姜曉杰，吉家興

（廣東省第二人民醫(yī)院藥學(xué)部，廣東廣州 510317）

心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia/re‐perfusion injury，MIRI）是指心肌血液供應(yīng)中斷，而心肌一定時(shí)間內(nèi)恢復(fù)血流，但原缺血心肌出現(xiàn)較缺血前更為嚴(yán)重的損傷。再灌注心臟伴隨而來(lái)的病理變化有心率失常、舒縮障礙、代謝異常和超微結(jié)構(gòu)改變等[1]。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，仍需進(jìn)一步的研究探討。有研究[2-5]表明其發(fā)病機(jī)制可能與氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、Ca2+超載、細(xì)胞凋亡和自噬等多方面相關(guān)。阿里紅（Fomes off icinalis Ames）作為一種多孔菌科層孔菌屬干燥子實(shí)體，其有著廣泛的民族用藥基礎(chǔ)，是我國(guó)新疆地區(qū)常用的道地藥材。據(jù)醫(yī)書(shū)記載其具有溫胃祛痰、祛風(fēng)除濕、消腫利尿、降氣平喘的功效，臨床上常用于慢性支氣管炎、腹痛、感冒、癌癥等疾病的治療。阿里紅多糖是其主要有效成分之一。阿里紅多糖具有較好的抗炎、抗氧化和抗凋亡活性[6-8]。目前，阿里紅多糖對(duì)MIRI的作用尚未見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道。本研究擬以大鼠MIRI模型為研究對(duì)象，觀察阿里紅多糖對(duì)心肌缺血再灌注損傷的影響，并以凋亡信號(hào)通路Bax/Bcl-2/Caspase-3為靶點(diǎn)探究其抗MIRI的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 儀器與試劑

BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，成都泰盟科技有限公司；小動(dòng)物呼吸機(jī)，上海軟隆科技發(fā)展有限公司；阿里紅，寧波德康生物制品有限公司；氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT），上海弘順生物科技有限公司；地塞米松片：規(guī)格：0.75 mg/片，廣東南國(guó)藥業(yè)有限公司；羊抗鼠Bcl-2和羊抗鼠caspase-3一抗，碧云天生物技術(shù)有限公司；腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白介素1β（IL-1β）ELISA檢測(cè)試劑盒，上海江萊生物科技有限公司；乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶（CK）、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)檢測(cè)試劑盒，齊一生物科技（上海）有限公司。

1.2 動(dòng)物與分組

SPF級(jí)SD大鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(粵)2014-0005。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后，按體質(zhì)量隨機(jī)分為6組，分別為假手術(shù)組、模型組、DEX組、ALH-L組、ALH-M組和ALH-H組，每組10只。各給藥組于造模前預(yù)防給藥1周，除假手術(shù)組和模型組灌胃給予等量生理鹽水外，其中DEX組灌胃給予地塞米松0.8 mg/(kg·d)，ALH-L、M、H組分別灌胃給予阿里紅多糖10、20、40 mg/(kg·d)。

2 方法

2.1 阿里紅多糖提取方法

主要參照文獻(xiàn)[9]的方法提取阿里紅多糖，主要方法如下：粉碎機(jī)粉碎阿里紅1 kg，烤箱中60℃干燥至恒重。稱取500 g置于回流提取器中，加入95%（φ）乙醇2 000 mL，回流提取4 h，過(guò)濾，保留濾液。再加入95%乙醇1 000 mL回流提取藥渣3次，每次提取1 h，過(guò)濾。藥渣再用60℃熱水回流提取3次。先加蒸餾水1 000 mL，60℃下提取4 h再加入500 mL蒸餾水2次，分別提取1 h。合并提取液，離心除去沉淀。將上述合并的提取液采取減壓濃縮方法減至100 mL，隨后加入無(wú)水乙醇使其含醇量達(dá)80%，置于4℃環(huán)境過(guò)夜。取出提取液抽濾，使用95%乙醇、無(wú)水乙醇、丙酮和乙醚分別洗滌沉淀3次，每次50 mL，于干燥箱內(nèi)50℃干燥，產(chǎn)物為阿里紅多糖，共4.2 g。將阿里紅多糖加水溶解，以硫酸-苯酚法測(cè)定測(cè)得多糖百分含量為85.52%，即每克阿里紅含多糖7.18 mg。

