陶 力，神英超，阿魯斯，伊敏娜，才文道力瑪，王希生，田書岳，芒 來，格日樂其木格

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院／內(nèi)蒙古自治區(qū)馬屬動物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實驗室／農(nóng)業(yè)農(nóng)村部馬屬動物遺傳育種與繁殖科學(xué)觀測實驗站／內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)馬屬動物研究中心，呼和浩特 010018）

馬屬動物是一種繁殖周期較長的季節(jié)性單胎動物，通常發(fā)情季節(jié)為每年的3—9月份，母馬、母驢從發(fā)情表現(xiàn)至優(yōu)勢卵泡發(fā)育排卵，持續(xù)3～13 d不等［1-2］。馬屬動物的卵巢結(jié)構(gòu)與其他哺乳動物有很大差異，不僅皮質(zhì)和髓質(zhì)的分布位置與其他動物相反，而且有排卵窩這一特殊結(jié)構(gòu)，是成熟卵泡排卵的位置［3-9］，也因此有了獨(dú)特的卵巢卵泡生長發(fā)育、遷移、排卵機(jī)制。其獨(dú)特的繁殖生理結(jié)構(gòu)特性也成為嚴(yán)重影響馬屬動物繁殖效益和相關(guān)繁殖技術(shù)開發(fā)應(yīng)用進(jìn)程的主要因素之一。

卵巢作為雌性動物唯一性腺，不僅能產(chǎn)生雌性配子（卵子），還是雌性動物重要的內(nèi)分泌器官，可以分泌抑制素、雌激素、活化素、孕酮等［3，10］，調(diào)節(jié)動物的排卵、發(fā)情和妊娠。然而到目前為止，關(guān)于馬屬動物卵巢結(jié)構(gòu)的科學(xué)文獻(xiàn)比較少，大多數(shù)實驗室和科研機(jī)構(gòu)只是簡單地揭示了國外常見馬品種的卵巢結(jié)構(gòu)特征，但是針對馬卵巢組織結(jié)構(gòu)及更深層次的原位分子研究極少，導(dǎo)致目前人們對馬屬動物的生殖調(diào)控機(jī)制知之甚少，大部分時候都在參照其他哺乳動物中獲得知識。

因此，本試驗希望通過對比不同的固定方法、組織脫水方法、浸蠟方法及蘇木精-伊紅（Hematoxylin and Eosin，H.E.）染色體系對石蠟切片制作效果的影響，優(yōu)化馬卵巢石蠟切片制作體系，以期以此技術(shù)為基礎(chǔ)探索母馬的繁殖組織形態(tài)及功能調(diào)節(jié)分子機(jī)制，現(xiàn)報道如下。

1 材料

1.1 試驗動物

2～3歲成年雌性健康蒙古馬6匹，來自內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特市孔家營屠宰場。

1.2 試劑

4%多聚甲醛固定液（Solarbio，北京產(chǎn)）、Bouin固定液（捷世康，山東產(chǎn)）、蘇木精染色液（GHS116-500 mL，Sigma公司產(chǎn)品）、伊紅染色液（HT110116-500ML，Sigma公司產(chǎn)品）、返藍(lán)液（Sigma公司產(chǎn)品）、中性樹膠（Solarbio，北京產(chǎn)）、切片石蠟（Leica，德國產(chǎn)），均購自內(nèi)蒙古辰信生物科技有限公司；Carnoy固定液（采用氯仿、冰醋酸、無水乙醇配制）、乙醇、二甲苯、氯仿、冰醋酸，均購自天津科茂化學(xué)試劑有限公司。

1.3 主要儀器

輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)（型號為RM2245）、展片水浴鍋徠卡（型號為HI1210），均購自上海Leica科技有限公司；鼓風(fēng)干燥箱（型號為DHG-9075A），購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司；實驗室水純化系統(tǒng)（型號為N136），購自北京頗爾過濾器有限公司；旋轉(zhuǎn)式真空泵（型號為BX-1），購自上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；組織防脫載玻片（型號為PC2-301）、顯微鏡蓋玻片，均購自南通美韋德實驗器材有限公司；正置顯微圖像分析系統(tǒng)（BX53），購自日本Olympus公司。以上儀器均來源于內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)馬屬動物研究中心。

