許紅喜，劉勝軍，張 震，劉國君

（1.黑龍江省農墾科學院 畜牧獸醫(yī)研究所，哈爾濱 150038；2.黑龍江八一農墾大學，黑龍江 大慶 163319；3.黑龍江省農業(yè)科學院 畜牧研究所，哈爾濱 150086）

隨著全國范圍內鵝業(yè)的大發(fā)展，黑龍江省先后引入了霍爾多巴吉、四川白鵝、皖西白鵝、獅頭鵝、浙東白鵝及大三花等知名鵝品種加以利用，這為黑龍江省發(fā)展鵝業(yè)生產提供了充足的種源保障［1］。黑龍江省本土看家品種籽鵝適應性強，產蛋性能高，能在寒冷的氣候環(huán)境、粗劣的飼養(yǎng)管理條件下保持高產，是世界上罕見的高產鵝種［2］。但是與引進的快大型肉鵝相比體型小、生長速度慢，有逐漸被廣大養(yǎng)殖戶淘汰的趨勢［3］，保種育種成為當前黑龍江省鵝養(yǎng)殖研究中的重點［4］。鵝精液冷凍技術是一種有效的保種方法，使人工輸精技術不再受時間和空間的限制，對促進鵝精液采集和人工輸精技術的發(fā)展起到至關重要的作用。家禽精液冷凍技術正致力于瀕危禽類精子冷凍保存基因庫的建立，在歐洲瀕危物種計劃（EEP）中冷凍保存了17種瀕危雞形目的精液［5］。鵝精液采集和冷藏冷凍技術，特別是精液冷凍后用于人工輸精方面還沒有真正應用于生產。鵝與雞、鴨等其他家禽相比個體大、飼養(yǎng)成本高，自然交配公母比率低（1∶4左右），精液品質、產蛋、受精率和孵化率都較低，尤其到了繁殖后期精液品質、交配頻率和受精率又急劇降低，因此，在產蛋不同時期進行種鵝精液篩查的同時研究冷凍技術是非常必要的。如果禽精液冷凍技術能成熟應用到生產實踐中，對引種保種、改良本地品種、節(jié)約成本、增加養(yǎng)殖戶的經濟效益意義重大。本研究進行了哈爾濱地區(qū)4—6月份自然狀況下籽鵝精子品質、冷藏和冷凍后精子活力測定，為后續(xù)進行籽鵝人工授精奠定基礎，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

2018年4月1日，在哈爾濱牧娃鵝業(yè)種鵝場，選取健壯活潑、陰莖發(fā)育良好的2歲純種籽鵝種公鵝20只，單獨飼養(yǎng)，飼養(yǎng)管理方式與大群種鵝相同。

1.2 試劑與儀器

主要試劑包括L-谷氨酸鈉（G8010，Solarbio?公司產品）、無水磷酸氫二鈉（D7290，Solarbio?公司產品）、無水磷酸二氫鈉（Solarbio?公司產品）、無水葡萄糖（Solarbio?公司產品）、聚乙烯吡咯烷酮（Solarbio?公司產品）、硫酸魚精蛋白（Solarbio?公司產品）、肌醇（Solarbio?公司產品）、二甲基乙酰胺DMA（Solarbio?公司產品）、無水醋酸鎂（Solarbio?公司產品）、無水醋酸鉀（Solarbio?公司產品）、二甲基甲酰胺（DMF，Solarbio?公司產品）、Tris（Sigma公司產品）。

主要儀器包括天子天平（雷磁公司產品）、滲透壓儀（雷磁公司產品）、顯微鏡（奧林巴斯產品）；血細胞計數板、pH計（雷磁公司產品）、禽專用集精杯、0.25 mL微型凍精細管，以上儀器均來源于黑龍江省農墾科學院畜牧獸醫(yī)研究所實驗室。

1.3 冷凍稀釋液配方

配方1：檸檬酸鉀0.14 g，谷氨酸鈉1.40 g，磷酸氫二鈉0.98 g，磷酸二氫鈉0.21 g，葡萄糖0.70 g，果糖0.20 g，肌醇0.70 g，聚乙烯吡咯烷酮0.10 g，硫酸魚精蛋白0.02 g，水100 mL，滲透壓390 mOsm/kg，pH值7.3［6］。

配方2：谷氨酸鈉1.92 g，葡萄糖0.80 g，無水醋酸鎂0.08 g，無水醋酸鉀0.50 g，聚乙烯吡咯烷酮0.30 g，水100 mL，滲透壓343 mOsm/kg，pH值7.08［7］。

配方3：Tris-檸檬酸稀釋液：三羥甲基氨基甲烷24.224 g，檸檬酸13.536 g，葡萄糖11 g，甘油60 mL，大豆植物蛋白2 g，水1 000 mL［8-9］。

