謝蕓 1，吳海燕 1，劉雯君 1，胡巧紅

（1.廣東藥科大學(xué)藥學(xué)院，廣東廣州 510006；2.廣東省局部精準(zhǔn)藥物遞藥制劑工程技術(shù)研究中心，廣東廣州510006）

氟苯尼考（florfenicol，F(xiàn)F）又名氟甲砜霉素，系甲砜霉素的單氟衍生物，是美國(guó)Schering-Plough公司于1988年研發(fā)的新型動(dòng)物專用的第三代氯霉素類廣譜抗生素[1]。從藥效上看，氟苯尼考比氯霉素及甲砜霉素具有更高的抗菌活性[2]，能抑制或殺死耐氯霉素及甲砜霉素的細(xì)菌，且沒(méi)有潛在的致再生障礙性貧血的缺點(diǎn)，更沒(méi)有致畸、致癌和致突變的缺陷。目前，該藥在獸醫(yī)臨床上應(yīng)用非常廣泛，但是氟苯尼考水溶性較差，在水中溶解度為1.51 mg/mL[3]，嚴(yán)重影響氟苯尼考的生物利用度。因而，改善氟苯尼考的溶解性能是增加氟苯尼考生物利用度的關(guān)鍵[4]。

自微乳給藥系統(tǒng)（self-microemulsion drug deliv‐ery system，SMEDDS）是由藥物、油相、乳化劑和助乳化劑形成的均一澄清液體，口服遇到胃腸液后在胃腸道的蠕動(dòng)下自發(fā)分散形成O/W型、粒徑小于100 nm的乳劑[5-6]。SMEDDS口服后能在胃腸道快速、均勻分布，可作為難吸收、疏水性或易水解藥物的載體[7]。自發(fā)形成的乳滴有巨大的比表面積，可提高難溶性藥物的吸收[8]。此外，形成的微乳可保護(hù)藥物，避免在胃腸道中被酶解，增加藥物的穩(wěn)定性；微乳還可通過(guò)淋巴循環(huán)系統(tǒng)，克服藥物的首過(guò)效應(yīng)[9]。星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面優(yōu)化法是通過(guò)描繪效應(yīng)對(duì)考察因素的效應(yīng)面，從效應(yīng)面上選擇較佳的效應(yīng)區(qū)，從而回推出自變量取值范圍即最佳實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化法。該法具有實(shí)驗(yàn)次數(shù)少、精度高等特點(diǎn)，使用起來(lái)直觀、方便，常用于制劑工藝和處方篩選[10]。本文設(shè)計(jì)將氟苯尼考制成自微乳給藥系統(tǒng)（FFSMEDDS），通過(guò)偽三元相圖法結(jié)合星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化處方，以改善氟苯尼考的溶解度，達(dá)到速效、高效的目的。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 Infinity高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；Techcomp FA2004B電子分析天平（上海天美天平儀器有限公司）；VORTEX GENIUS 3渦旋混勻器（德國(guó)IKA集團(tuán)）；TGL-16G離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；TS-100B恒溫振蕩器[匡貝實(shí)業(yè)（上海）有限公司]；HPX-9162 MBE數(shù)顯不銹鋼電熱培養(yǎng)箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；NanoBrook 90Plus PALS高靈敏Zeta電位及粒度分析儀（美國(guó)布魯克海文儀器公司）；Multiskan FC酶標(biāo)儀（賽默飛世爾科技有限公司）；JEM-2100HR 200kV透射電子顯微鏡（日本電子株式會(huì)社）。