2.2 大鼠MIRI模型的建立

大鼠腹腔注射2%異戊巴比妥鈉腹腔麻醉后，仰臥固定，行氣管插管并連接呼吸機(jī)（潮氣量為4 mL/100 kg，呼吸頻率為60次/min，呼吸比為1.2∶1），Ⅱ?qū)?lián)心電圖監(jiān)測(cè)，連續(xù)記錄。于大鼠胸骨左緣第3與4肋之間開(kāi)胸，小心暴露心臟。用無(wú)創(chuàng)縫合線6/0絲線在LAD下穿處，于左心房與肺動(dòng)脈圓錐之間處結(jié)扎，阻斷血流，結(jié)扎缺血30 min后開(kāi)胸及剪斷結(jié)扎線，再灌注23.5 h，術(shù)后注射青霉素防止感染。結(jié)扎成功標(biāo)準(zhǔn)：肉眼可見(jiàn)結(jié)扎線下心臟左室壁變暗變紫，心尖部變白，心電圖示ST段明顯上抬。再灌注成功的標(biāo)準(zhǔn):左心室變紅潤(rùn)，ST段回落。假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎。

2.3 大鼠心臟梗死率檢測(cè)

小心摘取心臟，生理鹽水沖洗干凈，切取心臟結(jié)扎線以下部分，切取2 mm的心肌組織，使用1%NBT染液于37℃孵育染色20 min，中性甲醛固定，拍照，應(yīng)用Image-Pro Plus軟件分析，梗死率=梗死面積/總面積×100%。

2.4 生化指標(biāo)和Western blot檢測(cè)

按照試劑盒說(shuō)明書(shū)使用酶標(biāo)儀檢測(cè)血漿CK、LDH、SOD活性和TNF-α、IL-1β、MDA含量。提取缺血心肌組織中的總蛋白，按常規(guī)Western blot檢測(cè)步驟檢測(cè)Bcl-2和caspase-3的表達(dá)量，在凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行灰度值的計(jì)算和分析。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)量資料用x±s表示。多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 阿里紅多糖對(duì)大鼠MIRI模型心電圖的影響

與假手術(shù)組比較，模型組心電圖ST段顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，DEX組和ALH給藥組心電圖ST段顯著降低（P<0.05）；與ALH-L組比較，ALH-H組心電圖ST段顯著降低（P<0.01）。見(jiàn)圖1、2。

圖1 心電圖變化Figure 1 Change of electrocardiogram

圖2 ST段上抬量Figure 2 Lifting of ST segment

3.2 阿里紅多糖對(duì)大鼠MIRI模型心臟梗死率的影響

模型組心臟梗死率較假手術(shù)組顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，DEX組和ALH給藥組心臟梗死率顯著降低（P<0.05）；與ALH-L組比較，ALH-H組心臟梗死率顯著降低（P<0.05）。見(jiàn)圖3、4。

圖3 各組心臟梗死面積變化(NBT染色)Figure 3 Changes of cardiac infarction area in each group(NBTstaining)

3.3 阿里紅多糖對(duì)大鼠MIRI血漿CK和LDH活性的影響

與假手術(shù)組比較，模型組CK和LDH活性顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，DEX組和ALH給藥組CK和LDH活性顯著降低（P<0.05）；與ALH-L組比較，ALH-H組CK和LDH活性均顯著降低（P<0.05）。見(jiàn)圖5、6。

圖5 各組血漿CK活性變化（x±s）Figure 5 Changes of plasma CK activity in each group(x±s)

3.4 阿里紅多糖對(duì)大鼠MIRI血漿TNF-α和IL-1β含量的影響

圖4 各組心臟梗死率變化Figure 4 Change of cardiac infarction rate

圖6 各組血漿LDH活性變化（x±s）Figure6 Changesof plasma LDHactivity in each group(x±s)

與假手術(shù)組比較，模型組TNF-α和IL-1β含量明顯升高（P<0.01）；與模型組比較，DEX組和ALH給藥組TNF-α和IL-1β含量顯著降低（P<0.05）；與DEX組比較，ALH-H組TNF-α和IL-1β含量顯著降低（P<0.05）；與ALH-L組比較，ALH-H組TNF-α和IL-1β含量顯著降低（P<0.05）。見(jiàn)圖7、8。

圖7 各組血漿TNF-α含量變化（x±s）Figure7 Changesof plasmaTNF-αcontentineachgroup(x±s)

2.5 阿里紅多糖對(duì)大鼠MIRI血漿SOD和MDA的影響

模型組SOD活性較假手術(shù)組顯著降低，MDA含量明顯升高（P<0.01）；與模型組比較，DEX組和ALH給藥組大鼠SOD活性顯著升高，MDA含量顯著降低（P<0.05）；與ALH-L組比較，ALH-H組大鼠SOD活性顯著升高，MDA含量顯著降低（P<0.05）。見(jiàn)圖9、10。

圖9 各組血漿SOD活性變化（x±s，U/mL）Figure 9 Changes of plasma SOD activity in each group(x±s,U/mL）

