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        安腸愈瘍湯對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠三葉因子3蛋白表達(dá)及腸道菌群的影響

        2021-07-09 02:11:54王晗潞王帥孫大娟梁峻尉尹德菲遲莉麗
        中國中醫(yī)藥信息雜志 2021年7期
        關(guān)鍵詞:屏障結(jié)腸菌群

        王晗潞,王帥,孫大娟,梁峻尉,尹德菲,遲莉麗

        1.山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院,山東 濟(jì)南 250014;2.山東省中醫(yī)院,山東 濟(jì)南 250014

        潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)是一種慢性炎癥性疾病,其發(fā)生發(fā)展與遺傳易感性、免疫系統(tǒng)失調(diào)、腸道菌群紊亂、炎癥介質(zhì)等因素密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),腸黏膜屏障功能失調(diào)、腸道菌群紊亂在UC的發(fā)病中扮演重要角色[1-2]。三葉因子3(TFF3)是腸黏膜修復(fù)因子,可與黏蛋白相互作用,增強(qiáng)黏膜屏障功能,在保護(hù)胃腸道黏膜和潰瘍修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用[3-4]。腸道菌群失調(diào)使腸致病菌數(shù)量增多,導(dǎo)致腸黏膜通透性增加,致病菌、毒素更易通過腸黏膜,進(jìn)而引發(fā)腸道長期炎癥刺激,甚至促使結(jié)腸黏膜癌變[5-6]。因此,修復(fù)損傷腸黏膜,恢復(fù)腸道菌群平衡是治療UC的關(guān)鍵。目前,西醫(yī)治療UC的藥物主要是5-氨基水楊酸類制劑、糖皮質(zhì)激素等,雖起效快,療效確切,但易發(fā)生不良反應(yīng)。中藥在防治UC方面具有獨(dú)特優(yōu)勢,具有修復(fù)腸黏膜損傷、調(diào)節(jié)微生態(tài)等作用,可長期維持UC緩解、降低復(fù)發(fā)率[7-11]。本課題組前期從基因水平探討了安腸愈瘍湯對UC大鼠TFF3的調(diào)控作用[12],但安腸愈瘍湯對TFF3蛋白表達(dá)及腸道菌群的影響,以及TFF3與腸道菌群的相關(guān)性尚不明確。本研究在前期研究基礎(chǔ)上,進(jìn)一步觀察安腸愈瘍湯對UC大鼠TFF3蛋白的調(diào)控作用及對腸道菌群的影響,并探討TFF3與腸道菌群的關(guān)系,為中西醫(yī)結(jié)合治療UC提供依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 動物

        SPF級SD大鼠36只,雌雄各半,體質(zhì)量(200±20)g,濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動物繁育有限公司提供,動物許可證號SCXK(魯)20190003。飼養(yǎng)于山東省中醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)中心,溫度20~26 ℃,相對濕度40%~70%,進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)飼料,通風(fēng)環(huán)境。實(shí)驗(yàn)過程通過山東省中醫(yī)院動物倫理審查批準(zhǔn)(AWE-2019-002)。

        1.2 藥物及制備

        安腸愈瘍湯(黃芪30g,敗醬草30g,黃連9g,麩炒白術(shù)30g,薏苡仁30g,黃芩9g,白及12g,木香9g,檳榔15g,炒白芍12g,當(dāng)歸9g,防風(fēng)6g,地榆炭15g,甘草9 g),飲片購于山東省中醫(yī)院中藥房,浸泡3 h,武火煎煮25 min后再文火煎煮20 min,合并2次煎液,水煎濃縮為含原藥材0.375、0.75、1.5 g/mL,過濾,置于4 ℃冰箱保存;美沙拉嗪緩釋顆粒,法國Ethypharm,批號190108。

        1.3 主要試劑與儀器

        葡聚糖硫酸鈉(DSS,MP Biomedicals公司),Qiagen QIAamp糞便DNA提取試劑盒(德國Qiagen公司),16S V4區(qū)引物515F-806R(北京諾禾致源),Phusion?高保真DNA聚合酶(美國New England Biolabs公司),產(chǎn)物純化Gene JET膠回收試劑盒(美國Thermo Scientific公司),Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建庫試劑盒(美國Thermo Fisher公司),Ion S5TMXL測序系統(tǒng)(美國Thermo Scientific公司),16S V4區(qū)測序委托北京諾禾致源完成。移液器,法國GLISON公司;低溫離心機(jī),美國Thermo IEC公司;ND-1000分光光度計(jì),美國Thermo Scientific公司;化學(xué)發(fā)光圖像分析儀,日本富士公司。

