謝冉，郝單麗，易紅，臧琛，陳燕軍，趙慶賀 中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700

蒲黃為香蒲科植物水燭香蒲Typha angustifoliaL.、東方香蒲Typha orientalisPresl或同屬植物的干燥花粉[1]。蒲黃的炮制方法有蒸、焙、紙包炒、炒黃、炒炭等，2015年版《中華人民共和國藥典》（一部）收載蒲黃飲片為生蒲黃和蒲黃炭，用于各類瘀血證和出 血證。研究表明，蒲黃具有降血脂、調(diào)節(jié)糖代謝、改善心腦血管功能、抗炎等作用[2-3]，有效成分主要有黃酮類化合物、鞣質(zhì)、有機(jī)酸、多糖類、烷烴類等[4]。其中，黃酮苷類成分香蒲新苷和異鼠李素-3-O-新橙皮苷含量最高[5-6]，為蒲黃質(zhì)量控制的指標(biāo)成分。

國家藥典委員會《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求（征求意見稿）》（以下簡稱《技術(shù)要求》）明確提出了“標(biāo)準(zhǔn)湯劑”概念。中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑是以中醫(yī)理論為指導(dǎo)、臨床應(yīng)用為基礎(chǔ)，參考現(xiàn)代提取方法，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化工藝制備而成的單味中藥飲片水煎劑，用于標(biāo)準(zhǔn)化臨床用藥，保障用藥的準(zhǔn)確性和劑量的一致性。中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑是在傳統(tǒng)中藥的大生產(chǎn)過程中，為保證臨床療效不降低、毒性不增加而設(shè)計的一個中間過渡對照物[7-9]。

本研究收集12批蒲黃樣品，按照《技術(shù)要求》和《中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑研究策略》[7]推薦方法制備標(biāo)準(zhǔn)湯劑，測定飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑中香蒲新苷和異鼠李素- 3-O-新橙皮苷的含量，標(biāo)定主要工藝參數(shù)，建立標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜，并進(jìn)行聚類分析和主成分分析，建立生蒲黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑的質(zhì)量評價方法，為蒲黃相關(guān)中藥制劑的質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

Agilent 1200高效液相色譜儀（HP真空脫氣泵，HP四元泵，HP自動進(jìn)樣，HP柱溫箱，HPLC-DAD檢測器），安捷倫科技有限公司；Mettler Toledo-XS105型電子分析天平，瑞士梅特勒-托利多儀器（中國）有限公司；KQ5200DE型超聲波清洗器（功率200 W，頻率40 kHz），昆山市超聲儀器有限公司；JA2003型電子天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；TG16- WS型臺式高速離心機(jī)，湖南湘儀；FE20型實(shí)驗(yàn)室pH計，Mettler-Toledo公司。

香蒲新苷（含量以97.0%計，批號111573-201405）、異鼠李素-3-O-新橙皮苷（含量以93.2%計，批號112571-201205），中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈為色譜純（Fisher），其他試劑為分析純。12批蒲黃樣品，采自河北、江蘇、內(nèi)蒙古、山東，經(jīng)中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所何希榮鑒定，為香蒲科植物水燭香蒲Typha angustifoliaL.、東方香蒲Typha orientalisPresl或同屬植物的干燥花粉，樣品來源信息見表1。

表1 蒲黃樣品來源信息

2 方法與結(jié)果

2.1 指標(biāo)成分含量測定

2.1.1 色譜條件

采用Welch XB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為乙腈-0.05%磷酸溶液（15∶85），柱溫30 ℃，流速1.0 mL/min，檢測波長254 nm。色譜圖見圖1。理論塔板數(shù)按香蒲新苷和異鼠李素-3-O-新橙皮苷峰計算應(yīng)不低于5 000。

圖1 生蒲黃飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑2種指標(biāo)成分HPLC圖

2.1.2 溶液制備

2.1.2.1 飲片供試品溶液

取生蒲黃飲片粉末（過4號篩）約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，0.45 μm濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液

稱取生蒲黃飲片100g，置于2 000 mL圓底燒瓶中，加1 200 mL水，充分潤濕，放置浸泡30 min，加熱煮沸后回流提取30 min，趁熱過濾，濾渣加1 000 mL水，回流提取20 min，趁熱過濾，合并2次濾液，60 ℃水浴濃縮至500 mL，即得0.2 g/mL生蒲黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑。精密吸取生蒲黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑1 mL，超聲處理5 min，12 000 r/min離心5 min，0.45 μm濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.1.2.3 對照品溶液制備

