醫(yī)藥研究院，遼寧沈陽 110034）

利咽解毒顆粒由板藍根、大青葉、連翹、玄參、地黃等16味藥組成，臨床上主要用于外感風熱所致的咽痛、咽干、喉核紅腫、兩腮腫痛、發(fā)熱惡寒；急性扁桃體炎、急性咽炎、腮腺炎見上述證候者[1]?，F(xiàn)代研究表明，利咽解毒顆粒可明顯減輕小鼠耳腫脹度，抑制家兔聲帶炎性滲出及傷寒菌苗引起的發(fā)熱，具有良好的抗炎解熱作用[2]；對急慢性咽炎、扁桃體炎治療效果顯著，不良反應(yīng)少[3]。中藥及其制劑，尤其是中成藥復(fù)方制劑，所含成分復(fù)雜，尤其是制劑生產(chǎn)所有原藥材，不同種屬、產(chǎn)地以及采收季節(jié)原藥材差異較大，直接影響中成藥復(fù)方制劑的產(chǎn)品質(zhì)量。利咽解毒顆粒收載于2020年版《中國藥典》一部[1]，現(xiàn)有的質(zhì)量控制標準[1]和文獻報道僅對利咽解毒顆粒所含黃芩苷、大黃素等1～2種成分進行定量控制[4-6]，而黃芩苷、大黃素來源廣泛，作為其定量控制指標成分專屬性不強。本研究根據(jù)中醫(yī)配伍理論，結(jié)合中藥質(zhì)量標志物確認原則，采用HPLC梯度洗脫法對利咽解毒顆粒君藥板藍根、大青葉所含主要成分（R，S）-告依春、直鐵線蓮寧B，臣藥連翹所含主要藥效成分連翹酯苷B、連翹酯苷A和連翹苷，佐藥玄參所含主要活性成分哈巴苷、哈巴俄苷的質(zhì)量分數(shù)進行同時測定，同時采用聚類分析和主成分分析等化學計量學方法對不同廠家利咽解毒顆粒產(chǎn)品質(zhì)量進行分析，為全面評價利咽解毒顆粒整體質(zhì)量提供科學的實驗數(shù)據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent 1100型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；BAS224S型電子天平（德國Sartorius公司），KQ-250DV型超聲波清洗器（昆山市舒美超聲儀器有限公司）。連翹酯苷B、（R，S）-告依春、連翹酯苷A、連翹苷、哈巴苷、哈巴俄苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號分別為111811-201603、111753-201706、111810-201707、110821-201816、111729-201707、111730-201709，質(zhì)量分數(shù)分別為96.6%、100.0%、97.2%、95.1%、96.8%、95.9%）；直鐵線蓮寧B對照品（武漢天植生物技術(shù)有限公司，批號為CFS201901，質(zhì)量分數(shù)為98.0%）。乙腈為色譜純，其他試劑為分析純。

陰性樣品制備所用板藍根、大青葉、連翹、金銀花、薄荷、炒牛蒡子、天花粉、浙貝母、大黃、黃芩、地黃、玄參、麥冬、僵蠶、焦山楂和桔梗來源于沈陽中藥飲片藥業(yè)有限公司，經(jīng)檢驗均符合2020年版《中國藥典》規(guī)定。利咽解毒顆粒（規(guī)格：每袋裝6 g；批號：07719090512、07719100112、07719120212、07719120312、0771912 0412、07720020412、07720030512、07720050112，編號分別為S1～S8，來源于河北永豐藥業(yè)有限公司；批號：20020321、20022631、20022731、20040421，編號分別為S9～S12,來源于神威藥業(yè)集團有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 混合對照品儲備液的制備

精密稱取（R，S）-告依春、直鐵線蓮寧B、連翹酯苷B、連翹酯苷A、連翹苷、哈巴苷、哈巴俄苷對照品各適量，用50%（體積分數(shù)，下同）甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0.326、0.118、0.202、1.276、0.454、1.372、0.398 mg/mL的混合對照品儲備液。