        1.4 分組、造模及給藥

        大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、美沙拉嗪組和中藥低、中、高劑量組,每組6只。參考文獻(xiàn)[13]采用自由飲用4.5%DSS溶液7 d方法制備UC模型。各給藥組于飲用DSS溶液第2日起給予相應(yīng)藥物灌胃,中藥濃度為0.375、0.75、1.5 g/mL,美沙拉嗪為0.035 g/mL,空白組和模型組給予等體積蒸餾水灌胃。給藥體積均為2 mL/100g,連續(xù)2周。

        1.5 取材

        陳頤磊百思不得其解,鬼子的兇殘他是知道的,南京一役,公然違反日內(nèi)瓦條約,集中屠殺大批放下武器的國軍官兵。

        1.6 觀測指標(biāo)及檢測方法

        1.6.1 結(jié)腸黏膜組織病理學(xué)評分

        醫(yī)護(hù)英語的教學(xué)目的是培養(yǎng)具有專業(yè)學(xué)科知識又有外語技能的復(fù)合型人才,其教學(xué)逐漸成為醫(yī)學(xué)院校英語教學(xué)的一個(gè)重要組成部分。隨著大數(shù)據(jù)、人工智能時(shí)代的到來,教學(xué)與學(xué)習(xí)方式發(fā)生了翻天覆地的變化[1]。如何順應(yīng)時(shí)代潮流,利用智能互聯(lián)網(wǎng)技術(shù)來推進(jìn)醫(yī)護(hù)英語教學(xué)的創(chuàng)新和發(fā)展,提高醫(yī)護(hù)英語教學(xué)質(zhì)量和效果是醫(yī)護(hù)英語教學(xué)者所面臨的新挑戰(zhàn)。筆者在安徽中醫(yī)藥高等??茖W(xué)校一年的醫(yī)護(hù)英語教學(xué)實(shí)踐中嘗試了“智慧課堂”的教學(xué)模式,并取得了比較好的教學(xué)效果。

        參照文獻(xiàn)[14]進(jìn)行組織病理學(xué)評分,詳見表1。

        表1 大鼠結(jié)腸黏膜組織病理學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)

        各地旅游產(chǎn)品出現(xiàn)同質(zhì)化現(xiàn)象,各類旅游產(chǎn)品競爭激烈,特色化、差異化的經(jīng)營策略是持久競爭力的重要保證,在日間旅游項(xiàng)目日益飽和的情況下,夜間旅游開發(fā)實(shí)現(xiàn)了同類產(chǎn)品在不同時(shí)間段的競爭,為城市旅游開拓新的路徑[7]。在經(jīng)營時(shí)間和旅游項(xiàng)目上,合肥夜間旅游與日間旅游錯(cuò)位發(fā)展,不僅減少了旅游產(chǎn)品競爭群體,還給游客帶來特殊環(huán)境氛圍下的旅游體驗(yàn),有利于城市旅游保持持久的競爭力。

        菌群多樣性與Shannon指數(shù)成正比,模型組Shannon指數(shù)較空白組降低;中藥中、高劑量組及美沙拉嗪組較模型組升高。菌群豐度與ACE指數(shù)成正比,模型組ACE指數(shù)較空白組降低,中藥中、高劑量組及美沙拉嗪組較模型組升高。見圖4。

        1.6.3 體外糞便DNA 16S rDNA測序及質(zhì)控

        與空白組比較,模型組大鼠結(jié)腸黏膜組織病理學(xué)評分明顯升高(P<0.01);與模型組比較,各給藥組大鼠結(jié)腸黏膜組織病理學(xué)評分明顯降低(P<0.01),其中,中藥高劑量組降低最明顯。見表2。

        1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

        采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料用±s表示,符合正態(tài)分布用t檢驗(yàn),多組間比較若方差齊用方差分析,若方差不齊用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        干預(yù)結(jié)束后,收集大鼠糞便至無菌EP管,-80 ℃保存。大鼠麻醉后取距肛門1 cm以上結(jié)腸組織,沿腸系膜縱軸剪開,0.9%NaCl溶液沖洗,肉眼觀察炎癥、潰瘍情況,取病變最明顯組織約0.5 cm,4%多聚甲醛溶液固定,石蠟包埋,4 μm連續(xù)切片,HE染色,剩余結(jié)腸組織-80 ℃凍存。取材結(jié)束后,大鼠注射高濃度戊巴比妥鈉溶液進(jìn)行安樂死。

        2 結(jié)果

        2.1 病理觀察結(jié)果

        空白組大鼠結(jié)腸組織完整,未見糜爛、潰瘍;模型組大鼠結(jié)腸組織可見潰瘍,局部隱窩消失,可見大量淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤及隱窩炎;美沙拉嗪組大鼠結(jié)腸組織黏膜下層輕度水腫,可見少量炎性細(xì)胞浸潤;中藥低劑量組大鼠結(jié)腸組織仍可見潰瘍、隱窩炎,伴大量淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤;中藥中劑量組大鼠結(jié)腸組織潰瘍愈合,組織輕度水腫,可見少量淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤;中藥高劑量組大鼠結(jié)腸組織潰瘍愈合,固有層輕度水腫,少量炎性細(xì)胞浸潤。見圖1。