2.6 阿里紅多糖對(duì)大鼠MIRI心肌缺血組織Bcl-2和caspase-3表達(dá)的影響

圖8 各組血漿IL-1β含量變化（x±s）Figure8 Changesof plasma IL-1βcontentineachgroup(x±s)

圖10 各組血漿MDA含量變化（x±s）Figure 10 Changes of plasma MDA content in each group(x±s)

與假手術(shù)組比較，各組caspase-3表達(dá)量顯著升高，而B(niǎo)cl-2表達(dá)量顯著降低（P<0.01）；與模型組相比較，DEX組和ALH給藥組caspase-3表達(dá)量顯著降低，Bcl-2表達(dá)量顯著升高（P<0.05）；與ALH-L組比較，ALH-H組caspase-3表達(dá)量顯著降低，Bcl-2表達(dá)量顯著升高（P<0.05）。見(jiàn)圖11。

圖11 各組心肌缺血組織Bcl-2和caspase-3的表達(dá)（x±s）Figure 11 Expression of Bcl-2 and caspase-3 in myocardial ischemia tissues of each group(x±s)

3 討論

目前，溶栓治療實(shí)現(xiàn)血流再通是臨床上防治急性心肌梗死的主要方案，但由此引起的再灌注損傷嚴(yán)重影響患者的預(yù)后，其發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明。有研究[2-5]表明其發(fā)病機(jī)制可能與氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、Ca2+超載、細(xì)胞凋亡和自噬等多方面相關(guān)。地塞米松是一種具有強(qiáng)大的抗炎、抗免疫和抗休克等多種藥理作用的甾體類糖皮質(zhì)激素，但如長(zhǎng)期大劑量使用，可引起較多的不良反應(yīng)。較多研究發(fā)現(xiàn)[10-12]地塞米松可改善MIRI相關(guān)癥狀，如心律失常、心臟梗死率等，故本研究選擇地塞米松作為陽(yáng)性對(duì)照藥。

阿里紅多糖具有較好的抗炎、抗氧化和抗凋亡活性。此外，其毒性較小。有研究[13]報(bào)道小鼠口服阿里紅多糖，其半數(shù)致死量(LD50)為6.31 g/kg。目前阿里紅多糖對(duì)MIRI的研究未見(jiàn)到相關(guān)報(bào)道，本研究發(fā)現(xiàn)阿里紅多糖具有確切的抗大鼠MIRI作用。心肌損傷或者壞死后，心肌會(huì)釋放CK和LDH入血，血清CK和LDH活性會(huì)顯著升高。故臨床上常采用CK、LDH活性來(lái)評(píng)價(jià)MIRI患者心肌細(xì)胞損傷的嚴(yán)重程度及愈后，而心臟梗死面積可作為心肌細(xì)胞損傷比較直觀的評(píng)價(jià)指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)模型組心肌梗死率、CK和LDH活性顯著升高，提示大鼠MIRI造模成功，給阿里紅多糖可有效保護(hù)缺血心肌，降低心肌梗死率和CK、LDH活性。TNF-α與IL-1β是兩種具有重要生物活性的細(xì)胞因子。兩者參與了炎癥所致心肌損傷的整個(gè)病理過(guò)程，其水平高低反映機(jī)體的炎癥水平。本研究發(fā)現(xiàn)阿里紅多糖可明顯減輕炎癥，呈劑量依賴性，提示阿里紅多糖可能通過(guò)抗炎作用減輕MIRI。SOD可清除機(jī)體H2O2和OH·等氧自由基，保護(hù)機(jī)體免受氧自由基的損害。MDA是機(jī)體膜脂過(guò)氧化過(guò)程中所產(chǎn)生的一種毒性醛類物質(zhì)，也是氧化應(yīng)激的標(biāo)志物之一。兩者的體內(nèi)水平可反映機(jī)體氧化應(yīng)激的嚴(yán)重程度。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明阿里紅多糖可明顯減輕氧化應(yīng)激損傷，呈劑量依賴性，提示阿里紅多糖可能通過(guò)抗氧化損傷作用減輕MIRI。caspase-3和Bcl-2是凋亡通路中的兩個(gè)重要的凋亡因子，參與細(xì)胞凋亡過(guò)程。caspase-3可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而B(niǎo)cl-2通過(guò)抑制cas‐pase-3激活、阻止細(xì)胞色素C釋放和降低細(xì)胞內(nèi)鈣濃度，從而抑制細(xì)胞的凋亡。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示阿里紅多糖可顯著降低缺血心肌的凋亡，提示阿里紅多糖可能通過(guò)抗凋亡作用減輕MIRI。

綜上所述，阿里紅多糖對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷具有較好的保護(hù)作用，抗氧化、抗炎和抗凋亡可能是其重要的作用機(jī)制。