李金躍，劉嫣然，趙晨曦，于夢佳，劉泳彤，黃雨馨，夏彥玲

（東北林業(yè)大學(xué) 野生動物與自然保護地學(xué)院，哈爾濱 150040）

CDKN2C基因又被稱INK4C基因或P18基因［1］，屬于INK4家族，INK4家族共包括4個成員，按分子質(zhì)量大小及發(fā)現(xiàn)順序依次命名為P16INK4A、P15INK4B、P18INK4C和 P19INK4D［2］。由 于INK4家族各成員的功能單位均由4～5個錨蛋白重復(fù)序列構(gòu)成，具有共同的生物學(xué)特性，即都可以通過與CDK4/6結(jié)合，使cyclinD-CDK4/6復(fù)合物激酶的活性被抑制，從而起到控制細胞周期G1進程的作用［3］。以磷酸化和去磷酸化為基礎(chǔ)的細胞內(nèi)源性調(diào)控就是在cyclin-CDK -CKI途徑中實現(xiàn)的，在cyclin-CDK-CKI途徑中，cyclin和CKI可對CDK進行正調(diào)控或反調(diào)控，在這種調(diào)控機制正常時保持動態(tài)平衡的狀態(tài)，若這種動態(tài)平衡的正負調(diào)控機制一旦不再平衡，細胞就可能會有增殖異常的情況出現(xiàn)［4］。CDKN2C在正常細胞周期中發(fā)揮抑癌基因的作用，特異性抑制Cyclins和CDKs的磷酸化活性，從而通過一系列途徑來抑制細胞癌變，有CDKN2C基因敲除的相關(guān)試驗研究表明，該基因在抑制腫瘤發(fā)生中起到重要作用［5］。

鹿茸的生長發(fā)育速度十分迅速，其頂部組織最快生長時期的分裂速度遠超惡性腫瘤細胞，但在快速生長期仍然能保持有序的組織結(jié)構(gòu)而不發(fā)生癌變，這種生物學(xué)現(xiàn)象是當(dāng)今研究的熱門。其分子機制尚不明確，因此在生物學(xué)領(lǐng)域的科學(xué)家們致力于研究鹿茸的生長發(fā)育機制，并且找尋其與細胞癌變機制的關(guān)聯(lián)，試圖由此解決癌癥的相關(guān)問題。細胞周期阻滯可以保護損傷細胞，它有利于損傷后DNA的修復(fù)，從而減少損傷導(dǎo)致的致死性和致畸性。CDKN2C基因可以調(diào)控細胞周期的進行，這與腫瘤細胞的增殖等具有密切的聯(lián)系。本試驗以鹿茸組織cDNA 為模板，對鹿茸的CDKN2C基因進行克隆、轉(zhuǎn)化、測序及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測，以期為今后鹿茸生長發(fā)育機制及CDKN2C基因在鹿茸生長發(fā)育中所發(fā)揮的重要功能研究提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

健康成年二杠型東北梅花鹿鹿茸，來自內(nèi)蒙古根河林業(yè)局，采樣時間為2020年2月份，由東北林業(yè)大學(xué)野生動物與自然保護地學(xué)院實驗室保存。在無菌環(huán)境下迅速采集鹿茸約5 cm的頂端組織為試驗樣品，迅速對其表面進行消毒，垂直鹿茸生長軸方向切斷，置于液氮中保存，以備后續(xù)使用。

1.2 主要儀器

見表1。

表1 主要儀器

1.3 主要試劑的配制

50×TAE：稱取Tris-Base 242 g置于燒杯中，加入冰乙酸57.1 mL、0.5 mol/L EDTA（pH值8.0）100 mL，加入去離子水定容至1 000 mL，于4℃條件下保存。

氨芐青霉素（100 mg/mL）：用超純水將氨芐青霉素配制成100 mg/mL存儲液，使用0.22μm濾器過濾除菌，分裝成每管1 mL體積，于-20℃條件下保存。

卡那霉素（50 mg/mL）：用超純水將卡那霉素配制成50 mg/mL存儲液，使用0.22μm濾器過濾除菌，分裝成每管1 mL體積，于-20℃條件下保存。

X-gal：將粉狀X-gal溶解到二甲基酰胺溶液（DMF）中，制成20 mg/mL溶液，分裝成每管100μL體積，每管外包有鋁箔紙保持遮光，于-20℃條件下保存。