        1.6.2 Western blot檢測三葉因子3蛋白表達(dá)

        圖1 各組大鼠結(jié)腸組織形態(tài)(HE染色,×200)

        2.2 病理學(xué)評分結(jié)果

        采用CTAB方法對樣本的基因組DNA進(jìn)行提取,利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度,取適量的樣本DNA置于離心管,使用無菌水稀釋樣本至1 ng/μL。以稀釋后的基因組DNA為模板,根據(jù)測序區(qū)域的選擇,使用帶Barcode的特異引物、Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer和高保真DNA聚合酶進(jìn)行PCR,確保擴(kuò)增效率和準(zhǔn)確性。PCR產(chǎn)物使用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳;根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣,充分混勻后使用1×TAE濃度2%瓊脂糖膠電泳純化PCR產(chǎn)物,剪切回收目標(biāo)條帶。使用Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建庫試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建,經(jīng)Qubit定量和文庫檢測合格后,使用Ion S5TMXL測序系統(tǒng)測序。利用Uparse軟件對所有樣品的全部Clean Reads進(jìn)行聚類,默認(rèn)以97%一致性將序列聚類為OTUs,進(jìn)行物種注釋分析(閾值0.8~1),使用R軟件繪制稀釋曲線、物種累積曲線,使用Qiime軟件計(jì)算Shannon指數(shù)、ACE指數(shù),并統(tǒng)計(jì)門、屬水平OTU聚類情況,進(jìn)行相對豐度分析。

        表2 各組大鼠結(jié)腸黏膜組織病理學(xué)評分比較(±s)

        表2 各組大鼠結(jié)腸黏膜組織病理學(xué)評分比較(±s)

        注:與空白組比較,##P<0.01;與模型組比較,**P<0.01

        組別 只數(shù) 病理學(xué)評分 空白組 6 2.50±2.07 模型組 6 15.33±1.51## 中藥低劑量組 6 9.50±2.51** 中藥中劑量組 6 5.33±1.16** 中藥高劑量組 6 1.83±1.60** 美沙拉嗪組 6 2.83±1.17**

        2.3 安腸愈瘍湯對模型大鼠三葉因子3表達(dá)的影響

        詳參拙作《陸游的雙面形象及其詩文之形態(tài)與觀念》,《陸游與鑒湖》,61-72頁,人民出版社2011年12月。

        眾所周知,16世紀(jì)以來釣魚島就屬于中國領(lǐng)土,而非日本長期侈談的“無主島嶼”。而現(xiàn)在的釣魚島問題之所以成為“問題”,完全是由于日本的血腥侵略造成的。

        圖2 各組大鼠結(jié)腸組織TFF3蛋白表達(dá)比較(±s,每組6只)

        2.4 腸道菌群測序質(zhì)量評估結(jié)果

        觀察稀釋曲線,曲線隨著測序深度的增加而逐漸平坦,提示測序深度足夠。觀察物種累積箱形圖,曲線隨著樣品量的增加而逐漸平坦,提示樣品量足夠。見圖3。

        圖3 腸道菌群測序質(zhì)量評估

        2.5 腸道菌群多樣性、豐度分析結(jié)果

        大鼠結(jié)腸組織裂解,離心,取上清液,電泳,轉(zhuǎn)膜,取出NC膜,平皿1×PBST洗2遍,5%脫脂牛奶封閉過夜,加TFF3一抗、二抗孵育,漂洗后顯影、定影,圖像分析。

        與空白組比較,模型組大鼠結(jié)腸組織TFF3蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01);與模型組比較,各給藥組大鼠結(jié)腸組織TFF3蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05,P<0.01),其中,中藥高劑量組升高最明顯。見圖2。

        圖4 各組大鼠腸道菌群Shannon指數(shù)、ACE指數(shù)箱型圖

        2.6 大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)組成

        門水平上優(yōu)勢菌門為厚壁菌門Firmicutes、擬桿菌門Bacteroidetes,見圖5。各組F/B比值由低到高依次為空白組(1.17)<中藥高劑量組(1.20)<美沙拉嗪組(1.28)<中藥中劑量組(1.38)<中藥低劑量組(1.72)<模型組(1.94),見表3。屬水平上優(yōu)勢菌屬前2位分別為擬桿菌屬Bacteroides、乳桿菌屬Lactobacillus。模型組較空白組擬桿菌屬豐度升高,乳桿菌屬豐度下降;與模型組比較,各給藥組擬桿菌屬豐度下降,乳桿菌屬豐度升高。見圖6。