1.4 籽鵝精液的采集

每周進行一次采精，在周一早上08：00—09：00，早晨控水控料，采用背腹式按摩采精法［10］采集20只籽鵝精液。背腹式按摩法采精應由3人操做。先把鵝放在采精架上，一位助手按住鵝的翅膀根部（也可以把鵝保定），另一位助手左手持集精杯，右手用滅菌生理鹽水浸過的棉球由中央到外周擦洗泄殖腔。采精人員左手五指分開，掌心向下從公鵝翅膀根部向尾部方向有節(jié)奏地按摩，每次1～2 s，持續(xù) 四五次后左手按摩，捎帶擠壓公鵝尾根部，同時右手拇指和食指有節(jié)奏地按摩腹部后面的柔軟部，并逐漸擠壓按摩泄殖腔環(huán)，使其充血引起陰莖勃起，此時左手拇指和食指輕擠泄殖腔環(huán)背側，精液沿輸精溝從陰莖頂端射出。另一位立即用預先消毒好的集精杯收集精液、需要注意鵝每次所出精液量很少，必須小心收集，勿流于集精杯外，整個采精過程需要120 s左右。

1.5 冷藏試驗和冷凍試驗

選擇優(yōu)良籽鵝的精液，用配方1，2，3稀釋液做1∶1稀釋后分成2份，放到有冰袋的保溫盒中盡快帶到實驗室。在實驗室將2份樣品中的1份放到4℃冷藏柜進行冷藏試驗，另1份進行冷凍試驗，每份都設9個重復樣品，間隔24 h觀察精子活力。

將凍精細管和冷凍保護劑DMF提前放到4℃冷藏柜中預冷，將冷凍試驗的精液在4℃冷藏柜中平衡30 min，在標有配方1，2的樣品中加入冷凍保護劑DMF，終濃度為6%，平衡15 min［11］。用注射器裝管，平衡30min，平鋪在液氮面上熏蒸，熏蒸距離液氮面的高度為2 cm，大約-120℃平衡8 min［13］，投入液氮中。用鑷子在液氮中取出細管凍精，40℃水浴1 min，觀察精子活力，間隔24 h觀察，測定。

1.6 測定項目

采用A.Jerysz等［12］的方法對按摩法采精性反應程度進行分類評分。1型為優(yōu)秀，反應快速少于60 s，射精快；2型為良好，反應較慢，多于60 s，射精較慢；3型為差，對按摩有反應，反應速度特別慢，不射精；4型為最差，對按摩根本沒反應。本試驗中選取健壯和陰莖發(fā)育良好的種公鵝20只，經評定，全部為1型。用離心管分別收集公鵝精液，備用。在4—6月份期間，每周一采集種鵝精液，測定精液品質，包括射精量、精子密度、精子活力。取當月4次平均值作為該月數據。

鵝精液體積在禽專用集精杯上直接讀取數據；精子活力在顯微鏡下觀察評估5個視野，記錄數據；精液密度使用3%NaCl溶液將原精稀釋100倍，在血細胞計數板數出5個中格總精子數，多次測量，取平均數。

1.7 數據的統(tǒng)計分析

試驗數據采用SPSS軟件中的ANOVA程序進行檢驗，后進行LSD統(tǒng)計。

2 結果與分析

2.1 籽鵝不同時間精液品質

采用背腹式按摩法采精需要用禽專用集精杯收集籽鵝精液。結果可見，精液外觀顏色呈乳白色，無雜質，射精量、精子密度和精子活力結果見表1。其中4，5，6月份射精量分別為0.374，0.310，0.229 mL，精子密度為5.600，4.700，4.089億個/mL，精子活力為0.806，0.743，0.675，隨著時間的推移，射精量、精子密度、精子活力都在逐漸下降。

表1 4，5，6月份籽鵝精液品質測定結果

2.2 冷藏試驗

3種配方稀釋的籽鵝精液保存在4℃冷藏，間隔24 h在顯微鏡下觀察、記錄數據，結果見表2。其中保存0 h精子活力在3個配方之間差異不顯著（P＞0.05），保存24 h精子活力在3個配方之間差異顯著（P＜0.05），保存48，72 h精子活力在3個配方之間差異極顯著（P＜0.01）。總的來說，隨著時間的推移，精子活力呈下降趨勢，配方3的精子活力在各時間點都是最高的。

