楊昌碧，汪靜，鄭丁

西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，四川 瀘州 646000

非酒精性脂肪性肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指除過量飲酒和其他明確導(dǎo)致肝損傷因素外所致的肝細(xì)胞內(nèi)脂肪過量沉積，是一種與胰島素抵抗和遺傳易感密切相關(guān)的代謝應(yīng)激性肝損傷[1]。NAFLD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，公認(rèn)的是以胰島素抵抗為中心的“二次打擊”學(xué)說[2]，胰島素抵抗導(dǎo)致的脂代謝紊亂及肝臟中三酰甘油（TG）過度沉積是NAFLD的發(fā)病基礎(chǔ)。有研究報(bào)道，NAFLD小鼠肝組織miR-27a表達(dá)降低，miR-27a過表達(dá)可減輕小鼠肝組織TG的含量，從而減輕脂肪肝[3]。Appari 等[4]研究發(fā)現(xiàn)，miR-27a通過參與p38MAPK磷酸化而影響其下游基因的表達(dá)。水通道蛋白9（AQP9）是肝細(xì)胞攝取甘油的特異性通道，研究發(fā)現(xiàn)NAFLD大鼠肝細(xì)胞中p38MAPK和AQP9蛋白及mRNA表達(dá)顯著升高，抑制p38MAPK表達(dá)及磷酸化可降低AQP9蛋白及mRNA的表達(dá)[5]。祛痰活血方是西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院孫同郊教授治療脂肪肝的經(jīng)驗(yàn)方，具有活血化瘀、疏肝健脾功效。前期研究發(fā)現(xiàn)，祛痰活血方可降低TG、總膽固醇（TC）水平，總有效率達(dá)88%[6]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，祛痰活血方可抑制p38MAPK信號(hào)通路，減少AQP9的表達(dá)，減少TG在肝細(xì)胞蓄積，改善NAFLD大鼠肝臟脂肪變性[7]。因此推測(cè)miR-27a可能通過調(diào)節(jié)p38MAPK信號(hào)通路影響AQP9的表達(dá)，進(jìn)而影響TG的形成。本實(shí)驗(yàn)采用高脂飼料喂養(yǎng)建立NAFLD大鼠模型，觀察祛痰活血方對(duì)大鼠肝組織miR-27a、p38MAPK及AQP9表達(dá)的影響，探討其作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物及飼料

清潔級(jí)雄性SD大鼠32只，體質(zhì)量180～200g，成都達(dá)碩生物科技有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（川）2020-24，飼養(yǎng)于溫度20～24 ℃、相對(duì)濕度50%～60%環(huán)境。高脂飼料（82%基礎(chǔ)飼料＋10%豬油＋2%膽固醇＋5%蛋黃粉＋1%膽鹽），成都達(dá)碩生物科技有限公司，許可證號(hào)SCXK（川）2020-028。

1.2 藥物及制備

祛痰活血方（法半夏10g，陳皮10g，茯苓10g，丹參15g，郁金15g，山楂15g，黃芩10g，薏苡仁15g，澤瀉15g，柴胡10g，決明子10 g），西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院藥劑科提供。將所有飲片混勻，2 500 mL蒸餾水浸泡30 min，煎煮30 min，收集藥液，藥渣再加1 000 mL蒸餾水煎煮30 min，合并2次藥液，濃縮至含原藥材2.16 g/mL，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要試劑和儀器

天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、TG、TC、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程研究所，批號(hào)分別為20200827、20200829、20200831、20200831、20200829、20200828；miRNA提取試劑盒、總RNA提取試劑盒，北京百泰克生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為RP5901、RP2401；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR?Green RT-PCR Master Mix，日本Toyobo公司，批號(hào)分別為FSQ-201、QRT-101；蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、Western一抗二抗去除液，上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為P0033-1、P0010S、P0025；AQP9、p38MAPK、p-p38MAPK、GAPDH抗體，英國(guó)Abcam公司，貨號(hào)分別為ab15127、ab170099、ab4822、ab8245；山羊抗兔IgG/HRP抗體，貨號(hào)bs-0295G-HRP，北京博奧森生物技術(shù)有限公司；ECL顯影液，美國(guó)Thermo Scientific公司，批號(hào)35055。全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad公司，型號(hào)IMARK），PCR擴(kuò)增儀（德國(guó)Eppendorf公司，型號(hào)6311000070），正置顯微鏡（日本尼康公司，型號(hào)Nikon E200），超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司，型號(hào)SW-CJ-1G），臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（上海成貫儀器有限公司，型號(hào)Eppendorf 5427R），-80 ℃超低溫冰箱（美國(guó)Thermo Scientific公司，型號(hào)Thermo705），凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司，型號(hào)BIO-RADXR）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組、造模及給藥