IPTG：稱取2.0 g粉狀I(lǐng)PTG，用無菌去離子水將其定容至10 mL，使用0.22μm濾器過濾除菌，分裝成每管50μL體積，于-20℃條件下保存。

10 mmol/L NaOH：稱取4.0 g粉狀NaOH，用無菌去離子將其定容至10 mL，于4℃條件下保存。

LB液體培養(yǎng)基：稱取胰蛋白胨2.0 g，酵母浸粉1.0 g，NaCl 2.0 g，用去離子水將其定容至100 mL，用10 mmol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.4～7.6之間，進行高壓滅菌，于4℃條件下保存。

LB固體培養(yǎng)基：先配置100 mL LB液體培養(yǎng)基，再加入1.5 mg瓊脂粉，進行高溫滅菌，待滅菌后取出，輕輕搖勻，溫度適宜時向培養(yǎng)基中相繼加入IPTG 20μL、X-gal100μL、氨芐青霉素100μL（卡那霉素50μL），充分混勻后鋪板于培養(yǎng)皿中然后封口，于4℃條件下保存。

1.4 RNA的提取和cDNA的合成

采用TRIzol法提取鹿茸組織中的總RNA，提取完成后，利用1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測RNA的完整性和質(zhì)量。以RNA為模板、Oligo-dT為引物，在反轉(zhuǎn)錄酶M-MLVⅢ的催化下反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)結(jié)束后將cDNA置于-20℃冰箱中保存，備用。

1.5 梅花鹿CDKN2C基因引物的設(shè)計與合成

參照GenBank牛、羊的CDKN2C基因序列，運用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計同源引物，擴增片段包含該基因的CDS區(qū)，預(yù)期擴增片段大小為536 bp，引物序列為上游引物5′-CAGGACCCTAAAGAATGGC -3′，下游引物5′-GAGCCCTCCCCACATTC-3′。

1.6 梅花鹿CDKN2C基因cDNA的克隆

以1.5中合成的cDNA為模板，通過PCR技術(shù)獲得CDKN2C 基因cDNA 序列。反應(yīng)體系（25.0μL）：10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTPs 1.0μL，上下游引物各1.0μL，rTaq DNA聚合酶0.2μL，ddH2O 17.3μL，cDNA 2.0μL。具體反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，變性95℃30 s，退火57.0℃30 s，延伸72℃30 s，共35個循環(huán)，之后再72℃延伸10 min。用移液槍取6μL PCR產(chǎn)物，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶。再利用膠回收試劑盒（購自寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司）回收PCR產(chǎn)物。將目的基因片段與pMD18-T載體連接并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，涂布LB固體培養(yǎng)基，利用藍白斑篩選和PCR鑒定挑選陽性克隆菌落，送至庫美生物科技有限公司進行測序。

1.7 梅花鹿CDKN2C基因的生物信息學(xué)分析

通過ORF Finder預(yù)測并分析梅花鹿CDKN2C基因序列的開放閱讀框，應(yīng)用NCBI中的BLAST程序?qū)Φ玫降腃DKN2C基因編碼序列進行同源性比對分析，并根據(jù)序列比對結(jié)果，運用MEGA X軟件采取鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，利用ProtParam、ProtScale、PSORTⅡPrediction以及SignalP 3.0 Server在線分析軟件對CDKN2C蛋白的一級序列進行分析，運用NCBI中的CD-Search在線分析工具預(yù)測CDKN2C蛋白上的保守結(jié)構(gòu)域，用GOR4和SWISS-MODEL在線軟件分別對該蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測分析，用CBS網(wǎng)站上的NetPhos 3.1 Server在線分析軟件、NetOGlyc 4.0 Server在線分析軟件以及NetNGlyc 1.0 Server在線分析軟件預(yù)測CDKN2C蛋白的磷酸化位點、O-糖基化位點以及N-糖基化位點。

2 結(jié)果與分析

2.1 梅花鹿CDKN2C基因的克隆

以梅花鹿鹿茸組織cDNA為模板，進行PCR擴增。結(jié)果擴增出一條536 bp的特異性帶，與預(yù)期片段大小相符，初步認定為CDKN2C基因的cDNA序列，見圖1。

