謝彩鳳，何志成,伍春嫻，蔣贛，魏丹

（廣東藥科大學(xué)醫(yī)藥化工學(xué)院/廣東省化妝品工程技術(shù)中心，廣東中山 528458）

乳清分離蛋白（Whey Protein Isolate，WPI）不僅具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和生物活性，而且具有良好的凝膠特性，常被用于食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域[1-2]，WPI的凝膠受離子濃度、電解質(zhì)類型、溫度、pH等因素的影響[3-4]。前期，本課題組以CaCl2做電解質(zhì)，研究了WPI常溫下在慢速團(tuán)聚（reaction limited aggrega‐tion，RLCA）條件下的團(tuán)聚動(dòng)力學(xué)和團(tuán)聚體結(jié)構(gòu)[5]。本研究選用另一種含有單價(jià)陽(yáng)離子Na+的電解質(zhì)，用廣角光散射儀的動(dòng)態(tài)光散射（dynamic light scat‐tering，DLS）方法和小角光散射儀的靜態(tài)光散射（Static Light Scattering，SLS）方法，研究不同電解質(zhì)類型對(duì)WPI的團(tuán)聚動(dòng)力學(xué)和團(tuán)聚體結(jié)構(gòu)的影響，擬為蛋白質(zhì)的分析檢測(cè)以及蛋白質(zhì)團(tuán)聚體在多孔材料和藥物緩釋領(lǐng)域的應(yīng)用提供方法指導(dǎo)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

針頭式過(guò)濾器（25 mm GD/X，濾紙孔徑0.45μm，英國(guó)Whatman公司）；廣角光散射儀、BI-200SM角度測(cè)量器（美國(guó)Brookhaven Instruments）配以Ventus LP532型激光發(fā)射器（英國(guó)Laser Quantum），入射光波長(zhǎng)為λ1=532 nm，測(cè)角范圍20～145°；Mastersizer 2000小角光散射儀（英國(guó)Malvern），入射光波長(zhǎng)為λ2=633 nm，測(cè)角范圍0.02～40°。

1.2 試劑

WPI粉末（BiPro，JE345-3-420，Davisco Foods International Inc.，美國(guó)明尼蘇達(dá)）；疊氮化鈉（NaN3）、NaOH（固體）、鹽酸溶液（0.1 mol/L）、4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖溶液（HEPES）、NaCl（固態(tài)）均為分析純，由Sigma-Aldrich公司提供；超純水（自制）。

2 方法

2.1 WPI的熱變性制備WPI-PAs及性能測(cè)量

WPI熱變性制備乳清分離蛋白初級(jí)團(tuán)聚體（WPI-PAs）的方法參見(jiàn)前期的工作[5]，最終得到Cp=50 g/L的膠體分散體，NaN3的最終濃度為3.08×10?3mol/L。配置好的分散體儲(chǔ)存于溫度為4℃左右的冰箱中備用。

2.2 用NaCl誘導(dǎo)團(tuán)聚實(shí)驗(yàn)及分析檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，先用超純水對(duì)WPI-PAs膠體分散體和NaCl溶液進(jìn)行多次稀釋，以免膠體溶液和電解質(zhì)溶液濃度太高導(dǎo)致團(tuán)聚實(shí)驗(yàn)過(guò)程中局部混合不均而出現(xiàn)大團(tuán)聚體。然后把稀釋的NaCl溶液倒入膠體分散體中達(dá)到設(shè)定的電解質(zhì)濃度Cs（mol/L）、膠粒濃度（固定Cp=2.00 g/L）和設(shè)定的pH7.0。平衡幾秒后，將溶液分成兩等份，分別裝入2只WALS專用測(cè)試瓶，一瓶置于WALS測(cè)試槽（恒溫25℃）進(jìn)行DLS測(cè)量，測(cè)量團(tuán)聚體的平均水力學(xué)半徑〈Rh〉與時(shí)間的關(guān)系；另一瓶置于與測(cè)試槽溫度相同的恒溫水槽中保持恒溫，非常緩慢地輕輕來(lái)回顛倒，每20～30 min兩瓶交換一次測(cè)量，以避免生成的大團(tuán)聚體在長(zhǎng)時(shí)間靜止?fàn)顟B(tài)下沉淀到反應(yīng)器底部?！碦h〉通過(guò)Stockes-Einstein方程計(jì)算[6]：