2 方法

2.1 取材和固定

試驗?zāi)格R經(jīng)頸動脈放血致死，立即開膛取出卵巢組織，剪去卵巢系膜。測量卵巢尺寸、重量。隨后將卵巢組織分別投入4%PFA固定液、Bouin固定液和Carnoy固定液中固定，并在冰盒內(nèi)運(yùn)回實驗室，再轉(zhuǎn)移至4℃冰箱內(nèi)放置固定。12 h后，取出浸泡在3種不同固定液中的卵巢，分別記錄后將卵巢均勻縱切，分別縱切成為0.3，0.6，0.9 cm厚的組織片段，再次放回固定液中固定12 h，之后觀測固定效果。

2.2 脫水與透明

將不同固定液固定的組織片段分為3組，同步進(jìn)行a、b、c 3組梯度酒精脫水。a、b、c 3組區(qū)別為：a組75%酒精浸泡6 h→85%酒精浸泡1 h→95%浸泡酒精2 h→100%酒精2 h）；b組75%酒精浸泡12 h→85%酒精浸泡1 h→95%浸泡酒精2 h→100%酒精2 h；c組75%酒精浸泡24 h→85%酒精浸泡1 h→95%浸泡酒精2 h→100%酒精2 h。

梯度酒精脫水完成后在二甲苯透明劑中放置20 min，中間換一次液（即10 min×2）。

2.3 浸蠟與包埋

在浸蠟與室溫包埋試驗處理中，發(fā)現(xiàn)室溫包埋的蠟塊當(dāng)中產(chǎn)生了大量的氣泡，在后續(xù)的石蠟切片中組織蠟帶易碎，有極少數(shù)組織在切片當(dāng)中脫落于蠟塊。為了消除這一現(xiàn)象，對馬卵巢組織浸蠟過程進(jìn)行了系統(tǒng)優(yōu)化。分別進(jìn)行了A、B、C 3種不同條件的浸蠟處理，A組：純蠟與二甲苯按1∶1比例混合并浸蠟40 min→純蠟Ⅰ40 min→純蠟Ⅱ40 min；B組：純蠟與二甲苯按1∶1比例混合并浸蠟40 min→純蠟Ⅰ40 min→純蠟Ⅱ35 min→5 min 0.02 MPa真空抽氣浸蠟；C組：純蠟與二甲苯按1∶1比例混合并浸蠟40 min→純蠟Ⅰ40 min→純蠟Ⅱ35 min→0.05 MPa真空抽氣浸蠟。以上純蠟Ⅰ和純蠟Ⅱ指的是步驟，試劑是一樣的。

2.4 切片與貼片

1）修整組織蠟塊：使用刀片將組織塊置于切塊正中央并修整貼在切片底座上。

2）蠟塊的切片：將組織使用徠卡輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)切成7μm蠟帶，并用刀片截取組織完好的部分。

3）展片：立刻放入水溫40℃的徠卡展片機(jī)內(nèi)將組織蠟片展開，再用載玻片黏取組織蠟片，直立于放置室內(nèi)自然風(fēng)干。

2.5 脫蠟與染色

H.E.染色方法，采用3種固定液固定，經(jīng)過脫水與透明、浸蠟與包埋、切片與貼片，選取完整無折損的組織片段將切片經(jīng)68℃烘片30 min，二甲苯中脫蠟之后梯度酒精（100%酒精、90%酒精、80%酒精、70%酒精）至純化水中充分洗掉二甲苯后，蘇木精染色，并用1%鹽酸分化液分色后使用返藍(lán)液，將組織切片返藍(lán)。隨后在伊紅液中染色，梯度酒精（95%酒精、100%酒精）脫水，二甲苯中透明，隨后在切片組織中央加1滴中性樹膠封片。待中性樹膠凝固之后，顯微鏡觀察并采集圖像。脫蠟與染色所用試劑溶液及時間見表1。

表1 H.E.染色所用試劑與時間

3 結(jié)果與分析

3.1 馬卵巢取樣結(jié)果

蒙古馬新鮮卵巢組織見圖1。卵巢呈豆形，外表光滑，被漿膜所包裹，大小根據(jù)卵泡發(fā)育狀況而異，沿長軸4～6 cm長、沿短軸2～4 cm寬，重量為25～50 g。