32只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常組6只、造模組26只，正常組予普通飼料喂養(yǎng)，造模組予高脂飼料喂養(yǎng)，均自由飲水。造模第8周，隨機(jī)處死2只造模組大鼠，取肝組織，HE染色確認(rèn)造模成功[8]。剩余成模大鼠隨機(jī)分為模型組和祛痰活血方低、中、高劑量組，每組6只。參照人與動(dòng)物給藥劑量換算公式[9]，祛痰活血方低、中、高劑量組按5.4、10.8、21.6 g/kg劑量灌胃給藥（相當(dāng)于成人日用劑量3、6、12倍），1次/d，正常組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃，給藥體積10 mL/kg。除正常組外，其余各組大鼠繼續(xù)予高脂飼料喂養(yǎng)，連續(xù)4周。

2.2 標(biāo)本采集

給藥4周后，腹腔注射1%戊巴比妥鈉（10 mL/kg）麻醉大鼠，腹部消毒，做U形切口，分離暴露腹主動(dòng)脈，取血約5 mL，室溫靜置1 h，1 370×g離心10 min，取上清液，分裝待測(cè)或-80 ℃保存。大鼠脫頸處死，快速取出肝臟，生理鹽水沖洗，吸干水分，稱重，取肝左葉浸泡于福爾馬林中，常溫固定過夜，行HE染色；取肝右外葉約1 cm×1 cm×1 cm組織行油紅O染色；余肝組織剪碎，放入凍存管中，-80 ℃冰箱保存。

2.3 肝功能檢測(cè)

取大鼠血清，全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)大鼠血清AST、ALT、TG、TC、LDL、HDL含量。

2.4 HE染色

將肝左葉用福爾馬林固定過夜，石蠟包埋，切片（厚度約5 μm）；二甲苯脫蠟，梯度乙醇（100%、90%、80%、75%）浸泡脫水；蘇木素染色，蒸餾水沖洗；伊紅染色，蒸餾水沖洗；梯度乙醇（75%、80%、90%、100%）脫水，二甲苯透明，自然晾干，中性樹膠封片，顯微鏡下進(jìn)行圖像采集。

2.5 油紅O染色

將肝右外葉用福爾馬林固定過夜；10%、20%蔗糖溶液分別浸泡1、5 h，再放入30%蔗糖溶液中4 ℃冷藏過夜；將組織置于液氮中，3～5 s后取出，重復(fù)3～4次；OCT包埋盒包埋，-20 ℃冷卻；切片（厚約7 μm），置于福爾馬林中固定10 min，蒸餾水沖洗；60%異丙醇浸洗30 s；改良油紅O染色劑染色10 min；60%異丙醇洗10 s，蒸餾水沖洗；蘇木素染色液復(fù)染1～2 min，蒸餾水沖洗，自然干燥；甘油明膠封片，顯微鏡下進(jìn)行圖像采集。

2.6 RT-PCR檢測(cè)

miRNA提取試劑盒提取肝組織miRNA；總RNA提取試劑盒提取肝組織總RNA。將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反轉(zhuǎn)錄條件：37 ℃、15 min，50 ℃、5 min，98 ℃、5 min。參照SYBR?Green RT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：95 ℃、30 s，95 ℃、5 s，60 ℃、10 s，72 ℃、15 s，共40個(gè)循環(huán)。miRNA-27a以U6為內(nèi)參，其余指標(biāo)以GAPDH為內(nèi)參，采用相對(duì)定量2-ΔΔCt法進(jìn)行分析。miR-27a引物序列：F 5’-GC GCGTTCACAGTGGCTAAG-3’，R 5’-AGTGCAGGG TCCGAGGTATT-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度142 bp；AQP9引物序列：F 5’-AAGGACGGTGCCAAGAA-3’，R 5’-AT CACGACTGCCGATGC-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度197 bp；p38MAPK引物序列：F 5’-GGACCTAAAGCCCAGC AA-3’，R 5’-CAGCCCACGGACCAAATA-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度186 bp；U6引物序列：F 5’-CTCGCTTCGGCA GCACATATACTR-3’，R 5’-ACGCTTCACGAATTTG CGTGTC-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度168 bp；GAPDH引物序列：F 5’-CC ATCCACAGTCTTCTGAGT-3’，R 5’-CCT CAAGATT GTCAGCAAT-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度141 bp。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。