        圖6 各組大鼠腸道菌群屬水平豐度柱形累加圖

        表3 各組大鼠腸道菌群F/B比值比較

        圖5 各組大鼠腸道菌群門水平豐度柱形累加圖

        3 討論

        UC治療目標(biāo)從最初的“癥狀改善和臨床緩解”逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)椤罢T導(dǎo)并維持臨床緩解及黏膜愈合”[15-16]。恢復(fù)正常腸黏膜屏障功能是治療UC的關(guān)鍵,腸黏膜屏障由機(jī)械屏障、生物屏障、免疫屏障、化學(xué)屏障共同構(gòu)成[17]。TFF3在機(jī)械屏障中發(fā)揮重要作用,可刺激血管表皮生長因子表達(dá),促進(jìn)血管生成,修復(fù)腸上皮[18]。研究表明,TFF3是UC黏膜愈合的生物標(biāo)志物之一[19]。腸道菌群作為生物屏障,可促進(jìn)腸道相關(guān)淋巴組織發(fā)育及腸道免疫細(xì)胞分化,保護(hù)腸道[20]。菌群豐度、多樣性減少,可使腸道屏障功能受損而引發(fā)UC。F/B比值被認(rèn)為是評估腸道菌群紊亂的關(guān)鍵參數(shù)。研究發(fā)現(xiàn),在急性UC發(fā)病過程中F/B比值顯著升高[21]。擬桿菌屬為致病菌,當(dāng)腸道菌群失調(diào)后,可誘導(dǎo)免疫反應(yīng),引起大量炎性細(xì)胞聚集在腸黏膜[5]。乳桿菌屬為益生菌,能維護(hù)腸黏膜屏障穩(wěn)定[22]。研究發(fā)現(xiàn),UC患者糞便中致病菌如腸球菌、擬桿菌等數(shù)量增多[23]。正常大鼠腸道菌群以乳酸菌屬、普雷沃氏菌屬等有益菌為主,UC大鼠埃希氏-志賀菌屬、擬桿菌屬等致病菌占主要優(yōu)勢[24]。

        中醫(yī)理論認(rèn)為,脾氣虧虛、邪毒濕熱,濕熱蘊(yùn)腸,導(dǎo)致UC的發(fā)生發(fā)展,本課題組基于以上病機(jī)自擬安腸愈瘍湯以健脾益氣、化濕解毒、理氣止血。

        本研究結(jié)果顯示,各給藥組TFF3蛋白表達(dá)較模型組上調(diào),且呈劑量依賴性,同時(shí)發(fā)現(xiàn)各給藥組腸道菌群豐度、多樣性均有提升,益生菌增加,致病菌減少。由此推測,中藥復(fù)方可促使腸黏膜修復(fù)因子上調(diào),恢復(fù)腸道菌群多樣性,增加益生菌的同時(shí)減少致病菌,從而修復(fù)腸黏膜。

        三是對以“合同”之名行“行政”之實(shí)不服的救濟(jì)方式。出讓人在出讓合同中將一些實(shí)為行政行為,通過合同約定為合同行為或者出讓人在行使合同權(quán)利時(shí),借 “合同”之名,行“行政強(qiáng)制”之實(shí)運(yùn)用國家強(qiáng)制力實(shí)施的一些行為,因這些行為本質(zhì)上屬于行政行為,受讓人可通過行政復(fù)議、行政訴訟的方式進(jìn)行救濟(jì)。如合同約定出現(xiàn)違約行為時(shí)收回開采權(quán)、注銷采砂許可證、停業(yè)整頓等。

        TFF3與腸道菌群關(guān)系密切,其與黏蛋白相互作用形成腸上皮黏液層作為保護(hù)膜,可限制共生菌在黏膜內(nèi)層定植,抑制腸道菌群與腸上皮接觸,有效阻止腸微生物等對組織損傷,還為腸道菌群與宿主共生狀態(tài)提供環(huán)境條件,為腸道菌群提供營養(yǎng)物質(zhì)及結(jié)合位點(diǎn)[25]。當(dāng)TFF3分泌減少,黏液層變薄或消失,腸黏膜通透性增加,細(xì)菌或其代謝產(chǎn)物穿過腸黏膜表面黏液層,粘附于腸上皮細(xì)胞,導(dǎo)致腸道微生物群的移位和免疫系統(tǒng)的激活對組織產(chǎn)生損傷[26]。安腸愈瘍湯是間接通過影響TFF3表達(dá)進(jìn)而調(diào)控腸道菌群,抑或直接對腸道菌群產(chǎn)生影響,有待今后進(jìn)一步研究。

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