2.2 混合對照品溶液的制備

精密量取“2.1”項下儲備液1.0 mL，用50%甲醇稀釋至20 mL，制得（R，S）-告依春16.3μg/mL、直鐵線蓮寧B 5.9μg/mL、連翹酯苷B 10.1μg/mL、連翹酯苷A 63.8μg/mL、連翹苷22.7μg/mL、哈巴苷68.6μg/mL、哈巴俄苷19.9μg/mL的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液和陰性樣品溶液的制備

取利咽解毒顆粒樣品適量，剪開內(nèi)包裝，傾出內(nèi)容物研細，取2.0 g，精密稱定，置25 mL量瓶中，加入50%甲醇適量，采用超聲方式對樣品進行提取30 min，取出，擦凈外壁，放冷后用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。按利咽解毒顆粒質(zhì)量標準項下處方工藝，分別制備不含板藍根和大青葉、不含連翹、不含玄參的陰性樣品，再按上述方法制成各陰性樣品溶液。

2.4 色譜條件與專屬性考察

采用Agilent Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）液相色譜柱；柱溫設(shè)定為30℃；流動相為乙腈（A）-0.2%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～14.0 min，12.0%A；14.0～23.0 min，12.0%→20.0%A；23.0～37.0 min，20.0%→45.0%A；37.0～51.0 min，45.0%→58.0%A；51.0～60.0 min，58.0%→12.0%A）；流速為0.9 mL/min；進樣量為10μL；檢測波長分別為230 nm[0～23.0 min檢測（R，S）-告依春、直鐵線蓮寧B][7-9]、275 nm[23.0～37.0 min檢測連翹酯苷B、連翹酯苷A、連翹苷][10-11]和210 nm[37.0～60.0 min檢測哈巴苷、哈巴俄苷][12-14]。在此色譜條件下，7種目標化合物的色譜峰分離效果理想，分離度均>1.5，理論板數(shù)按各目標化合物色譜峰計均≥3 500，陰性樣品對測定無干擾（圖1）。

圖1 混合對照品（A）、利咽解毒顆粒（B）、板藍根大青葉陰性樣品（C）、連翹陰性樣品（D）和玄參陰性樣品（E）HPLC色譜圖Figure 1 HPLC chromatograms of the mixed reference(A),Liyan Jiedu granules(B),negative sample without Isati‐dis Radix and Isatidis Folium(C),negative sample with‐out Forsythiae Fructus(D)and negative sample without Scrophulariae Radix(E)

2.5 線性關(guān)系考察

精密量取“2.1”項下儲備液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，分別置于6個20 mL量瓶中，用50%甲醇定容制成6種系列質(zhì)量濃度混合對照品溶液，各精密吸取10μL，依次進樣測定7種目標化合物的峰面積，以質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，結(jié)果見表1。

表1 7種目標化合物的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢測限和定量限Table 1 Regression equations,correlation coefficients,linear ranges,limit of detection and limit of quantitation of seven constituents

2.6 精密度、重復(fù)性與穩(wěn)定性試驗

取混合對照品溶液連續(xù)進樣6次，測得（R，S）-告依春、直鐵線蓮寧B、連翹酯苷B、連翹酯苷A、連翹苷、哈巴苷、哈巴俄苷的峰面積的RSD值分別為0.81%、1.12%、0.95%、0.64%、0.78%、0.56%、1.03%，表明儀器精密度良好。精密稱取同一批利咽解毒顆粒（編號S1）樣品6份，按“1.2.3 ”項方法制成供試品溶液，依法進樣分析，記錄（R，S）-告依春、直鐵線蓮寧B、連翹酯苷B、連翹酯苷A、連翹苷、哈巴苷、哈巴俄苷的峰面積并計算各目標化合物的質(zhì)量分數(shù)，結(jié)果7種目標化合物質(zhì)量分數(shù)的RSD值分別為1.47%、1.84%、1.72%、1.05%、1.69%、1.28%和1.55%，表明方法重復(fù)性良好。臨用新配一份利咽解毒顆粒（編號S1）供試品溶液，于0、3、6、9、18、24 h進樣測定，結(jié)果（R，S）-告依春、直鐵線蓮寧B、連翹酯苷B、連翹酯苷A、連翹苷、哈巴苷、哈巴俄苷的峰面積RSD值分別為0.77%、1.08%、1.01%、0.62%、0.80%、0.58%、0.99%，表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 加樣回收率試驗