2.7 Western blot檢測(cè)

提取肝組織總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白含量；等量蛋白上樣，電泳；100 V轉(zhuǎn)膜60 min；5%脫脂牛奶封閉90 min；按1∶1 000稀釋AQP9、p-p38MAPK、p38MAPK、GAPDH一抗，4 ℃孵育過夜；TBST洗膜3次，每次5 min；按1∶1 000稀釋二抗，室溫孵育1 h；TBST洗膜3次，每次5 min；滴加ECL顯影液，采用凝膠成像系統(tǒng)掃描并測(cè)定灰度值。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較用方差分析，組間比較用Q檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 祛痰活血方對(duì)模型大鼠肝功能指標(biāo)的影響

與正常組比較，模型組大鼠血清AST、ALT、TG、TC、LDL水平明顯升高（P＜0.05），HDL水平明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，祛痰活血方各劑量組大鼠血清AST、ALT、TG、TC、LDL水平明顯降低（P＜0.05），HDL水平明顯升高（P＜0.05），其中祛痰活血方高劑量組作用最明顯。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠血清AST、ALT、TG、TC、LDL、HDL水平比較（±s）

表1 各組大鼠血清AST、ALT、TG、TC、LDL、HDL水平比較（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與祛痰活血方低劑量組比較，△P＜0.05；與祛痰活血方中劑量組比較，▲P＜0.05

組別 只數(shù) AST/（U/L） ALT/（U/L） TG/（mmol/L） TC/（mmol/L） LDL/（mmol/L） HDL/（mmol/L）正常組 6 96.72± 5.61 38.68±3.60 0.76±0.06 1.50±0.10 0.81±0.08 1.17±0.09 模型組 6 177.61±12.05* 73.63±3.49* 1.58±0.05* 3.81±0.15* 1.72±0.08* 0.47±0.07* 祛痰活血方低劑量組 6 147.99±13.20# 62.35±8.22# 1.23±0.07# 2.92±0.08# 1.21±0.05# 0.85±0.11# 祛痰活血方中劑量組 6 116.69± 3.89# 44.76±7.72# 0.98±0.03# 2.53±0.14# 1.08±0.06# 1.02±0.18# 祛痰活血方高劑量組 6 105.16± 7.70#△▲ 41.31±3.37#△▲ 0.86±0.08#△▲ 1.83±0.15#△▲ 0.94±0.07#△▲ 1.11±0.11#△▲

4.2 HE染色結(jié)果

正常組大鼠肝小葉形態(tài)正常，肝細(xì)胞無明顯脂肪變性、腫脹、壞死及增生，且圍繞中央靜脈呈放射狀分布；模型組大鼠肝小葉形態(tài)欠完整，肝細(xì)胞分布紊亂，且明顯變性腫脹及脂肪變性；祛痰活血方各劑量組大鼠病變較模型組明顯減輕。見圖1。

圖1 各組大鼠肝組織形態(tài)（HE染色，×200）

4.3 油紅O染色結(jié)果

正常組大鼠肝細(xì)胞未見明顯紅色脂滴；模型組大鼠肝細(xì)胞脂滴較多，腫脹及脂肪變性明顯；祛痰活血方各劑量組大鼠可見散在分布于胞漿的紅色脂滴，細(xì)胞結(jié)構(gòu)稍紊亂，少許肝細(xì)胞脂肪變性，病變程度較模型組減輕。見圖2。

圖2 各組大鼠肝組織形態(tài)（油紅O染色，×400）

4.4 祛痰活血方對(duì)模型大鼠肝組織miR-27a、AQP9、p38MAPK mRNA表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組大鼠肝組織miR-27a mRNA表達(dá)明顯降低，AQP9、p38MAPK mRNA表達(dá)明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，祛痰活血方各劑量組大鼠肝組織miR-27a mRNA表達(dá)明顯升高，AQP9、p38MAPK mRNA表達(dá)明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中，祛痰活血方高劑量組作用最明顯（P＜0.05）。結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠肝組織miR-27a、AQP9、p38MAPK mRNA表達(dá)比較（±s）

表2 各組大鼠肝組織miR-27a、AQP9、p38MAPK mRNA表達(dá)比較（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與祛痰活血方 低劑量組比較，△P＜0.05；與祛痰活血方中劑量組比較，▲P＜0.05