SLS測(cè)試的制樣方法同DLS，測(cè)試時(shí)用注射器迅速但輕輕地把團(tuán)聚體系注入SALS測(cè)試槽，在線檢測(cè)膠粒的團(tuán)聚動(dòng)力學(xué)過(guò)程。SLS所測(cè)得的團(tuán)聚體的光散射強(qiáng)度I(q)的表達(dá)式如下[6-7]：

式中：q是基于散射角θ計(jì)算得到的波矢量；I(0)是q=0的散射強(qiáng)度；P(q)是初級(jí)團(tuán)聚體WPI-PAs的形狀因子，由直接測(cè)量濃度為2.00 g/L的WPI-PAs分散體得到；〈S(q)〉是電解質(zhì)誘導(dǎo)團(tuán)聚得到的團(tuán)聚體的歸一化形狀因子，對(duì)初級(jí)團(tuán)聚體可以認(rèn)為〈S(q)〉=1；q是基于散射角θ計(jì)算得到的波矢量：

式中：n0是分散介質(zhì)水的折光指數(shù)。

團(tuán)聚體的平均旋轉(zhuǎn)半徑〈Rg〉*和分形維數(shù)Df，可以從〈S(q)〉得到[6,8]:

由方程（4）和（5）所得到的平均旋轉(zhuǎn)半徑只有在團(tuán)聚體足夠大時(shí)才正確，對(duì)小團(tuán)聚體，如在團(tuán)聚過(guò)程初始階段生成的團(tuán)聚體，初級(jí)團(tuán)聚體對(duì)旋轉(zhuǎn)半徑的貢獻(xiàn)需要考慮進(jìn)來(lái)：

式中：Rg,0的測(cè)試方法見(jiàn)文獻(xiàn)，測(cè)量值為70.54 nm。

3 結(jié)果與討論

3.1 廣角光散射儀的DLS測(cè)試結(jié)果

圖1是用DLS測(cè)得的WPI-PAs在不同Cs下各體系的平均水力學(xué)半徑〈Rh〉隨時(shí)間的變化規(guī)律。從圖1可見(jiàn)，不同Cs下，〈Rh〉均隨時(shí)間的增加而增長(zhǎng)，〈Rh〉是直接與粒子的幾何形狀有關(guān)的尺寸，〈Rh〉增大表明WPI-PAs發(fā)生了團(tuán)聚，NaCl的加入對(duì)體系的穩(wěn)定性起著一定的破壞作用。同時(shí)可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Cs為3.20 mol/L時(shí)，曲線增長(zhǎng)非常緩慢，隨著Cs增大，曲線逐漸變得陡峭，〈Rh〉的增長(zhǎng)速度逐漸加大，Cs=5.10 mol/L時(shí)，曲線最陡，表明此時(shí)的團(tuán)聚速度最快，這是因?yàn)殡娊赓|(zhì)中的陽(yáng)離子Na+屏蔽了蛋白質(zhì)表面陰離子形成的雙電層，Na+濃度越大，雙電層被屏蔽的越多，團(tuán)聚速度更快。

圖1 不同NaCl濃度下WPI-PAs團(tuán)聚體平均水力學(xué)半徑（〈Rh〉）隨時(shí)間（t）的變化趨勢(shì)Figure 1 The hydrodynamic radius,〈Rh〉,as a function of time,t,at the same WPI-PAs concentration but different NaCl concentrations

為了進(jìn)一步研究WPI-PAs的團(tuán)聚規(guī)律和團(tuán)聚體結(jié)構(gòu)，引入質(zhì)量守恒方程（PBE，population balance equation）擬合〈Rh〉-t曲線，膠粒團(tuán)聚過(guò)程中團(tuán)聚體質(zhì)量分布可以用PBE模型表述[6,9-11]：