圖1 2歲蒙古馬卵巢

3.2 不同厚度組織片段固定結(jié)果

取出不同厚度的組織片段，平行做脫水、透明、浸蠟、包埋、切片發(fā)現(xiàn)，過厚的組織片段不能滿足石蠟切片制作的條件。馬卵巢石蠟切片制作時，組織片段應(yīng)控制在0.2～0.5 cm內(nèi)。大于0.5 cm時固定液無法滲透組織，組織脫水不徹底，導(dǎo)致后續(xù)的二甲苯和石蠟無法在組織深層內(nèi)進(jìn)行置換。3組不同厚度的卵巢組織片段于4℃固定24 h后制作石蠟切片的效果對比見表2。

表2 3種固定液對不同厚度組織片段固定效果對比（n＝6）

3.3 脫水處理結(jié)果

根據(jù)3.2的結(jié)果，首先確定制作石蠟切片時馬卵巢組織片段的厚度尺寸。在此條件下，繼續(xù)對小于0.5 cm組織片段進(jìn)行了a、b、c 3組脫水處理，進(jìn)一步確定了馬卵巢石蠟切片制作時的脫水體系。石蠟切片所需組織是否脫水完全，需要進(jìn)一步浸蠟、包埋、切片才能知道。組織脫水成功時切片蠟帶完整、蠟帶不斷帶；組織脫水失敗時一般有脫水過度和脫水不足兩種可能。脫水過度會導(dǎo)致切片蠟帶易碎，無法獲取完整組織片段，而組織脫水不足會導(dǎo)致組織發(fā)軟，無法進(jìn)行切片，組織和石蠟不相連。根據(jù)以上判斷標(biāo)準(zhǔn)，筆者對a、b、c 3組共54個卵巢組織片段的脫水效果進(jìn)行對比統(tǒng)計。結(jié)果顯示，3種固定液所固定的樣品在a、b兩組脫水處理中，均表現(xiàn)為脫水不足而導(dǎo)致失敗；在c組脫水處理中，Bouin、Carnoy、4%PFA 3種固定液所固定的所有組織樣品均脫水成功。a、b、c 3組不同脫水時間效果對比見表3。

表3 a、b、c 3組不同脫水時間效果對比（n＝6）

3.4 浸蠟抽氣處理結(jié)果

3種不同抽氣處理后包埋效果如下：A組，組織包埋后，蠟塊中產(chǎn)生了很多圍繞著卵巢組織的氣泡；B組，壓強(qiáng)0.02 Mpa時，真空抽氣5 min后組織周圍依然有氣泡產(chǎn)生；C組，壓強(qiáng)0.05 Mpa真空抽氣5 min后，雖然組織周圍有氣泡產(chǎn)生，但明顯少于A、B兩組，并且組織未發(fā)生收縮，見圖2。

圖2 3種不同抽氣處理后石蠟包埋效果

抽氣壓強(qiáng)大于0.05 MPa時，會使組織和細(xì)胞結(jié)構(gòu)嚴(yán)重變形收縮。通過多次試驗證明，壓強(qiáng)0.05 MPa抽氣適合于馬屬動物卵巢組織，抽氣時間長短依據(jù)組織大小、薄厚、組織密度可以控制在40 min左右，見圖2。

3.5 H.E.染色結(jié)果

鏡下觀察，4%PFA、Bouin、Carnoy 3組固定液組織切片細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)清晰度、染色鮮艷度各不相同、對比效果明顯。采用4%PFA固定液進(jìn)行固定的切片，在顯微鏡下表現(xiàn)出細(xì)胞形態(tài)正常、卵泡顆粒細(xì)胞貼壁完整，伊紅著色較淺，見圖3；采用Bouin固定液進(jìn)行固定的切片，在顯微鏡下能夠看見較清晰的組織結(jié)構(gòu)，細(xì)胞形態(tài)正常、卵泡顆粒細(xì)胞較多且完整，著色鮮艷，見圖4；采用Carnoy液進(jìn)行固定的切片，在顯微鏡下可以看到較為清晰的組織結(jié)構(gòu)，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)染色效果清晰，但卵泡液收縮嚴(yán)重，顆粒細(xì)胞不貼壁，見圖5。