分別取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥36 h的香蒲新苷和異鼠李素-3-O-新橙皮苷對照品適量，精密稱定，加甲醇分別制成香蒲新苷0.94 mg/mL、異鼠李素-3-O-新橙皮苷1.0 mg/mL的溶液。取以上2種對照品溶液，混合，即得混合對照品溶液。

2.1.3 方法學(xué)考察

2.1.3.1 線性關(guān)系考察

分別精密吸取香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷對照品溶液1.0 mL，置100、50、25、10、5、2 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度。按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，分別以香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷峰面積積分值為縱坐標(biāo)，對照品進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程。香蒲新苷回歸方程Y＝444.42X－102.56，R2＝0.998 1，線性范圍為0.377 2～18.86 μg；異鼠李素-3-O-新橙皮苷回歸方程Y＝618.02X－182.41，R2＝0.998 7，線性范圍為0.403 6～20.18 μg。

2.1.3.2 精密度試驗(yàn)

取同一批生蒲黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，連續(xù)6次，測定并計算香蒲新苷和異鼠李素-3-O-新橙皮苷峰面積RSD分別為0.22%和0.29%，表明儀器精密度良好。

2.1.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密量取生蒲黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液適量，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件，分別于制備后0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，測定并計算香蒲新苷和異鼠李素-3-O-新橙皮苷峰面積RSD分別為0.46%和0.94%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.3.4 重復(fù)性試驗(yàn)

精密量取生蒲黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑適量，平行制備6份供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測定并計算香蒲新苷和異鼠李素-3-O-新橙皮苷峰面積RSD分別為0.25%和1.27%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.1.3.5 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取同一批已知含量的供試品，分別精密加入等量香蒲新苷對照品，制備供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測定，結(jié)果香蒲新苷平均回收率為100.04%，RSD＝3.05%。同法向供試品中加入異鼠李素-3-O-新橙皮苷對照品，測定并計算異鼠李素-3-O-新橙皮苷平均回收率為102.8%，RSD＝2.12%。表明本法準(zhǔn)確度良好。

2.1.4 樣品測定

2.1.4.1 指標(biāo)成分含量及轉(zhuǎn)移率測定

分別精密吸取對照品溶液20 μL、飲片供試品溶液20 μL、標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測定香蒲新苷和異鼠李素-3-O-新橙皮苷含量，計算指標(biāo)成分轉(zhuǎn)移率。轉(zhuǎn)移率（%）＝W/M×100%。式中，W為標(biāo)準(zhǔn)湯劑中的含量（mg），M為飲片中的含量（mg）。

2.1.4.2 pH值及出膏率測定

取標(biāo)準(zhǔn)湯劑，用pH計測定pH值。

精密吸取混合均勻的標(biāo)準(zhǔn)湯劑10 mL于已恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，105 ℃烘干3 h，取出，置干燥器中冷卻30 min，稱定質(zhì)量，計算出膏率。出膏率（%）＝（w×V）/（v×M）×100%。式中，M為樣品量（g），V為標(biāo)準(zhǔn)湯劑體積（mL），v為取樣體積（mL），w為取樣所得干膏量（g）。

2.1.4.3 樣品測定結(jié)果

12批生蒲黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑的平均出膏率為11.79%±1.29%，香蒲新苷的平均轉(zhuǎn)移率為79.41%±13.9%，異鼠李素-3-O-新橙皮苷的平均轉(zhuǎn)移率為58.66%±18.8%，pH值為5.4～6.4，見表2。結(jié)果表明生蒲黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量均一。所有批次樣品中香蒲新苷和異鼠李素-3-O-新橙皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)之和均大于0.5%，符合2015年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定。

表2 生蒲黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑主要指標(biāo)測定結(jié)果

2.2 標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜

2.2.1 色譜條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈為流動相A、0.05%磷酸溶液為流動相B，梯度洗脫（0～10 min，5%～10%A；10～15 min，10%～15%A；15～35 min，15%A；35～45 min，15%～31.5%A），柱溫30 ℃，流速1.0 mL/min，檢測波長254 nm。理論塔板數(shù)按香蒲新苷和異鼠李素-3-O-新橙皮苷計算應(yīng)不低于5 000。

2.2.2 對照品溶液制備

取香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷50μg的混合溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液制備

同“2.1.2.2”項(xiàng)下。

2.2.4 方法學(xué)考察

2.2.4.1 精密度考察

取同一批供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，連續(xù)6次，測定并計算4號峰峰面積，結(jié)果RSD＝0.15%，表明儀器精密度良好。

2.2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密量取標(biāo)準(zhǔn)湯劑適量，制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別于制備后0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測定，計算4號峰峰面積，結(jié)果RSD＝0.42%，表明24 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn)