取已知質(zhì)量分數(shù)的利咽解毒顆粒（編號S1）適量，剪開內(nèi)包裝，傾出內(nèi)容物研細，取9份，每份1.0 g，精密稱定，置25 mL量瓶中，分別精密加入混合對照品溶液[（R，S）-告依春0.109 mg/mL、直鐵線蓮寧B 0.043 mg/mL、連翹酯苷B 0.069 mg/mL、連翹酯苷A 0.432 mg/mL、連翹苷0.161 mg/mL、哈巴苷0.467 mg/mL、哈巴俄苷0.142 mg/mL]1.0、2.0、3.0 mL各3份，按“2.3”項方法制成加樣回收樣品溶液，依法進樣測定及計算7種目標化合物質(zhì)量分數(shù)，計算7種目標化合物的回收率及RSD值，結(jié)果見表2。

表2 (續(xù))

表2 利咽解毒顆粒中7種目標化合物的加樣回收率試驗結(jié)果Table 2 Recovery results of seven components in Liyan Jiedu granules(n=9)

2.8 樣品質(zhì)量分數(shù)的測定

取利咽解毒顆粒樣品，按“2.3”項方法制成供試品溶液（每批樣品平行制備3份），依法進樣測定并計算7種目標化合物的質(zhì)量分數(shù)，結(jié)果見表3。

2.9 聚類分析

為考察不同廠家利咽解毒顆粒中7種目標化合物的含量差異，采用SPSS 26.0軟件組間聯(lián)接聚類分析方法，以歐氏距離為測度，對12批次利咽解毒顆粒樣品進行聚類分析，結(jié)果見圖2。由圖可知，當類間距離為15時，12批樣品聚為2類，樣品S1、S4、S3、S2、S8、S6、S7和S5聚為第Ⅰ類，樣品S9、S12、S11和S10聚為第Ⅱ類，即同一生產(chǎn)企業(yè)所生產(chǎn)樣品聚為一類。表明同一生產(chǎn)企業(yè)所生產(chǎn)樣品較為穩(wěn)定，不同生產(chǎn)企業(yè)間所生產(chǎn)樣品產(chǎn)品質(zhì)量存在一定差異。

圖2 12批利咽解毒顆粒聚類分析樹狀圖Figure 2 Cluster analysis tree diagram of 12 batches of Liyan Jiedu granules

2.10 主成分分析

采用SPSS 26.0軟件將表3中7種目標化合物的含量測定結(jié)果導(dǎo)入軟件，對12批利咽解毒顆粒進行主成分分析，得表4主成分特征值和方差貢獻率表及表5初始因子載荷矩陣表。以特征值大于1，累積貢獻率大于85%為提取標準，由表4可以看出前3個主成分初始特征值均>1，累積方差貢獻率達到86.201%，前3個主成分可以代表利咽解毒顆粒中大部分信息。由表5可以看出直鐵線蓮寧B、哈巴苷、哈巴俄苷和連翹酯苷A對主成分1貢獻度高，是對第1主成分影響較大的特征向量；（R，S）-告依春和連翹酯苷B對主成分2貢獻度顯著，連翹苷對主成分3貢獻度顯著。

表3 利咽解毒顆粒中7種目標化合物的質(zhì)量分數(shù)測定結(jié)果Table 3 Determination results of seven components in Liyan Jiedu granules(n=3,x±s) w/(mg·g?1)