1.2 試藥

氟苯尼考對(duì)照品（四川維克奇生物科技有限公司，批號(hào)wkq19080802）；氟苯尼考原料藥（湖北龍翔藥業(yè)科技股份有限公司，批號(hào)180414）；大豆油（廣州白云山漢方現(xiàn)代藥業(yè)有限公司）；油酸（天津市致遠(yuǎn)化學(xué)有限公司）；檸檬酸三乙酯、辛癸酸甘油三酯、吐溫85、聚氧乙烯蓖麻油（EL）、維生素E琥珀酸酯（TPGS）均由上海麥克林生化科技有限公司提供；吐溫80、聚氧乙烯烷基酚醚（乳化劑OP-10）、聚乙二醇400（PEG400）、丙二醇均由天津市大茂化學(xué)試劑廠提供；二乙二醇乙醚（transcutol，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；甲醇、乙腈（色譜純，賽默飛世爾科技有限公司）；蒸餾水（屈臣氏集團(tuán)有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC法測(cè)定樣品中氟苯尼考的質(zhì)量濃度[11]

2.1.1 色譜條件 色譜柱：菲羅門Luna C18(2)（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（體積比40∶60）；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20μL；柱溫：室溫；檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)：224 nm。

2.1.2 氟苯尼考對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備 精密稱取50 mg氟苯尼考對(duì)照品，置于100 mL容量瓶中，用流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，制得500μg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.1.3 專屬性考察 取適量氟苯尼考對(duì)照品儲(chǔ)備液，經(jīng)適當(dāng)稀釋得到40μg/mL的對(duì)照品溶液，將對(duì)照品溶液與空白輔料溶液、氟苯尼考自微乳樣品溶液，按“2.1.1 ”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)行測(cè)定，考察方法的專屬性，結(jié)果見(jiàn)圖1?？梢?jiàn)，氟苯尼考在6 min左右出峰，空白輔料不干擾氟苯尼考的測(cè)定，方法專屬性良好。

圖1 氟苯尼考對(duì)照品（A）、氟苯尼考自微乳（B）和空白輔料（C）的HPLC圖Figure 1 The HPLC chromatographs of Florfenicol(A),FFSMEDDS(B)and excipients(C)

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別精密移取500μg/mL的氟苯尼考對(duì)照品儲(chǔ)備液，經(jīng)適當(dāng)稀釋得到5、10、20、40、60、80、100μg/mL的 對(duì) 照 品 溶 液。按“2.1.1 ”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以峰面積（y）對(duì)質(zhì)量濃度（x，μg/mL）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程y=42.484x+2.043 4（R2=1），表明在5～100μg/mL范圍內(nèi)線性良好。

2.1.5 精密度考察 日內(nèi)精密度：分別精密移取適量氟苯尼考對(duì)照品儲(chǔ)備液，用流動(dòng)相稀釋，得到10、40、80μg/mL的對(duì)照品溶液，按“2.1.1 ”項(xiàng)下色譜條件，在同一天內(nèi)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果計(jì)算得3種濃度溶液的RSD值分別為0.17%、0.20%、0.15%，符合規(guī)定。

日間精密度：取上述低、中、高3個(gè)不同濃度的對(duì)照品溶液，按“2.1.1 ”項(xiàng)下色譜條件，每天測(cè)定1次，連續(xù)測(cè)定3 d，結(jié)果計(jì)算得3種濃度溶液的RSD值分別為0.05%、0.03%、0.08%，符合規(guī)定。

2.1.6 穩(wěn)定性考察 分別精密移取適量對(duì)照品儲(chǔ)備液，用流動(dòng)相稀釋，得到10、40、80μg/mL的對(duì)照品溶液。分別在0、2、4、6、8、10 h時(shí)，按“2.1.1 ”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果計(jì)算得RSD值分別為0.10%、0.03%、0.02%，表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.7 回收率的測(cè)定 取一定量已知濃度的氟苯尼考自微乳樣品液，置于10 mL容量瓶中，加入適量氟苯尼考對(duì)照品儲(chǔ)備液，用流動(dòng)相稀釋定容，制得低、中、高3種濃度的溶液。按“2.1.1 ”項(xiàng)下色譜條件，每個(gè)濃度平行測(cè)定3次，結(jié)果見(jiàn)表1。可見(jiàn)，低、中、高3種濃度溶液的平均回收率分別為99.15%、100.73%、99.92%，RSD分 別 為0.20%、0.16%、0.07%，符合規(guī)定。