圖1 梅花鹿CDKN2C基因的PCR擴增結(jié)果

2.2 梅花鹿CDKN2C基因的序列分析

將測序結(jié)果進行BLAST分析，確認為是梅花鹿CDKN2C基因后，通過ORF Finder序列分析工具進行分析，得出該基因的CDS區(qū)全長507 bp，編碼168個氨基酸，具體的編碼序列及對應(yīng)氨基酸序列見圖2。

2.3 梅花鹿CDKN2C基因編碼序列進化樹的構(gòu)建

運用MEGA X軟件構(gòu)建的梅花鹿CDKN2C基因編碼序列系統(tǒng)進化樹見圖3。梅花鹿與牛最先匯為一支，其與大羚羊、野駱駝、牛以及馬的親緣關(guān)系較近，與智人和長臂猿的親緣關(guān)系較遠。

圖3 梅花鹿CDKN2C基因編碼序列系統(tǒng)進化樹

2.4 梅花鹿CDKN2C蛋白質(zhì)的特性

2.4.1 蛋白質(zhì)一級序列 ProtParam在線分析軟件分析結(jié)果顯示，該CDKN2C蛋白含168個氨基酸殘基，亮氨酸和丙氨酸含量較高。通過ExPASy服務(wù)器ProtScale模塊的Kyte&Doolittle算法在線分析軟件對梅花鹿CDKN2C蛋白進行分析，結(jié)果見圖4，顯示梅花鹿CDKN2C蛋白為親水蛋白。采用PSORTⅡPrediction程序分析其亞細胞定位，結(jié)果表明，梅花鹿CDKN2C蛋白89%位于細胞質(zhì)，11%位于細胞核。用SignalP 3.0 Server在線分析軟件預(yù)測梅花鹿CDKN2C蛋白的信號肽，結(jié)果見圖5，顯示SNRPB不具備信號肽。

圖4 梅花鹿CDKN2C蛋白親/疏水性分析

圖5 梅花鹿CDKN2C蛋白的信號肽預(yù)測

2.4.2 結(jié)構(gòu)域預(yù)測 用CD-Search在線分析工具對梅花鹿CDKN2C蛋白的結(jié)構(gòu)域進行預(yù)測，結(jié)果見圖6，發(fā)現(xiàn)第46～127位氨基酸殘基之間存在Ank_2結(jié)構(gòu)域，此結(jié)構(gòu)域包括多個β（2）-α（2）基序重復(fù)序列。

圖6 梅花鹿CDKN2C蛋白的保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測

2.4.3 二級結(jié)構(gòu)與三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 用GOR4在線軟件對梅花鹿CDKN2C基因編碼的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，結(jié)果表明，該蛋白α-螺旋占47.62%，延伸鏈占12.50%，自由卷曲占39.88%，見圖7。用SWISS-MODLE在線軟件分別模擬梅花鹿、牛和人的CDKN2C蛋白高級結(jié)構(gòu)，結(jié)果得出三者結(jié)構(gòu)較為相似，但其中梅花鹿的CDKN2C蛋白結(jié)構(gòu)與牛更為相似，見圖8。

圖7 CDKN2C基因編碼的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)

圖8 梅花鹿、牛、人CDKN2C蛋白三級結(jié)構(gòu)比較

2.4.4 蛋白翻譯后位點修飾的預(yù)測 利用Net-Phos 3.1 Server、NetOGlyc 4.0 Server和NetNGlyc 1.0 Server等在線分析軟件對梅花鹿CDKN2C蛋白翻譯后磷酸化位點、O-糖基化位點和N-糖基化位點修飾進行預(yù)測，結(jié)果見圖9，表明梅花鹿CDKN2C蛋白含有2個絲氨酸和3個蘇氨酸磷酸化位點，分別位于氨基酸序列的第23，154位和第88，126，139位，沒有發(fā)現(xiàn)N-糖基化位點以及O-糖基化位點。