式中：Ni(t)是質(zhì)量為i的團(tuán)聚體在時(shí)間t的質(zhì)量濃度；Ki,j是質(zhì)量為i和j的2個(gè)團(tuán)聚體之間的團(tuán)聚速率常數(shù)，定義如下：

式中：KB=8kT/3μ是Smoluchoeski速率常數(shù)（k是波爾茲曼常數(shù)，單位是J/K，T和μ分別是分散體的溫度和動(dòng)力學(xué)黏度，單位分別為K和Pa·s）；W是Fuchs穩(wěn)定性常數(shù)，典型DLCA團(tuán)聚過(guò)程其值小于5，而對(duì)RLCA團(tuán)聚其值大于5，W值越大表明團(tuán)聚速度越慢；乘積項(xiàng)(ij)λ表示在RLCA團(tuán)聚過(guò)程中，團(tuán)聚體的反應(yīng)速率隨團(tuán)聚體質(zhì)量的增加而增大，指數(shù)λ值的范圍一般是0～0.50，DLCA團(tuán)聚的λ=0。公式(7)和(8)的解能給出整個(gè)團(tuán)聚過(guò)程中不斷長(zhǎng)大的所有團(tuán)聚體的質(zhì)量分布（Ni，i=1,2，……），從Ni就可以計(jì)算出團(tuán)聚體的平均水力學(xué)半徑〈Rh〉和旋轉(zhuǎn)半徑〈Rg〉的值：

式中：Rh,i和Rg,i是質(zhì)量為i的單個(gè)團(tuán)聚體的水力學(xué)半徑和旋轉(zhuǎn)半徑，典型的無(wú)融合膠體在DLCA和RLCA條件下Df值分別在1.75和2.10左右，很多研究結(jié)果都證明了這個(gè)結(jié)論[6,8]。圖1中的連續(xù)曲線是用上述方法得到的各濃度下〈Rh〉的擬合結(jié)果，相應(yīng)的擬合參數(shù)見(jiàn)表1?？梢?jiàn)，各個(gè)濃度下的擬合曲線都能較好地與實(shí)驗(yàn)值吻合；W值隨Cs的增加而減小，說(shuō)明隨團(tuán)聚速度隨電解質(zhì)濃度增加而加快，因?yàn)殡娊赓|(zhì)濃度越大，對(duì)雙電層的屏蔽也越有效。得到的Df、W和λ的值均與典型的RLCA條件下不融合膠粒的經(jīng)驗(yàn)值相符合，說(shuō)明在NaCl作用下WPIPAs的所有團(tuán)聚均在慢速團(tuán)聚條件下進(jìn)行，即使在接近常溫NaCl飽和濃度（NaCl常溫下的飽和濃度為6.02 mol/L，由于實(shí)驗(yàn)時(shí)需要將配制的NaCl溶液與膠體分散體混合稀釋，所以團(tuán)聚體系最終能達(dá)到的NaCl為5.10 mol/L）時(shí)W值仍然很大，是速度較慢的慢速團(tuán)聚。這與前期用CaCl2誘導(dǎo)團(tuán)聚在較低濃度出現(xiàn)臨界聚沉值[5]（ccc，critical coagulation con‐centration）的現(xiàn)象不同，這是因?yàn)镃aCl2溶液中含有二價(jià)陽(yáng)離子Ca2+，其他條件都相同時(shí)，ccc值與反離子價(jià)態(tài)的6次方成反比，Ca2+比Na+能更加有效地屏蔽雙電層[12]：

表1 不同NaCl濃度下用PBE方程對(duì)WPI-PAs的〈Rh〉-t曲線擬合得到的擬合參數(shù)Table 1 The fitting parameter from the PBE simulations of〈Rh〉-t curve of WPI-PAs under different NaCl concentra‐tions

式中：C是與電解質(zhì)的陰離子和陽(yáng)離子性質(zhì)有關(guān)的常數(shù)；D是介質(zhì)的介電常數(shù)；T為絕對(duì)溫度（K）；A1是范德華引力常數(shù)；e是單位電荷。