表1 氟苯尼考回收率測(cè)定結(jié)果Table 1 Recoveries of Florfenicol

2.2 溶解度的測(cè)定

分別取過(guò)量氟苯尼考原料藥，置于25 mL帶塞錐形瓶中，加入各輔料5 mL，渦旋混合5 min，于37℃、100 r/min氣浴恒溫振蕩器中振蕩72 h，使溶解達(dá)到平衡，將樣品以8 000 r/min離心10 min，取上清液過(guò)0.22μm濾膜，取適量濾液用流動(dòng)相稀釋后，按“2.1.1 ”項(xiàng)色譜條件測(cè)定，計(jì)算氟苯尼考質(zhì)量濃度即為藥物溶解度，結(jié)果見(jiàn)表2?？梢?jiàn)，氟苯尼考在油相檸檬酸三乙酯中的溶解度顯著大于大豆油、油酸和辛癸酸甘油三酯，在乳化劑吐溫80、OP-10、EL、TPGS中的溶解度優(yōu)于吐溫85，在助乳化劑transcutol、PEG400中的溶解度明顯大于丙二醇。

表2 氟苯尼考在各輔料中的溶解度Table 2 Solubility of Florfenicol in different excipients

2.3 油相、乳化劑和助乳化劑的篩選

2.3.1 油相與乳化劑相容性考察 稱取比例為4∶6的油相與乳化劑，混合均勻，取一定量混合物滴入37℃、100倍量的蒸餾水中，于轉(zhuǎn)速為100 r/min的磁力攪拌器中攪拌，記錄自乳化時(shí)間和溶液外觀性狀，篩選合適的油相和乳化劑。按文獻(xiàn)[12]方法，目測(cè)等級(jí)設(shè)定為：A級(jí)，乳化時(shí)間<1 min，溶液澄清或微泛藍(lán)光；B級(jí)，乳化時(shí)間<1 min，溶液略濁，呈藍(lán)白色；C級(jí)，乳化時(shí)間2 min內(nèi)，溶液較黏稠，呈亮白色不透明液體；D級(jí)，乳化時(shí)間>2 min，呈灰白色，略帶油狀；E級(jí)，難乳化，一直有油滴存在。

從表3可見(jiàn)，檸檬酸三乙酯與乳化劑OP-10及EL形成的微乳的評(píng)級(jí)較高，故選用檸檬酸三乙酯為油相、乳化劑OP-10和EL為乳化劑繼續(xù)篩選助乳化劑。

表3 油相與乳化劑配伍的評(píng)級(jí)結(jié)果Table 3 Grading results of compatibility of oil phases and emulsifiers

2.3.2 助乳化劑篩選 先將乳化劑OP-10、EL分別與助乳化劑按1∶1比例混合均勻，再與油相檸檬酸三乙酯以4∶6的比例混合均勻。取一定量混合物滴入37℃、100倍量的蒸餾水中，于轉(zhuǎn)速為100 r/min的磁力攪拌器中攪拌，觀察現(xiàn)象并評(píng)級(jí)（方法參見(jiàn)“2.3.1 ”項(xiàng)），結(jié)果見(jiàn)表4。

表4結(jié)果顯示，檸檬酸三乙酯為油相、乳化劑OP-10為乳化劑時(shí)，與助乳化劑transcutol、PEG400、1,2-丙二醇形成的微乳評(píng)級(jí)均較高。結(jié)合“2.2”項(xiàng)的溶解度測(cè)定結(jié)果，氟苯尼考在1,2-丙二醇中的溶解度較低，故確定以檸檬酸三乙酯為油相，以乳化劑OP-10、EL為乳化劑，以transcutol、PEG400為助乳化劑，進(jìn)行進(jìn)一步篩選。