表2 4℃冷藏籽鵝精液解凍后采用不同稀釋液存放不同時間的精子活力測定結果

2.3 冷凍試驗

3種配方稀釋的籽鵝精液經冷凍程序冷凍保存在液氮中，細管凍精在40℃水浴中1 min，水平放置剪開兩端，倒入0.5mL離心管，放在4℃冷藏保存，間隔24 h觀察精子活力，結果見表3。其中保存0，24，48 h精子活力在3個配方之間差異不顯著（P＞0.05），保存72 h精子活力在3個配方之間差異極顯著（P＜0.01）?？偟膩碚f，隨著時間的推移，精子活力呈下降趨勢，配方3的精子活力在各時間點都是最高的。

表3 超低溫冷凍保存籽鵝精液解凍后采用不同稀釋液存放不同時間的精子活力測定結果

3 討論

3.1 籽鵝不同時間精液品質比較

籽鵝射精量范圍為0.1～0.8 mL，4，5，6月份射精量平均是0.37，0.31，0.23 mL，精子密度為5.600，4.700，4.089億個/mL，精子活力為0.806，0.743，0.675。黑龍江省產蛋高峰在4，5月份，在產蛋后期6月份射精量、精子密度和精子活力顯著下降，可通過嚴格的飼養(yǎng)管理使種鵝保持良好的繁殖性能。獅頭鵝飼養(yǎng)管理飼料能量水平應達到11.1 MJ/kg，粗蛋白達14%以上，鈣、磷分別為1.2%和0.6%。公鵝對 維生素A、維生素D和 維生素E的需要量比母鵝多，飼料中維生素E濃度達到每噸飼料40～50 g時，可顯著提高受精率［14］。產蛋后期有必要進行精液品質評定，淘汰評定為差和最差的種公鵝，有利于提高種蛋受精、出雛率及種群繁殖力。

3.2 關于冷藏試驗

配方1，2，3稀釋液冷藏鵝鮮精試驗是在種鵝場采精觀察完稀釋，放在冰盒中帶到實驗室，這個過程經歷了大約6 h。在實驗室開始計時采用3種配方的稀釋液保存于4℃，結果表明，0 h精子活力分別為0.797，0.798，0.803；4℃冷藏第3天（即72 h）活力分別為0.085，0.233，0.388。林禎平等［15］將獅頭鵝精液1∶1稀釋后進行人工輸精，種蛋受精率最高，為90%。精液需要達到一定的有效精子數才能維持較高的種蛋受精率，每次輸入的有效精子數需在0.19億個以上效果較好［15］。因此在生產實踐中，隨著保存時間的延長精子活力降低，應增加輸精體積，保持有效精子數在0.19億以上。低溫Tris-檸檬酸大豆植物蛋白冷藏稀釋液（配方3）保存精子到第3天，也與配方1，2一樣，精子活力急劇下降。綜合來看，如果是現采現用，3種稀釋液配方都可用，如果是異地輸精選擇配方3效果較好。

3.3 關于冷凍試驗

超低溫液氮冷凍鵝精子解凍后，配方1，2是國外應用廣泛的Lake’s和EK液，凍后0 h精子活力達0.243和0.297，低于配方3（0.360）。精子在低溫狀態(tài)下細胞膜的通透性發(fā)生改變，頂體受到損傷，從而出現冷休克。配方3是Tris-檸檬酸稀釋液，含有大豆植物蛋白，在低溫下起到保護精子作用。這個配方未采用傳統(tǒng)的卵黃、牛奶等動物性保護劑，傳統(tǒng)稀釋液卵黃、奶粉或鮮奶等冷凍保護劑在精液冷凍保存中可以起到較好的抗凍作用，這些冷凍保護劑有效成分是低密度脂蛋白（LDL）；但是世界動物健康組織（OIE）早在2003年建議，精液處理中應該避免使用有生物學感染風險的動物源產品［16］。家禽精液冷凍是家禽人工授精和物種基因庫保存的基礎，但目前仍然沒有一套系統(tǒng)有效的冷凍方法能夠使家禽冷凍精液達到較好而穩(wěn)定的受精率［17］。3種稀釋液效果比較，配方3無論冷藏試驗還是冷凍試驗保存籽鵝精液效果都是最好的。由此，本試驗通過借鑒國外及其他家畜精液冷藏、冷凍保存方法技術，初步建立籽鵝精液冷凍程序，為下一步鵝人工輸精改良本地品種打下良好基礎。

4 結語

籽鵝是黑龍江省看家鵝品種，很多試驗表明籽鵝精液品質優(yōu)于其他外來品種如萊茵鵝和豁眼鵝等［18-20］。本試驗中，射精量、精子密度及精子活力這些指標到產蛋后期都顯著降低，需要加強飼養(yǎng)管理，提高種蛋受精率；在冷藏試驗和冷凍試驗保存籽鵝精液都是配方3最好。該方法的建立為下一步鵝人工輸精改良本地品種打下良好基礎。