精密量取生蒲黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑適量，平行制備6份供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測定并計算4號峰峰面積，結(jié)果RSD＝0.45%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.5 指紋圖譜建立

按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別精密吸取12批生蒲黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜峰信息。使用國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2004A版）對色譜圖進(jìn)行分析，以PH-01為參照圖譜，采用平均數(shù)法生成對照圖譜，時間寬度為0.10 min。標(biāo)準(zhǔn)湯劑及對照圖譜見圖2、圖3。共有峰共7個，通過對照品比對指認(rèn)2個峰，分別為4號峰香蒲新苷和5號峰異鼠李素-3-O-新橙皮苷。

圖2 12批生蒲黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜

圖3 生蒲黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜共有峰

2.2.6 相對保留時間及相對峰面積測定

對照圖譜中，7號峰面積最大，且保留時間穩(wěn)定，故選擇7號峰為參照峰，保留時間及峰面積設(shè)為1.00，計算各峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果見表3。

表3 生蒲黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜各共有峰相對保留時間和相對峰面積

2.2.7 相似度評價

采用國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2004A版）進(jìn)行相似度分析，12批標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜相似度見表4。結(jié)果表明，除PH-09外，其他11批標(biāo)準(zhǔn)湯劑具有較好的一致性。

表4 12批生蒲黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜相似度

2.2.8 聚類分析

香蒲新苷（4號峰）和異鼠李素-3-O-新橙皮苷（5號峰）為蒲黃的主要有效成分，而且分離良好，為所有樣品共有，故選擇4號峰和5號峰為變量，通過SPSS25.0軟件對12批樣品進(jìn)行聚類分析，采用Ward聯(lián)接法，以平方歐氏距離為樣本測度，12批生蒲黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑可分為3類，見圖4。PH-02、PH-04、PH-06、PH-08、PH-11、PH-12為第一類，PH-01和PH-09為第二類，PH-03、PH-05、PH-07、PH-10為第三類。

圖4 12批生蒲黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑聚類分析樹狀圖

2.2.9 主成分分析

將12批標(biāo)準(zhǔn)湯劑色譜圖中7個共有峰的峰面積導(dǎo)入SPSS25.0軟件進(jìn)行主成分分析。通過降維中的因子分析，進(jìn)行KMO和巴特利特檢驗(yàn)，KMO取樣適切性量數(shù)為0.571，KMO＞0.5且P＜0.05，表明該數(shù)據(jù)適合做因子分析。提取3個主成分因子，計算得分值、累計方差貢獻(xiàn)率、旋轉(zhuǎn)后的成分矩陣和相關(guān)系數(shù)矩陣，結(jié)果見表5～表7。主成分1、2、3的累計方差貢獻(xiàn)率達(dá)95.983%，表明這3個主成分能夠代表樣本的整體質(zhì)量。成分矩陣顯示，4號峰和5號峰對主成分1的影響最大，表明香蒲新苷和異鼠李素-3-O-新橙皮苷在蒲黃的質(zhì)量控制中具有重要作用。根據(jù)主成分分析得分圖可將生蒲黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑分成4類，PH-04、PH-05、PH-07、PH-08為一類，PH-01～PH-03、PH-10～PH-12為一類，PH-06和PH-09與其他樣品差異較大，單獨(dú)列為兩類。

表5 生蒲黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑主成分分析特征值及方差貢獻(xiàn)率

表6 各共有峰旋轉(zhuǎn)后的成分矩陣

表7 各共有峰成分得分系數(shù)矩陣

圖5 生蒲黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑主成分分析得分圖

3 討論

標(biāo)準(zhǔn)湯劑與中藥飲片臨床應(yīng)用基本屬性一致，同時能解決配方顆粒等用藥形式性狀缺失條件下的質(zhì)量控制難題。本研究基于傳統(tǒng)煎煮工藝，按照《技術(shù)要求》和《中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑研究策略》[7]推薦的制法制備標(biāo)準(zhǔn)湯劑，建立生蒲黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備方法，測定標(biāo)準(zhǔn)湯劑中香蒲新苷和異鼠李素-3-O-新橙皮苷含量，香蒲新苷轉(zhuǎn)移率為79.41%±13.9%，異鼠李素-3-O-新橙皮苷轉(zhuǎn)移率為58.66%±18.8%，出膏率為9.5%～14.5%，pH值為5.4～6.4；建立了標(biāo)準(zhǔn)湯劑HPLC指紋圖譜，確認(rèn)了7個共有峰，通過對照品比對指認(rèn)出2個色譜峰，并通過聚類分析和主成分分析，提出對生蒲黃飲片分類的方法。