表4 檸檬酸三乙酯為油相的乳化劑和助乳化劑配伍的評(píng)級(jí)結(jié)果Table 4 Grading results of compatibility of emulsifiers and coemulsifiers for triethyl citrate as oil phase

2.3.3 偽三元相圖法篩選乳化劑、助乳化劑 以檸檬酸三乙酯為油相，分別以乳化劑OP-10、EL為乳化劑，以transcutol、PEG400為助乳化劑，固定乳化劑與助乳化劑的比值（Km）為2，油相與混合乳化劑按1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1的比例混合，采用微板稀釋法繪制偽三元相圖。將油相和混合乳化劑以減幅為10μL，從200μL到0μL，水則以10μL的增幅從0μL到200μL，加入96孔板中。每個(gè)孔做3個(gè)復(fù)孔，每個(gè)比例以同樣步驟填充，將填充好的96孔板置于孔板振蕩器上振搖30 min使充分混勻，然后用多功能酶標(biāo)儀于650 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度[13]。以吸光度突變的點(diǎn)為臨界點(diǎn)，采用Origin 8.0軟件繪制偽三元相圖確定微乳區(qū)域，結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2可知，當(dāng)油相為檸檬酸三乙酯、乳化劑為乳化劑OP-10、助乳化劑為transcutol時(shí)，形成的自微乳區(qū)域最大，故選擇乳化劑OP-10為乳化劑、trans‐cutol為助乳化劑，繼續(xù)進(jìn)行處方優(yōu)化。

圖2 檸檬酸三乙酯為油相的乳化劑和助乳化劑的偽三元相圖Figure 2 Pseudo ternary phase diagrams of emulsifiers and coemulsifiers for triethyl citrate as oil phase

2.4 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面優(yōu)化法優(yōu)化FF-SMEDDS處方

采用二因素、五水平的星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面優(yōu)化法對(duì)FF-SMEDDS的處方進(jìn)行優(yōu)化。選擇對(duì)自微乳形成有顯著影響的2個(gè)因素，即油相檸檬酸三乙酯的質(zhì)量百分比（X1）、乳化劑OP-10與助乳化劑transcu‐tol的質(zhì)量比Km（X2）。根據(jù)偽三元相圖中的自微乳區(qū)域范圍，以溶解度（Y）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定各因素的取值范圍，油相的質(zhì)量百分比（X1）的取值范圍為10%～80%，乳化劑與助乳化劑的質(zhì)量比Km（X2）的取值范圍為1～9，因素水平見(jiàn)表5。

表5 因素與水平Table 5 Factors and levels

按表6中處方，精密稱取各輔料共6 g于50 mL帶塞錐形瓶中，渦旋混勻5 min，加入過(guò)量氟苯尼考原料藥，渦旋混勻5 min。然后置于溫度為37℃、轉(zhuǎn)速為100 r/min恒溫振蕩器中，振蕩72 h，使溶解達(dá)到平衡，將樣品以8 000 r/min離心10 min，取上清液過(guò)0.22μm濾膜，取一定量濾液用流動(dòng)相適當(dāng)稀釋后，按“2.1.1 ”項(xiàng)色譜條件測(cè)定氟苯尼考質(zhì)量濃度，即為溶解度。

表6 星點(diǎn)設(shè)計(jì)優(yōu)化FF-SMEDDS的結(jié)果Table 6 Results of FF-SMEDDSoptimized by central compositedesign

采用Design-Expert 11軟件，以溶解度作為因變量，分別對(duì)各因素（自變量）各水平進(jìn)行二項(xiàng)式擬合，得到方程式：Y=57.970 00?6.472 98X1?5.051 03X2+1.810 00X1X2?1.465 62X12+5.501 87X22，方差分析結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 方差分析結(jié)果Table 7 Analysis results of variance