用2種電解質(zhì)得到的團(tuán)聚體在RLCA條件下Df值均為2.10左右，說(shuō)明用2種電解質(zhì)得到的團(tuán)聚體的結(jié)構(gòu)是相似的。分形體一個(gè)非常有趣的性質(zhì)就是自相似性，即同一物質(zhì)的分形體在不同尺寸時(shí)的形狀是非常相似的[13]。正是因?yàn)檫@種自相似性，可以用分形維數(shù)Df表征分形體的結(jié)構(gòu)，它代表了分形體中組成成分的緊密程度，Df的值越大說(shuō)明所得到的團(tuán)聚體的結(jié)構(gòu)越致密。同一種物質(zhì)即使采用兩種不同的電解質(zhì)誘導(dǎo)團(tuán)聚，在相同的團(tuán)聚機(jī)理下得到的團(tuán)聚體的形狀也是相似的，這更進(jìn)一步證明了擬合結(jié)果的可靠性。由于用CaCl2誘導(dǎo)團(tuán)聚會(huì)出現(xiàn)ccc，當(dāng)CaCl2的濃度高于ccc時(shí)，團(tuán)聚會(huì)在DLCA下進(jìn)行，這時(shí)形成的團(tuán)聚體的Df值一般在1.75左右，說(shuō)明形成了疏松的團(tuán)聚體[5]，而本文中在所有NaCl濃度下得到的都是結(jié)構(gòu)致密的團(tuán)聚體。

3.2 小角光散射儀的SLS測(cè)試結(jié)果

為了進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，選擇Cs=4.50 mol/L的濃度再次誘導(dǎo)團(tuán)聚并且用小角光散射儀的SLS對(duì)團(tuán)聚過(guò)程進(jìn)行測(cè)試。圖2（a）和（b）分別是WPI-PAs團(tuán)聚體的光散射強(qiáng)度I(q)曲線隨時(shí)間的演化曲線和相應(yīng)的不同時(shí)間的團(tuán)聚體的歸一化平均結(jié)構(gòu)因子〈S(q)〉與歸一化的波矢量q×〈Rg〉的函數(shù)關(guān)系圖。圖2（a）中，在q<2×10?4處不同時(shí)間的曲線幾乎重疊，但在q>2×10?4處，I(q)曲線隨著團(tuán)聚過(guò)程的進(jìn)行逐漸上揚(yáng)，I(q)的值隨團(tuán)聚過(guò)程的進(jìn)行顯著增大，這表明團(tuán)聚體隨著凝膠過(guò)程的進(jìn)行逐漸長(zhǎng)大，這種緩慢、漸進(jìn)的團(tuán)聚體增長(zhǎng)表明WPI-PAs的團(tuán)聚是在RLCA下進(jìn)行的。對(duì)具有分形結(jié)構(gòu)的團(tuán)聚體，如果團(tuán)聚體結(jié)構(gòu)相同，不同時(shí)間的團(tuán)聚體歸一化的平均結(jié)構(gòu)因子〈S(q)〉?q×〈Rg〉曲線將會(huì)重疊在一起，而本文得到的圖2（b）中不同時(shí)間的〈S(q)〉?q×〈Rg〉曲線確實(shí)重疊在一起，說(shuō)明團(tuán)聚過(guò)程中的團(tuán)聚體符合分形結(jié)構(gòu)的規(guī)律。

圖2 WPI-PAs團(tuán)聚體的光散射強(qiáng)度曲線隨時(shí)間的演化曲線（a）與團(tuán)聚體的歸一化平均結(jié)構(gòu)因子與歸一化的波矢量的函數(shù)關(guān)系（b）Figure 2 Typical time evolution of the scattered intensity curves,along the aggregation of the WPI-PAs(a)and the normalized aver‐age structure factor of clusters,at various aggregation times,as a function of normalized wave vector,corresponding to the ag‐gregation systemin(b)