圖9 梅花鹿CDKN2C蛋白的磷酸化位點預(yù)測

3 討論

鹿茸角是鹿科動物的第二性征（馴鹿除外），其在快速生長期仍然能保持有序的組織結(jié)構(gòu)而不發(fā)生癌變［6］，所以科學(xué)家們一直致力于探尋鹿茸生長機制并希望尋找到其與細胞癌變機制的相似點，為癌癥的治療提供新的思路。有研究表明CDKN2C基因敲除與癌癥患者總體生存期下降有關(guān)［7］。CDKN2C是一種重要的細胞周期調(diào)節(jié)劑和細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑［8］，這可能與鹿科動物茸角的快速生長機制相關(guān)。國內(nèi)外對CDKN2C基因的研究少見報道，因此，研究鹿茸頂端組織的CDKN2C基因及其編碼蛋白可為癌癥治療提供新的思路。

本試驗利用PCR技術(shù)成功擴增了梅花鹿的CDKN2C基因，獲得的CDKN2C基因CDS區(qū)全長507 bp，編碼168個氨基酸，無信號肽。將梅花鹿鹿茸組織的CDKN2C基因的CDS序列與智人、長臂猿、土豚、家貓、馬、野駱駝、大羚羊、牛以及抹香鯨等幾個物種的序列進行分析并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其與牛的親緣關(guān)系最近，這與進化規(guī)律相符。應(yīng)用PSTORⅡ程序預(yù)測結(jié)果表明，89%分布在細胞質(zhì)，11%在細胞核，說明CDKN2C蛋白可能在細胞質(zhì)內(nèi)對鹿茸細胞的生長發(fā)育進行調(diào)控。SignlP程序預(yù)測該蛋白無信號肽，為非分泌性蛋白。預(yù)測該蛋白二級結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，其α-螺旋占47.62%，延伸鏈占12.50%，自由卷曲占39.88%，預(yù)測該蛋白二級結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)梅花鹿的CDKN2C蛋白結(jié)構(gòu)與牛相似，這與系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建結(jié)果相呼應(yīng)，符合進化規(guī)律。

使用NCBI中Conserved Domain Search程序分析該蛋白結(jié)構(gòu)域，結(jié)果表明，第46～127位氨基酸為ANK-2結(jié)構(gòu)域。ANK結(jié)構(gòu)域是自然界最常見的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用模式之一，來源于真核生物，存在于許多功能多樣的蛋白質(zhì)中。張富軍［9］在文章中就曾表明ANK重復(fù)序列是最常見的保守蛋白結(jié)構(gòu)域之一。在許多功能蛋白中，ANK結(jié)構(gòu)域可以充當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)相互作用的支架，并在多種細胞學(xué)和生物學(xué)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，例如細胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞骨架完整性、轉(zhuǎn)錄和細胞周期調(diào)控、炎癥反應(yīng)等。而且ANK結(jié)構(gòu)域包括多個β（2）-α（2）基序重復(fù)序列，該結(jié)構(gòu)域的這種重復(fù)主要出現(xiàn)在具有多種功能的蛋白質(zhì)中，如轉(zhuǎn)錄啟動子、細胞周期調(diào)節(jié)因子等［10］，說明CDKN2C基因可能具有細胞周期調(diào)節(jié)作用，這與腎癌相關(guān)研究結(jié)論一致［11］。

梅花鹿的CDKN2C蛋白翻譯后位點修飾的預(yù)測分析顯示，其氨基酸序列上有含有2個絲氨酸和3個蘇氨酸磷酸化位點。蛋白質(zhì)磷酸化是生物界最普遍、最重要的翻譯后修飾之一，幾乎參與細胞所有的生命活動，尤其是基因表達調(diào)控和信號傳導(dǎo)［12］，磷酸化還對蛋白翻譯和細胞增殖等方面有推動作用［13］，可能與信號傳導(dǎo)、細胞周期、生長發(fā)育以及癌癥機制等有關(guān)。梁積峰等［14］的研究表明，當(dāng)癌細胞磷酸化水平顯著增加之后，癌細胞活力顯著降低，癌細胞凋亡顯著增加。由此可見，CDKN2C基因可能在抑癌方面發(fā)揮重要作用。本試驗成功克隆了梅花鹿CDKN2C基因序列，并對其表達的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，以期為今后鹿茸的生長發(fā)育機制的研究，并為CDKN2C基因在鹿茸生長發(fā)育中所扮演的角色功能研究提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。