以上述數(shù)學(xué)模型為基礎(chǔ)，描繪三維因變量，繪制3D效應(yīng)面圖，見(jiàn)圖3。由此綜合分析獲得優(yōu)化處方為：檸檬酸三乙酯31.78%、乳化劑OP-10 34.63%、transcutol 33.59%。

2.5 處方驗(yàn)證

根據(jù)上述得出的優(yōu)化處方，制備3批FFSMEDDS，按“2.4”項(xiàng)下“精密稱取各輔料共6 g于50 mL帶塞錐形瓶中，……，即為溶解度”操作，測(cè)得藥物溶解度為（80.39±0.60）mg/mL（n=3），與預(yù)測(cè)值（80.28 mg/mL）作比較，按公式：偏差（%）=|預(yù)測(cè)值-真實(shí)值|/預(yù)測(cè)值×100%，計(jì)算得偏差為0.14%，表明星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面優(yōu)化法具有較好的預(yù)測(cè)效果。此外，測(cè)得上述3批FF-SMEDDS的微乳粒徑為（9.34±0.36）nm，PDI為0.111±0.034。

圖3FF-SMEDDS的溶解度3D效應(yīng)面圖Figure3 Theresponsesurfacegraph(3D)ofthesolubility ofFF-SMEDDS

2.6FF-SMEDDS的制備及質(zhì)量評(píng)價(jià)

2.6.1 FF-SMEDDS的制備 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面優(yōu)化法中測(cè)定的為藥物飽和濃度，為避免自微乳給藥系統(tǒng)中藥物處于飽和狀態(tài)時(shí)易受環(huán)境影響而導(dǎo)致藥物析出的問(wèn)題，所以最終制備藥物濃度低于飽和濃度的FF-SMEDDS。

按“2.4”優(yōu)化后的處方制備3批FF-SMEDDS：精密稱取各輔料共30g于50mL帶塞錐形瓶中，渦旋混勻5min，加入1.5g氟苯尼考原料藥，渦旋混勻10min得到溶液。

2.6.2 外觀形態(tài) FF-SMEDDS為無(wú)色澄清透明的黏稠狀液體，加水自乳化后形成無(wú)色、均一透明的微乳，有乳光。電鏡下觀察到自乳化形成的微乳呈類球形，見(jiàn)圖4。

2.6.3 粒徑及分布 取適量FF-SMEDDS，用蒸餾水稀釋100倍，使自乳化形成微乳，測(cè)定微乳的粒徑及分布。形成的微乳粒徑分別為（8.88±0.05）nm（PDI=0.139±0.018）、（9.18±0.04）nm（PDI=0.085±0.009）、（9.01±0.03）nm（PDI=0.085±0.008）。

2.6.4 藥物質(zhì)量濃度的測(cè)定 取適量FF-SMEDDS，用流動(dòng)相稀釋后，按“2.1.1 ”項(xiàng)色譜條件，測(cè)得3批FF-SMEDDS的藥物質(zhì)量濃度分別為48.35、48.08、48.14mg/mL。

2.6.5 離心穩(wěn)定性 取適量FF-SMEDDS，加水稀釋100倍，使自乳化形成微乳，在3000r/min轉(zhuǎn)速下離心30min后，觀察外觀形態(tài)，可見(jiàn)仍為無(wú)色、均一透明的微乳液，無(wú)沉淀出現(xiàn)。

圖4FF-SMEDDS自乳化形成微乳的透射電鏡照片F(xiàn)igure4 Transmissionelectronmicrographofthemicro‐emulsionformedbyFF-SMEDDSindistilledwater

2.6.6 穩(wěn)定性考察 將FF-SMEDDS分別置于4、30℃下，在第0、5、10、15、30d取出一定量樣品，用流動(dòng)相稀釋后，按“2.1.1 ”項(xiàng)色譜條件測(cè)定藥物濃度。另取適量樣品，用蒸餾水稀釋100倍，使自乳化形成微乳，測(cè)定粒徑及分布，結(jié)果見(jiàn)表8。結(jié)果顯示，F(xiàn)F-SMEDDS在4、30℃條件下放置30d，藥物濃度的變化幅度均小于5%，自乳化后的微乳粒徑在8.64～9.54nm之間，均無(wú)明顯變化，說(shuō)明體系在4℃和30℃條件下穩(wěn)定。