從I(q)?q和〈S(q)〉?q×〈Rg〉曲線得到Df的值，曲線的冪指數(shù)區(qū)域必須至少跨越2個(gè)數(shù)量級(jí)[8,12]，即團(tuán)聚體含有50個(gè)以上的初級(jí)粒子或者〈Rg〉/Rh,0>7且尺寸分布較為單一[14]，團(tuán)聚體的結(jié)構(gòu)因子才能夠得到一個(gè)正確的符合冪指數(shù)規(guī)律的區(qū)間。而本文中由于膠粒團(tuán)聚速度較慢，曲線的冪指數(shù)區(qū)域沒(méi)有跨越兩個(gè)數(shù)量級(jí)，無(wú)法通過(guò)此方法求出Df，但是可以根據(jù)方程（12）從I（0）對(duì)〈Rg〉/Rh,0曲線圖求得Df，因?yàn)樾F(tuán)聚體一般〈Rg〉/Rh,0>3時(shí)，I（0）對(duì)〈Rg〉/Rh,0曲線已經(jīng)符合分形結(jié)構(gòu)的特征[15]：

式中：Rh,0=29.3 nm，是初級(jí)膠粒的水力學(xué)半徑，測(cè)量方法同〈Rh〉。從公式（12）可以看出，對(duì)曲線橫、縱坐標(biāo)取對(duì)數(shù)，得到的直線斜率就是Df的值。

圖3（a）是用公式（12）計(jì)算得到q=0處的散射光強(qiáng)度I（0）與〈Rg〉/Rh,0之間關(guān)系的時(shí)間演化曲線，得到的Df值為2.12，與前面用PBE方程擬合〈Rh〉-t曲線得到的值一致。同時(shí)，將得到的Df值和前面擬合出的W值代入到PBE方程中，利用公式（9）和（10）分別計(jì)算不同時(shí)間團(tuán)聚體的平均水力學(xué)半徑〈Rh〉和平均旋轉(zhuǎn)半徑〈Rg〉的值[圖3（b）中連續(xù)曲線]擬合圖3（b）中的實(shí)驗(yàn)值（點(diǎn)線），可以看到擬合值和實(shí)驗(yàn)值非常吻合，得到的λ=0.23，與前文的擬合值非常接近，進(jìn)一步驗(yàn)證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

圖3 在q=0處的散射光強(qiáng)度與〈Rg〉/Rh,0之間關(guān)系的時(shí)間演化曲線（a）與〈Rg〉隨時(shí)間的變化規(guī)律的PBE擬合結(jié)果（實(shí)線曲線）與實(shí)驗(yàn)結(jié)果（空點(diǎn)點(diǎn)線）的比較（b）Figure 3 Time evolution of the intensity at q=0,I(0),as a function of the corresponding〈Rg〉/Rh,0(a)and PBE simulations(solid line)of the time evolutions of〈Rg〉compared with experiments(open symbols)(b)

4 結(jié)論

本研究用廣角光散射儀的動(dòng)態(tài)光散射（DLS）和小角光散射儀的靜態(tài)光散射（SLS）方法，分析WPIPAs在NaCl作用下的團(tuán)聚動(dòng)力學(xué)和團(tuán)聚體結(jié)構(gòu)。DLS研究發(fā)現(xiàn)，WPI-PAs的團(tuán)聚速度隨時(shí)間和NaCl濃度的增加而增大，質(zhì)量守恒方程（PBE）擬合發(fā)現(xiàn)，在所有NaCl濃度下的團(tuán)聚都是在慢速團(tuán)聚下進(jìn)行，即使在接近飽和NaCl濃度時(shí)仍沒(méi)有出現(xiàn)臨界聚沉值。擬合得到的Df值全部在2.10左右，說(shuō)明形成了結(jié)構(gòu)致密的團(tuán)聚體。選用其中一個(gè)NaCl濃度進(jìn)一步采用SLS分析發(fā)現(xiàn)，團(tuán)聚體的分形維數(shù)Df的值確實(shí)在2.10左右，而且將DLS擬合得到的參數(shù)和SLS實(shí)驗(yàn)得到的Df值代入到PBE方程中重新計(jì)算得到的〈Rh〉和〈Rg〉的計(jì)算值與實(shí)驗(yàn)值能夠較好吻合，驗(yàn)證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。本文方法能為蛋白質(zhì)的分析檢測(cè)以及蛋白質(zhì)團(tuán)聚體在多孔材料和藥物緩釋領(lǐng)域的應(yīng)用提供可靠的指導(dǎo)。