表4 主成分特征值和方差貢獻率Table 4 Principal Component Eigenvalue and variance contribution

表5 初始因子載荷矩陣表Table 5 Initial factor load matrix table

3 討論

利咽解毒顆粒由板藍根、大青葉、連翹、玄參、地黃等16味藥組成，方中板藍根、大青葉清熱涼血、解毒利咽，合為君藥；連翹、金銀花、薄荷清熱解毒、疏散風熱、消腫散結(jié)，牛蒡子宣肺透疹、解毒利咽，天花粉清熱瀉火、生津止渴、消腫排膿，浙貝母清熱化痰止咳、解毒散結(jié)消癰，大黃瀉下攻積、涼血解毒，黃芩清熱燥濕、瀉火解毒，共為臣藥；玄參、地黃清熱涼血、養(yǎng)陰生津、解毒散結(jié)，麥冬養(yǎng)陰生津、潤肺清心，僵蠶息風止痙、化痰散結(jié)，山楂行氣散瘀、化濁降脂，共為佐藥；桔梗宣肺利咽、祛痰排膿，為舟楫之劑，載藥上行以達病所，為使藥。諸藥合用共奏解毒退熱、清肺利咽之效。本研究根據(jù)中藥質(zhì)量標志物確認原則，以君藥所含成分為首選，兼顧臣、佐、使藥主要活性成分，選取利咽解毒顆粒方中君藥板藍根、大青葉主要特征成分（R，S）-告依春和直鐵線蓮寧B，臣藥連翹代表性成分連翹酯苷B、連翹酯苷A和連翹苷，佐藥玄參主要活性成分哈巴苷和哈巴俄苷為定量研究指標成分，以期為全面評價利咽解毒顆粒整體質(zhì)量提供科學依據(jù)。

中成藥復(fù)方制劑所含組分多樣，流動相選擇尤為重要，本研究首先考察了甲醇-水[7,9,15-16]和乙腈-水[11,14,17-19]2個流動相體系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇-水體系基線不平穩(wěn)，色譜峰峰形不佳，達不到檢測要求；乙腈-水體系基線稍平穩(wěn)，但連翹酯苷A色譜峰拖尾，與連翹苷色譜峰不能完全分離，且哈巴俄苷色譜峰峰形不佳，干擾檢測結(jié)果。考慮到哈巴苷有末端吸收，進而對乙腈-0.05%磷酸溶液[12-13,20-21]、乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.2%磷酸溶液[10]流動相體系進行對比考察。結(jié)果顯示以乙腈-0.2%磷酸溶液為流動相系統(tǒng)進行梯度洗脫時，基線平穩(wěn)，7種目標化合物色譜峰的分離度均符合要求。

聚類分析通過數(shù)據(jù)挖掘查找復(fù)雜數(shù)據(jù)間存在的內(nèi)在關(guān)聯(lián)關(guān)系，將研究對象分成相同質(zhì)的群組從而進行分類，達到簡化數(shù)據(jù)并獲得復(fù)雜數(shù)據(jù)間存在的規(guī)律。主成分分析將原有眾多一定相關(guān)性的變量通過降維處理重新組合成一組新的綜合變量，以最少的主成分盡可能多地體現(xiàn)原有變量的信息，達到簡化指標的目的，近年來聚類分析和主成分分析已逐步應(yīng)用于中藥制劑的質(zhì)量綜合評價中。本文的化學計量學分析結(jié)果顯示，不同生產(chǎn)企業(yè)樣品間存在一定的質(zhì)量差異，同一生產(chǎn)企業(yè)樣品較為穩(wěn)定，主成分1～3是影響咽解毒顆粒質(zhì)量評價的主要因子，提示藥品生產(chǎn)企業(yè)關(guān)注原藥材種屬來源、采收季節(jié)、初加工方法以及制劑生產(chǎn)過程控制，將直鐵線蓮寧B、（R，S）-告依春和連翹苷等指標成分納入咽解毒顆粒的質(zhì)量控制中，確保產(chǎn)品質(zhì)量和臨床療效的穩(wěn)定性。

本研究采用HPLC梯度洗脫法對利咽解毒顆粒中（R，S）-告依春、直鐵線蓮寧B、連翹酯苷B、連翹酯苷A、連翹苷、哈巴苷、哈巴俄苷含量進行了同時測定，首次建立了利咽解毒顆粒多指標成分質(zhì)量控制模式，同時采用聚類分析、主成分分析等化學計量學手段對檢測結(jié)果進行綜合評價，所建立的方法操作便捷、重復(fù)性好，結(jié)果準確，可用于利咽解毒顆粒的質(zhì)量評價。