舒兵 1，鄧南翔 1，鄭滔 1，謝曉玲 1，車通

（廣東藥科大學 1.藥學院；2.新藥研究中心，廣東廣州 510006）

G-四鏈體是由DNA鏈上連續(xù)富鳥嘌呤（G）序列形成的一種特殊的核酸二級結(jié)構(gòu)[1-2]。越來越多的證據(jù)表明G-四鏈體參與多種重要的生物學過程，如端粒末端保護，DNA復制、轉(zhuǎn)錄和翻譯等，并且在細胞增殖、凋亡與衰老，腫瘤的發(fā)生及發(fā)展過程中都扮演著重要的調(diào)控角色[3-5]。然而，現(xiàn)階段對G-四鏈體的研究只涉及到較少的基因序列，仍有大量G-四鏈體潛在形成序列有待證明。因此，開發(fā)能夠?qū)-四鏈體結(jié)構(gòu)進行快速確證的方法和工具顯得尤為重要[6]。

多取代咪唑作為發(fā)色團主要應(yīng)用于有機光電二極管、有機光電管、半導體等領(lǐng)域[7-10]。2011年，Chen等[11]通過藥效團模型建立以及虛擬篩選，發(fā)現(xiàn)三芳基取代咪唑類化合物TSIZ01（圖1）可作為新型G-四鏈體配體，相互作用研究表明，TSIZ01對G-四鏈體的結(jié)合力是雙鏈DNA的8.7倍。后續(xù)經(jīng)過進一步修飾，發(fā)現(xiàn)引入咔唑、香豆素等熒光基團，可以增強咪唑類化合物對G-四鏈體的熒光識別作用[12-13]。然而，盡管有部分G-四鏈體熒光可用于細胞成像，但由于體內(nèi)存在大量的雙鏈DNA和RNA分子，探針檢測到的信號是否為G-四鏈體也不確定。因此，開發(fā)能選擇性識別G-四鏈體的熒光探針并應(yīng)用于細胞內(nèi)檢測具有重大的意義。

本研究在前期文獻[11-13]的工作基礎(chǔ)上，通過引入N,N-二甲基苯胺熒光團，同時在咪唑的1位引入較大的芳香平面結(jié)構(gòu)，增加化合物與G-四鏈體的π-π堆積作用，設(shè)計得到了1,2,4,5-四取代咪唑5a（圖1）。通過Debus-Radziszewski咪唑合成反應(yīng)一鍋法合成得到了化合物5a（圖2），并對G-四鏈體的識別作用進行了研究，以期為新型靶向G-四鏈體熒光探針的發(fā)現(xiàn)提供依據(jù)。

圖1 TSIZ01和5a的結(jié)構(gòu)Figure 1 Structure of TSIZ01 and 5a

圖2 5a的合成路線Figure 2 The synthesis route of 5a

1 儀器與試劑

1.1 儀器

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（河南鞏義宇華有限公司）；N-1300V-W旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（東京理化-上海艾朗儀器有限公司）；ME104電子天平、SHB-III循環(huán)水式多用真空泵（鞏義市科瑞儀器有限公司）；Advance Bruker 400M超導核磁共振波譜儀（瑞士BRUKER公司）；Thermo超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（賽默飛世爾科技公司）。

1.2 試劑

2,2-雙（4-甲基哌嗪基苯基）乙二酮、醋酸銨、4-二甲氨基苯甲醛、4-甲氧基苯胺等購自上海泰坦科技股份有限公司，其余所用的常用試劑如NaOH、醋酸、EA等均為化學純。

2 方法與結(jié)果

2.1 化合物5a的合成

稱取2,2-雙（4-甲基哌嗪基苯基）乙二酮（1，0.5 g，1.23 mmol）于反應(yīng)瓶中，加入4-二甲胺基苯甲醛（2，220.1 mg，1.47 mmol）、4-甲氧基苯胺（3，302.6 mg，2.46 mmol）和醋酸銨（4，947 mg，12.3 mmol），加入10 mL冰醋酸，反應(yīng)體系于120℃油浴中加熱8 h。反應(yīng)畢，放冷至室溫，加入50 mL乙酸乙酯和50 mL冰水攪拌，加飽和碳酸鈉溶液調(diào)pH值為9～10，分液，水層加10 mL乙酸乙酯萃取3次，合并有機層，飽和食鹽水洗3次，無水硫酸鈉干燥，旋干，硅膠柱層析，共得到終產(chǎn)物5a，339.2 mg，產(chǎn)率43%，mp:221.3～223.5oC。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ：7.53(d,J=8.8 Hz,2H),7.30(d,J=9.0 Hz,2H),7.02～6.95(m,4H),6.83(d,J=8.9 Hz,2H),6.80～6.73(m,4H),6.57(d,J=9.0 Hz,2H),3.80(s,3H),3.27～3.21(m,8H),2.94(s,6H),2.64～2.58(m,8H),2.39(s,3H),2.38(s,3H)。13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ:158.71,150.00,149.90,149.43,147.21,137.28,131.96,130.71,129.77,129.65,129.35,128.09,126.74,121.98,118.82,115.66,115.18,114.07,111.59,55.35,55.15,55.11,48.99,48.41,46.86,46.15,40.27。HRMS(ESI;m/z):Calcd for C40H47N7O,[M+H]+642.391 5,found 642.387 7。

