陳博威，鄭飄，易健，劉柏炎，3

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410007； 3.益陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，湖南 益陽(yáng) 413000

新生兒缺血缺氧性腦?。╪eonatal hypoxic- ischemic encephalopathy，HIE）是圍產(chǎn)期常見(jiàn)疾病，可導(dǎo)致嬰兒腦癱、癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)疾病甚至死亡。目前西醫(yī)以亞低溫及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)治療為主[1]。中醫(yī)在整體觀念和辨證論治原則指導(dǎo)下，其多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)、整體調(diào)節(jié)方式在HIE療效與安全性方面具有一定優(yōu)勢(shì)。六味地黃湯為傳統(tǒng)補(bǔ)腎名方，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、代謝、增殖的作用[2]。本課題組前期通過(guò)對(duì)“腎通于腦”理論進(jìn)行挖掘，認(rèn)識(shí)到腎在腦的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中占有重要地位，為六味地黃湯治療HIE提供了理論基礎(chǔ)[3-5]。臨床研究顯示，六味地黃湯可改善腦血流量、降低血黏度[6]。但既往研究均針對(duì)單一靶點(diǎn)與單一機(jī)制，無(wú)法系統(tǒng)闡明六味地黃湯治療HIE的分子機(jī)制。 目前，由長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）、微小RNA（miRNA）及mRNA組成的轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)越來(lái)越受到重視。lncRNA不能直接編碼翻譯蛋白質(zhì)，但在轉(zhuǎn)錄后水平上，可作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA（ceRNA），通過(guò)特異性海綿吸附miRNA的方式，間接減少miRNA與下游靶基因的結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因的調(diào)控[7]。既往研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中特異表達(dá)，并廣泛參與對(duì)大腦發(fā)育、神經(jīng)分化、突觸可塑性、認(rèn)知與記憶功能的調(diào)控[8]。目前，lncRNA及miRNA的表達(dá)譜已在HIE疾病中被發(fā)現(xiàn)，提示其可能對(duì)HIE的疾病發(fā)展起重要作用[9-10]。基于前期研究認(rèn)識(shí)，本研究通過(guò)生物信息學(xué)手段，輔以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)，挖掘六味地黃湯治療HIE的活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)及l(fā)ncRNA-miRNA-mRNA三元轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)，以期闡明該方多途徑、多靶點(diǎn)協(xié)同作用的分子機(jī)制，并為后續(xù)基礎(chǔ)和臨床研究提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 六味地黃湯活性成分篩選與作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

運(yùn)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php）獲取六味地黃湯組方藥物熟地黃、山藥、茯苓、山茱萸、牡丹皮、澤瀉的活性成分。依據(jù)藥物的藥動(dòng)學(xué)特性，以口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18為條件[11]篩選活性成分。在該數(shù)據(jù)庫(kù)中輸入各活性成分，查詢其潛在作用靶點(diǎn)，并通過(guò)Perl軟件（https://www. perl.org）將靶點(diǎn)導(dǎo)入U(xiǎn)niprot數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www. uniprot.org），獲取靶點(diǎn)官方基因名。

1.2 疾病差異表達(dá)lncRNA、miRNA、mRNA挖掘

從基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)（GEO，https://www.ncbi.nlm. nih.gov/geo）下載編號(hào)為GSE121178的基因原始矩陣文件，該基因數(shù)據(jù)來(lái)自揚(yáng)州大學(xué)，包含3個(gè)HIE新生兒的全血標(biāo)本和3個(gè)正常新生兒的全血標(biāo)本，基因芯片平臺(tái)為GPL22120（http://www.affymetrix.com）。通過(guò)Perl軟件和R語(yǔ)言（https://www.r-project.org），以Log2（FC）的絕對(duì)值＞1.5和P＜0.05為篩選條件進(jìn)行基因數(shù)據(jù)挖掘，得出差異表達(dá)lncRNAs。借助Mircode數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.mircode.org）預(yù)測(cè)lncRNA結(jié)合的miRNA。將得到的miRNA結(jié)果映射到miRDB（http://mirdb.org）、miRTarBase（http://mirtarbase.mbc. nctu.edu.tw）、TargetScan（http://www.targetscan.org）數(shù)據(jù)庫(kù)，預(yù)測(cè)miRNA靶向調(diào)控的mRNA。

1.3 活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)及l(fā)ncRNA-miRNA-mRNA轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過(guò)Perl軟件將HIE疾病預(yù)測(cè)的mRNA與六味地黃湯預(yù)測(cè)靶點(diǎn)取交集，得到六味地黃湯治療HIE可能涉及的活性成分及關(guān)鍵lncRNAs、miRNAs、mRNAs，運(yùn)用Cytoscape3.7.0軟件構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)及l(fā)ncRNA-miRNA-mRNA三元轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)。將上述關(guān)鍵mRNAs輸入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org/），并將物種設(shè)定為“homo sapiens”，最低互作得分設(shè)置為0.4，得到蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。