組別 只數(shù) miR-27a AQP9 p38MAPK 正常組 6 1.002±0.078 1.002±0.080 1.004±0.118 模型組 6 0.480±0.127* 1.779±0.091* 1.589±0.106* 祛痰活血方低劑量組 6 0.576±0.056# 1.594±0.050# 1.314±0.050# 祛痰活血方中劑量組 6 0.778±0.087# 1.311±0.068# 1.212±0.062# 祛痰活血方高劑量組 6 0.967±0.070#△▲ 1.127±0.136#△▲ 1.032±0.114#△▲

4.5 祛痰活血方對(duì)模型大鼠肝組織水通道蛋白9和p-p38MAPK蛋白表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組大鼠肝組織AQP9和p-p38MAPK蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，祛痰活血方各劑量組大鼠肝組織AQP9和p-p38MAPK蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05），其中，祛痰活血方高劑量組降低最明顯。結(jié)果見圖3、表3。

表3 各組大鼠肝組織AQP9、p-p38MAPK蛋白表達(dá)比較（±s）

表3 各組大鼠肝組織AQP9、p-p38MAPK蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與祛痰活血 方低劑量組比較，△P＜0.05；與祛痰活血方中劑量組比較，▲P＜0.05

組別 只數(shù) AQP9/GAPDH p-p38MAPK/p38MAPK正常組 6 0.308±0.180 0.254±0.018 模型組 6 0.879±0.091* 0.609±0.106* 祛痰活血方低劑量組 6 0.649±0.058# 0.414±0.050# 祛痰活血方中劑量組 6 0.411±0.098# 0.292±0.072# 祛痰活血方高劑量組 6 0.327±0.132#△▲ 0.275±0.114#△▲

圖3 各組大鼠肝組織AQP9、p-p38MAPK蛋白免疫印跡圖

5 討論

根據(jù)臨床表現(xiàn)，NAFLD屬中醫(yī)學(xué)“肝癖”“脅痛”范疇。NAFLD患者多形體肥胖、痰濁內(nèi)生、血脈瘀滯[10]。孫同郊教授認(rèn)為痰瘀互結(jié)是其基本病機(jī)，其病因可概括為過食肥甘厚味，或久臥久坐，體內(nèi)痰盛，或七情內(nèi)傷，或先天稟賦異常等，導(dǎo)致脾虛運(yùn)化無權(quán)，肝疏泄失職，水谷精微不能正常輸化，水濕內(nèi)停，痰濁內(nèi)生，氣滯血瘀，濕痰瘀互結(jié)于肝而成[11]，多屬本虛標(biāo)實(shí)之證，以肝脾腎虛為本，痰濁、氣滯血瘀為標(biāo)。祛痰活血方為二陳湯加減而成，方中柴胡、黃芩疏肝行氣燥濕，法半夏燥濕化痰，陳皮行氣化痰，茯苓健脾利濕，薏苡仁、澤瀉健脾滲濕泄?jié)幔瑳Q明子清熱解毒，郁金、丹參、山楂活血化瘀，諸藥合用，可達(dá)理氣祛痰、活血化瘀、疏肝健脾之效。

正常情況下脂肪細(xì)胞中TG能分解為甘油和脂肪酸，釋放入血后在肝細(xì)胞內(nèi)合成TG，并與載脂蛋白、膽固醇等結(jié)合形成極低密度脂蛋白，轉(zhuǎn)運(yùn)到肝外組織儲(chǔ)存或加以利用，達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡。NAFLD的形成與肝臟中TG過度蓄積相關(guān)。Zhang等[12]發(fā)現(xiàn)，miR-27a過表達(dá)可減輕小鼠肝組織TG含量，從而減輕NAFLD。此外，研究顯示miR-27a在高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD大鼠肝組織中低表達(dá)，而p38MAPK mRNA及蛋白表達(dá)升高[13]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，祛痰活血湯能顯著減輕NAFLD大鼠肝臟脂肪變性程度，降低肝細(xì)胞凋亡指數(shù)，調(diào)節(jié)脂代謝紊亂[14]；祛痰活血方藥物血清能抑制NAFLD大鼠原代肝細(xì)胞內(nèi)p38MAPK蛋白的磷酸化，降低AQP9表達(dá)，提示p38MAPK信號(hào)通路可能是祛痰活血方治療NAFLD的關(guān)鍵通路之一[7]。本研究結(jié)果顯示，祛痰活血方可上調(diào)NAFLD大鼠肝臟miR-27a的表達(dá)，抑制p38MAPK通路激活和下調(diào)AQP9表達(dá)，減少肝臟中脂肪生成，改善肝功能，進(jìn)而減輕肝臟脂肪變性。