水燭香蒲主要分布于江蘇、浙江、山東、安徽、湖北等省，東方香蒲產(chǎn)于貴州、山東、山西、東北各省[10]。蒲黃產(chǎn)地分布廣泛，幾乎遍布全國[11]。本研究樣品來自不同產(chǎn)地、不同廠家，基本能夠代表目前市售藥材的實(shí)際情況。12批飲片中香蒲新苷和異鼠李素-3-O-新橙皮苷總含量為0.58%～0.97%，符合2015年版《中華人民共和國藥典》（一部）要求（總含量≥0.5%）。

蒲黃藥用部位為花粉?；ǚ?、細(xì)小種子等細(xì)粉類藥材臨床使用時一般選擇包煎，否則可能漂浮于水面上，不利于有效成分的煎出，或湯劑中有細(xì)小顆和絨毛，刺激咽喉[12]。但我們發(fā)現(xiàn)，蒲黃浸泡后混懸于水中，未呈現(xiàn)漂浮狀態(tài)，能保證充分提取其有效成分，而且本工藝制備的標(biāo)準(zhǔn)湯劑中無細(xì)小顆粒或絨毛，故未采用包煎方法。此制備方法符合中醫(yī)藥傳統(tǒng)理論和臨床應(yīng)用情況，滿足工藝標(biāo)準(zhǔn)化、統(tǒng)一化的要求，可作為臨床使用的最低標(biāo)準(zhǔn)，為中藥配方顆粒、經(jīng)典名方、中藥整體質(zhì)量控制提供參考。

蒲黃有水燭香蒲、東方香蒲等多個基源，從飲片形狀上很難鑒別，基源的多樣性可能導(dǎo)致多批樣品指紋圖譜相似性低。本研究除PH-09外，其余11批樣品與對照圖譜的相似度均大于0.9。分析數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，PH-09飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑中香蒲新苷和異鼠李素-3-O-新橙皮苷的含量均低于其他樣品，可能由于此樣品質(zhì)量雖然符合藥典標(biāo)準(zhǔn)，但低于市場上飲片的平均質(zhì)量水平所致。

由標(biāo)準(zhǔn)湯劑中香蒲新苷和異鼠李素-3-O-新橙皮苷含量測定結(jié)果可知，不同產(chǎn)地樣品之間2種黃酮苷成分含量差異較大，產(chǎn)自內(nèi)蒙古的飲片中2種黃酮苷總含量平均值高于江蘇和山東飲片，這一結(jié)果與文獻(xiàn)報道[13]相似。但以2種黃酮苷色譜峰面積為變量對12批樣品進(jìn)行聚類分析或主成分分析，結(jié)果均未發(fā)現(xiàn)樣品質(zhì)量與產(chǎn)地之間的相關(guān)性?？赡艹a(chǎn)地因素外，其他如基源、藥材貯存時間等因素對樣品質(zhì)量亦有影響。聚類分析、主成分分析與指紋圖譜相結(jié)合，可為評價蒲黃飲片及其制劑的質(zhì)量提供參考。本研究結(jié)果未顯示出道地產(chǎn)區(qū)江蘇所產(chǎn)蒲黃[14]較其他樣品的優(yōu)越性。

樣品的傳統(tǒng)鑒定與DNA條形碼相結(jié)合，可以精確到物種，比較不同基源的飲片差異[7]。本研究未對樣品進(jìn)行基源鑒定至物種，基源對蒲黃飲片質(zhì)量的影響尚未可知。蒲黃成分復(fù)雜，其物質(zhì)基礎(chǔ)是多種成分構(gòu)成的，僅用香蒲新苷和異鼠李素-3-O-新橙皮苷作為指標(biāo)成分，多數(shù)共有峰未確認(rèn)，可能存在片面性，今后可選擇液質(zhì)聯(lián)用、核磁共振氫譜等方法對蒲黃飲片中的化學(xué)成分進(jìn)行指認(rèn)。臨床中還可以蒲黃細(xì)粉直接制成散劑口服或外敷[15]，標(biāo)準(zhǔn)湯劑能否作為外敷用藥的標(biāo)準(zhǔn)有待商榷。另外，與生蒲黃相比，蒲黃炭黃酮苷類成分減少，鞣質(zhì)類成分增加，鞣質(zhì)與熱解為苷元的黃酮類成分為蒲黃炭的主要有效成分[16]，因此，蒲黃炭的標(biāo)準(zhǔn)湯劑應(yīng)與生蒲黃有所差異。

綜上，本研究遵從傳統(tǒng)水煮工藝，依托現(xiàn)代檢測手段，制定了生蒲黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑的質(zhì)量評價方法，可為蒲黃配方顆粒等其他口服湯劑的質(zhì)量控制提供依據(jù)。