2.2 5a與DNA相互作用的光譜學研究

配制含100 mmol/L KCl、10 mmol/L Tris-HCl、pH為7.4的DNA緩沖溶液buffer。所用到的DNA序列包括：G-四鏈體形成序列c-myc、k-ras、c-kit、bcl-2、vegf、pdgfa；雙鏈序列ds26；單鏈序列ss26、t21。所有DNA序列在95℃下加熱5 min后緩慢冷卻退火，其中不同類型的富G序列可以形成不同構(gòu)象的G-四鏈體結(jié)構(gòu)。

采用紫外光譜和熒光光譜實驗研究5a與G-四鏈體DNA及其他類型DNA的相互作用。首先，使用紫外光譜儀測定20.0μmol/L 5a在200～600 nm處的紫外光譜，結(jié)果顯示5a在310 nm處有最大紫外吸收（見圖3A）。以最大紫外吸收波長310 nm為激發(fā)波長，以320 nm為發(fā)射波長，加入不同類型的DNA溶液，收集320～580 nm波長范圍內(nèi)的熒光光譜，見圖3B～圖3E。可見，在0.5μmol/L 5a單獨存在的情況下，在445 nm處有一定的熒光發(fā)射，這是由于引入了熒光團N,N-二甲基苯胺所導致的。加入G-四鏈體后，5a在445 nm處的發(fā)射峰強度發(fā)生了一定的變化。在分別加入0.5μmol/L的正平行型c-myc、k-ras、pdgfr-a G-四鏈體和混合型bcl-2 G-四鏈體后，化合物5a的熒光強度都有一定的增強，并且化合物對不同G-四鏈體的熒光響應(yīng)具有一定的差異。具體表現(xiàn)為：加入c-myc G-四鏈體后，5a在445 nm處的發(fā)射峰強度顯著增加，增加的熒光強度明顯高于其他類似的G-四鏈體，表現(xiàn)出一定的識別c-myc G-四鏈體構(gòu)象的能力；分別加入等濃度（0.5μmol/L）的反平行型c-kit、vegf G-四鏈體DNA后，5a在445 nm處的發(fā)射峰強度無明顯變化，表明5a對反平行型G-四鏈體的熒光響應(yīng)較差?？赡艿脑蚴钦叫行?、反平行型以及混合型G-四連體的結(jié)構(gòu)差異性。反平行型G-四連體的loop堿基區(qū)域橫跨G-四鏈體的G-四分體平面正上方，阻礙了5a與G-四分體發(fā)生π-π堆積作用。而正平行型和混合型G-四連體的loop堿基位于G-四分體的側(cè)面，因此，5a能較好地與G-四鏈體的發(fā)生π-π堆積作用和氫鍵作用[13]。此外，在同樣情況下，等濃度（0.5μmol/L）的單鏈DNA（t21和ss26）、雙鏈DNA（ds26）均不能使5a的熒光產(chǎn)生增強。

圖3 5a與DNA相互作用圖譜Figure 3 The interaction spectra between 5a and DNA

據(jù)文獻報道，部分四取代咪唑有聚集誘導發(fā)光性能[13]。為了研究5a的自聚集效應(yīng)對熒光響應(yīng)結(jié)果的影響，考察了不同溶劑下的5a分子的熒光光譜。配制含0.25μmol/L 5a的緩沖溶液buffer、ddH2O、THF，以THF溶液為對照，以最大紫外吸收波長310 nm為激發(fā)波長，以320 nm為發(fā)射波長，收集330～600 nm波長范圍內(nèi)的熒光光譜，結(jié)果見圖3F?？梢?，在緩沖溶液buffer和ddH2O中，5a具有一定的熒光響應(yīng)（445 nm處的最大熒光響應(yīng)強度分別為26 340和26 110），這是由于分子中引入了熒光基團；在THF中，未加5a時THF在410 nm具有一定的熒光響應(yīng)，而加入5a分子后，熒光響應(yīng)發(fā)生了較小的增加，在410 nm的熒光響應(yīng)增量為2 000，而在445 nm處的最大熒光響應(yīng)增量為645，遠小于5a分子與部分G-四連體在445 nm處的熒光響應(yīng)增量。