圖3 2歲蒙古馬卵巢4%PFA組石蠟切片H.E.染色效果（4×）

圖4 2歲蒙古馬卵巢Bouin組石蠟切片H.E.染色效果（4×）

圖5 2歲蒙古馬卵巢Carnoy組石蠟切片H.E.染色效果（4×）

4 討論

由于本試驗動物組織是在發(fā)情期采取，因此馬卵巢具有很多大小不一的成熟卵泡，固定起來有很大的難度。本試驗中，6匹馬屠宰后全部進(jìn)行卵巢的取樣、固定、脫水、浸蠟抽氣、染色處理，其中一匹2歲母馬卵巢染色效果較好，遂全文只用了該馬的檢測數(shù)據(jù)和圖片。通過查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，國外實驗室使用Carnoy固定液固定馬屬動物卵巢較多［8-9］，但在國內(nèi)使用Bouin固定液和4%PFA做其他哺乳動物的卵巢固定較多［11-17］。故本試驗選用了4%PFA、Bouin固定液和Carnoy固定液進(jìn)行了對比。通過對比發(fā)現(xiàn)，4%PFA固定液無法固定卵巢卵泡液，而Bouin固定液和Carnoy固定液均能使卵巢卵泡液呈黃色黏稠狀液體，并且發(fā)現(xiàn)Bouin固定液更加適合于固定馬卵巢，耗時短、固定均勻、組織收縮小。

在石蠟切片制作過程中梯度脫水是關(guān)鍵的處理過程，一般組織過度脫水會導(dǎo)致組織發(fā)硬、蠟帶易碎無法正常制作切片，而脫水時間過短會導(dǎo)致組織柔軟、與蠟帶不相容［14，18-19］。通過查閱文獻(xiàn)，K.R.F.Lopes等［9］在驢的卵巢上采用的梯度酒精（85%、95%、100%）脫水體系為每隔1 h、二甲苯3 h透明處理獲得卵巢石蠟切片。但嚴(yán)格按照其試驗方法操作，卻無法重復(fù)其結(jié)果。本試驗先期試驗中馬卵巢組織發(fā)硬變脆，導(dǎo)致切片機(jī)無法正常制片。最終經(jīng)過多次的摸索試驗和驗證，建立了更合適本試驗的脫水透明體系。

K.A.Alves等［20］通過對14匹（5～10歲）健康母馬卵巢制作3，5，7μm不同組織、不同厚度石蠟切片發(fā)現(xiàn)，7μm切片厚度最佳，適用于馬卵巢切片。因此，本試驗選用了7μm切片厚度，發(fā)現(xiàn)卵巢石蠟切片能夠完全展開，顏色對比分明，組織結(jié)構(gòu)清晰。

S.M.Gonzalez等［8］通過未發(fā)情期馬卵巢石蠟切片，采用過碘酸雪夫反應(yīng)染色后，統(tǒng)計馬卵巢皮質(zhì)區(qū)域中腔前卵泡的分布，獲得了馬卵巢卵泡在排卵窩內(nèi)和排卵窩旁分布較多的結(jié)果。但根據(jù)本試驗結(jié)果可知，馬屬動物在發(fā)情期卵泡在卵巢皮質(zhì)中分布不均勻，主要在離排卵窩較遠(yuǎn)的皮質(zhì)當(dāng)中很密集。這種差異的原因可能與馬屬動物發(fā)情相關(guān)，有待進(jìn)一步驗證。

通過查閱大量文獻(xiàn)，尚未發(fā)現(xiàn)有人在卵巢組織上使用抽氣方法進(jìn)行浸蠟。抽氣浸蠟的好處是可以將組織內(nèi)的氣體抽出，并提高浸蠟的效果，降低組織自然產(chǎn)生氣泡的現(xiàn)象。弊端是可能會導(dǎo)致組織收縮，破壞組織原有的結(jié)構(gòu)形狀。本試驗前期結(jié)果中卵巢卵泡形狀不夠完整，失去原有的結(jié)構(gòu)形狀，是由于浸蠟抽氣壓強(qiáng)較大，從而導(dǎo)致卵泡形狀受到破壞。通過浸蠟抽氣處理的改善，浸蠟抽氣時間縮短為40 min，抽氣浸蠟的壓強(qiáng)改為0.05 Mpa，確保了卵巢卵泡形狀不受影響，從而獲得馬卵巢卵泡完整的石蠟切片標(biāo)本。

5 結(jié)論

在本試驗中，經(jīng)過對比，確定小于0.5 cm組織片段采用Bouin固定液，進(jìn)行75%酒精浸泡24 h→85%酒精浸泡1 h→95%浸泡酒精2 h→100%酒精2 h脫水；二甲苯透明劑中放置10 min×2次；純蠟與二甲苯按1∶1比例混合并浸蠟40 min→純蠟Ⅰ40 min→純蠟Ⅱ0.05 Mpa真空浸蠟40 min條件，此為制作馬卵巢組織石蠟切片的最佳體系。