表8 FF-SMEDDS穩(wěn)定性考察結(jié)果Table 8 Stability of FF-SMEDDS

3討論

通常，自微乳油相的質(zhì)量百分比越大，對(duì)藥物的溶解能力越強(qiáng)，但油相的用量對(duì)自微乳體系的穩(wěn)定性有較大的影響[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，氟苯尼考在檸檬酸三乙酯中的溶解度顯著大于其他油相。這是因?yàn)榕c油酸、大豆油相比，辛癸酸甘油三酯、檸檬酸三乙酯的碳鏈更短，極性更大；與辛癸酸甘油三酯相比，檸檬酸三乙酯碳數(shù)更少，且支鏈更短，因此，推測(cè)檸檬酸三乙酯的極性最大，而氟苯尼考結(jié)構(gòu)中含有鹵素及磺酸基，極性與其最為接近，所以氟苯尼考能較好地溶解在檸檬酸三乙酯中。相容性考察發(fā)現(xiàn)，檸檬酸三乙酯與乳化劑形成的微乳的評(píng)級(jí)較高，故選用檸檬酸三乙酯為油相。乳化劑的種類及用量影響微乳的形成和穩(wěn)定性；助乳化劑則主要起增加藥物溶解度、調(diào)節(jié)親水親油平衡值（hydro‐phile-lipophilebalance，HLB）的作用，并能與乳化劑形成復(fù)合界面膜，促進(jìn)微乳形成且增加其穩(wěn)定性[15]。O/W型自微乳給藥系統(tǒng)一般采用穩(wěn)定性高、毒性低、HLB值為8～18的非離子型表面活性劑。本研究所選的乳化劑均為HLB值在該范圍內(nèi)的非離子表面活性劑，乳化劑OP-10與transcutol（2∶1）混合后的HLB值為12.22，與油相檸檬酸三乙酯所需的HLB值12.3最接近，因此該混合乳化劑的乳化效果較好，且與偽三元相圖篩選結(jié)果相符，故最終確定處方組成為檸檬酸三乙酯、乳化劑OP-10和transcutol。

一般情況下，自微乳的星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面優(yōu)化選擇粒徑及溶解度作為考察指標(biāo)。本研究測(cè)得各處方制備的微乳粒徑介于7.64～11.65 nm之間。不同處方自微乳由于油相、乳化劑、助乳化劑的比例不同，形成的微乳粒徑存在差異，但是各處方的微乳粒徑均已很小，因此，粒徑不作為處方優(yōu)化的考察指標(biāo)。此外，實(shí)驗(yàn)中還測(cè)定了各處方制備的微乳的Zeta電位，在?12.21～0.018 mV范圍，可見(jiàn)處方中油相、乳化劑、助乳化劑的比例不同，微乳的Zeta電位存在一定差異。自微乳給藥系統(tǒng)的質(zhì)量評(píng)價(jià)不僅包括粒徑及分布、藥物質(zhì)量濃度，也應(yīng)包括穩(wěn)定性考察。因此，本文對(duì)FF-SMEDDS進(jìn)行了離心穩(wěn)定性以及不同溫度條件下的穩(wěn)定性考察，結(jié)果顯示，體系具有良好的離心穩(wěn)定性，且在4、30℃條件下30 d內(nèi)均保持穩(wěn)定。

綜上所述，將氟苯尼考設(shè)計(jì)成自微乳給藥系統(tǒng)是可行的，可制得藥物質(zhì)量濃度較高、粒徑分布均勻、體系穩(wěn)定的氟苯尼考自微乳給藥系統(tǒng)。