2.3 5a對c-myc G-四鏈體相互作用的穩(wěn)定性與構(gòu)象研究

為了研究5a分子對c-myc G-四鏈體的穩(wěn)定作用，進行了DNA熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET-melting）實驗。用buffer配置含已退火的0.1μmol/L c-myc DNA與1.0μmol/L 5a的混合溶液，測定25～99℃下的T值，結(jié)果見圖4所示?？梢?，c-myc G四鏈體DNA的TDNA=66.1℃，5a/DNA共孵育的混合物的TDNA+5a=73.5℃，ΔT=TDNA+5a?TDNA=7.4℃，表明5a對c-myc G-四鏈體具有較強的穩(wěn)定作用。

圖4 5a與c-myc G-四鏈體發(fā)生穩(wěn)定作用的熔點曲線圖Figure 4 Melting curves of stabilizing effects between 5a and c-myc G-quadruplex

為了研究5a對c-myc G-四鏈體構(gòu)象的影響，進行了CD實驗。先將2.0μmol/L c-myc DNA和不同濃度的5a在buffer條件下，于95℃加熱共退火后，緩慢冷卻到室溫，然后進行CD測試，結(jié)果見圖5。可見，在緩沖溶液中（100 mmol/L KCl、10 mmol/L Tris-HCl、pH為7.4），c-myc DNA在265 nm處有最大正吸收峰，在240 nm處有最大負吸收峰，表明形成了正平行型G四鏈體的構(gòu)象[11,14-15]；隨著化合物濃度的逐漸升高，最大正吸收峰和最大負吸收峰沒有發(fā)生明顯的變化，表明不同濃度的5a對G-四鏈體構(gòu)象的影響較小，c-myc DNA依然保持正平行型G-四鏈體的構(gòu)象。

圖5 5a與c-myc G-四鏈體CD滴定圖譜Figure 5 CD titration spectrum of 5a and c-myc G-quadruplex

2.4 5a與c-myc G-四鏈體相互作用模式研究

從Protein Data Bank數(shù)據(jù)庫中獲取c-myc G-四鏈體的晶體結(jié)構(gòu)作為受體模型（2l7v）[16]。使用Molecular Operating Environment 2019（MOE2019）分子對接軟件對獲得的30個5a構(gòu)象進行對接分析，結(jié)果見圖6?？梢?，5a的四芳基咪唑能較好地堆積在c-myc G-四鏈體的G四分體平面上，與鳥嘌呤殘基發(fā)生較強的π-π堆積作用，使5a的兩條甲基哌嗪側(cè)鏈能夠與G-四鏈體溝槽內(nèi)的磷酸骨架發(fā)生較強的靜電相互作用，從而把5a的咪唑環(huán)與熒光基團鎖定在一個近平面上，導致5a的分子構(gòu)象發(fā)生變化，從而發(fā)射出熒光。

圖6 5a與c-myc G-四鏈體分子對接分析Figure 6 Molecular docking analysis between 5a and c-myc G-quadruplex

3 小結(jié)

本研究以2,2-雙（4-甲基哌嗪基苯基）乙二酮為起始原料，通過Debus-Radziszewski咪唑合成反應(yīng)一鍋法合成得到了5a，并采用1H NMR、13C NMR、HRMS等進行了結(jié)構(gòu)鑒定。紫外光譜實驗和熒光光譜實驗研究表明5a對大部分G-四鏈體具有一定的熒光識別作用，特別是可以識別c-myc G-四鏈體，并表現(xiàn)出較好的選擇性。FRET-melting實驗、CD實驗等結(jié)果表明5a能與c-myc G-四鏈體發(fā)生較強的相互作用。分子對接分析結(jié)果表明5a分子堆積在G-四鏈體平面上，發(fā)生π-π作用和靜電吸引作用，導致熒光基團與咪唑骨架的構(gòu)象發(fā)生改變，從而產(chǎn)生熒光。本研究為新型靶向G-四鏈體的熒光探針的發(fā)現(xiàn)提供了依據(jù)。