1.4 關(guān)鍵作用靶點(diǎn)GO功能及KEGG通路富集分析

運(yùn)用R語(yǔ)言Biomanager、ClusterProfiler軟件包對(duì)得到的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能及KEGG通路富集分析。GO功能富集分析可描述基因產(chǎn)物可能形式的分子功能、參與的生物過(guò)程和所處的細(xì)胞環(huán)境。KEGG通路富集分析通過(guò)將已知的基因組注釋信息進(jìn)行分類，得出最顯著的生物學(xué)過(guò)程。

1.5 分子對(duì)接分析

先用ChemOffice16.0軟件將六味地黃湯主要活性化合物的3D結(jié)構(gòu)保存為.mol2格式并使其能量最小化。從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.rcsb.org/）下載主要靶點(diǎn)3D結(jié)構(gòu).pdb格式，運(yùn)用PyMOL軟件（https:// www.pymol.org）對(duì)蛋白進(jìn)行去水、加氫等操作，利用Auto Dock 4.2軟件將化合物及靶蛋白格式轉(zhuǎn)換為.pdbqt格式，最后進(jìn)行分子對(duì)接。一般認(rèn)為，結(jié)合能＜-5 kcal/mol時(shí)，配體與受體可實(shí)現(xiàn)較好結(jié)合[12]。

2 結(jié)果

2.1 六味地黃湯活性成分及作用靶點(diǎn)

通過(guò)TCMSP和Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)得到六味地黃湯活性成分，其中熟地黃2個(gè)、山茱萸13個(gè)、山藥12個(gè)、牡丹皮6個(gè)、澤瀉7個(gè)、茯苓6個(gè)，合并重復(fù)項(xiàng)后得到活性成分41個(gè)，潛在作用靶點(diǎn)194個(gè)，見(jiàn)表1。

表1 六味地黃湯活性成分

2.2 疾病差異lncRNA、miRNA、mRNA

基于GSE121178的基因芯片共得出217個(gè)差異基因（見(jiàn)圖1A），運(yùn)用Perl軟件篩選出31個(gè)差異lncRNAs（見(jiàn)圖1B）。將差異表達(dá)的31個(gè)lncRNAs輸入Mircode數(shù)據(jù)庫(kù)，預(yù)測(cè)到546個(gè)lncRNA-miRNA的調(diào)控關(guān)系。通過(guò)miRDB、miRTarBase、TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)得到miRNA的靶向mRNA。為保證結(jié)果可靠，本研究?jī)H選取被3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)同時(shí)預(yù)測(cè)到的共1 900個(gè)miRNA-mRNA調(diào)控關(guān)系。

圖1 HIE疾病GEO芯片差異表達(dá)基因

2.3 活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)及l(fā)ncRNA-miRNA-mRNA轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)

將預(yù)測(cè)到的靶向mRNAs與六味地黃湯作用靶點(diǎn)取交集，得到有效成分33個(gè)，藥物-疾病關(guān)鍵lncRNAs 13個(gè)，關(guān)鍵miRNAs 20個(gè)，關(guān)鍵mRNAs 33個(gè)。運(yùn)用Cytoscape3.7.0軟件構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖2?；钚猿煞职垂?jié)點(diǎn)度大小依次有槲皮素（Quercetin，MOL000098）、山柰酚（Kaempferol，MOL000422）、(+)-兒茶素（(+)-Catechin，MOL000492）、薯蕷皂苷元（Diosgenin，MOL000546）等，見(jiàn)表2。由13個(gè)關(guān)鍵lncRNAs、20個(gè)關(guān)鍵miRNAs、33個(gè)關(guān)鍵mRNAs構(gòu)成的三元轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)見(jiàn)圖3。其中，H19與miR-17-5p分別在lncRNA組及miRNA組的靶基因數(shù)目最多，見(jiàn)表3。借助STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，隱去無(wú)相互作用的蛋白后，繪制包含31個(gè)節(jié)點(diǎn)和198條邊的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，其中，節(jié)點(diǎn)度居前列的核心作用基因有MYC、JUN、VEGFA、CCND1、ESR1、MAPK1、PTGS2、FOS、MAPK8、CDKN1A等，見(jiàn)圖4。

圖4 六味地黃湯治療HIE蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)與核心作用基因

表3 六味地黃湯治療HIE三元轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)主要基因及其靶點(diǎn)

圖2 六味地黃湯活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

表2 六味地黃湯主要活性成分節(jié)點(diǎn)度

圖3 六味地黃湯治療HIE lncRNA-miRNA-mRNA轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)

2.4 關(guān)鍵靶點(diǎn)富集分析

對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能及KEGG通路富集分析，共獲得679個(gè)GO功能富集結(jié)果，其中分子功能主要富集在轉(zhuǎn)錄因子活性與DNA、RNA聚合酶活性等，生物過(guò)程主要富集在對(duì)激素、氧濃度反應(yīng)等，細(xì)胞組分主要富集在RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物及核轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物上。KEGG通路富集分析得到107條通路，主要包括PI3K-Akt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路及Wnt信號(hào)通路。此外，還可能涉及調(diào)控細(xì)胞衰老、細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡等，提示六味地黃湯治療HIE與多條通路、多個(gè)生物過(guò)程有關(guān)。見(jiàn)圖5、表4。

表4 六味地黃湯治療HIE關(guān)鍵靶點(diǎn)KEGG通路富集分析主要通路及相關(guān)基因

圖5 六味地黃湯治療HIE關(guān)鍵靶點(diǎn)GO功能及KEGG通路富集分析

2.5 分子對(duì)接結(jié)果

將六味地黃湯治療HIE節(jié)點(diǎn)度值排名居前列的槲皮素、山柰酚、(+)-兒茶素及薯蕷皂苷元等活性成分與主要KEGG通路PI3K-Akt信號(hào)通路的2個(gè)標(biāo)志蛋白PIK3CA（PBD ID：2RD0）、AKT1（PBD ID：1H10-1）進(jìn)行分子對(duì)接。結(jié)果顯示各活性成分與PIK3CA、AKT1的結(jié)合能均小于-5 kcal/mol，表明其均能與靶點(diǎn)較好結(jié)合，其中薯蕷皂苷元分別與2個(gè)靶點(diǎn)的結(jié)合能最低，見(jiàn)表5、圖6。

表5 六味地黃湯中主要活性成分的分子對(duì)接結(jié)合能

圖6 薯蕷皂苷元與PIK3CA、AKT1分子對(duì)接示意圖

3 討論

HIE發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，其腦損傷為多重因素、多種機(jī)制交互作用發(fā)生的“瀑布式”病理變化，包括神經(jīng)細(xì)胞能量代謝障礙、神經(jīng)炎性毒性損傷等[1]，因此單一藥物或措施無(wú)法逆轉(zhuǎn)其病理改變。中藥具有多組分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，能夠?qū)膊〉牟煌±憝h(huán)節(jié)發(fā)揮協(xié)同作用，為治療HIE提供了新思路。根據(jù)HIE臨床表現(xiàn)，可將其歸屬中醫(yī)學(xué)“初生不啼”“胎搐”等范疇，主要病機(jī)為先天精血虧虛，胎元不足?；凇澳I藏精，精生髓，髓聚腦”的“腎腦相關(guān)”理論，治以補(bǔ)腎固本、填精益髓，六味地黃湯為代表方劑。既往研究表明，六味地黃湯能清除HIE大鼠腦組織內(nèi)的氧自由基，并能通過(guò)調(diào)控低氧誘導(dǎo)因子-1α的基因表達(dá)，促進(jìn)HIE大鼠病變腦組織的修復(fù)[13]。

本研究發(fā)現(xiàn)，六味地黃湯中槲皮素、山柰酚、(+)-兒茶素及薯蕷皂苷元等活性成分與HIE疾病密切相關(guān)，另外通過(guò)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)MYC、JUN、VEGFA、CCND1、ESR1及MAPK1等可能是蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵蛋白。相關(guān)研究亦證實(shí)了上述成分及靶點(diǎn)的作用，如槲皮素能抑制HIE大鼠的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，并促進(jìn)神經(jīng)再生[14-15]；山柰酚具有抑制神經(jīng)炎性損傷及保護(hù)血腦屏障的作用[16]；(+)-兒茶素能通過(guò)改善能量代謝及拮抗神經(jīng)毒性的方式，改善缺血缺氧神經(jīng)元活性[17]；薯蕷皂苷元能通過(guò)抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化降低炎癥反應(yīng)，減輕腦損傷[18]。關(guān)鍵蛋白中的FOS與MAPK1屬于應(yīng)激蛋白激酶，在神經(jīng)系統(tǒng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有重要作用，廣泛參與神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化等生理過(guò)程[19]。CCND1屬細(xì)胞周期家族，具有調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、分裂與死亡的作用[20]。VEGFA為血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子家族成員，與大腦缺血缺氧后的血管新生密切相關(guān)[21]。ESR1是一種雌激素受體，有研究表明ESR1具有維持神經(jīng)系統(tǒng)正常功能的作用[22]。此外，分子對(duì)接結(jié)果顯示主要活性成分均能與標(biāo)志靶點(diǎn)較好結(jié)合，一定程度上驗(yàn)證了本研究的準(zhǔn)確性。

在KEGG通路富集分析結(jié)果中，居前列的PI3K-Akt信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路是大腦缺血缺氧后的重要調(diào)控通路，與氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)及凋亡等病理過(guò)程密切相關(guān)[23-24]。PI3K-Akt通路是調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、代謝及存活的經(jīng)典通路，并且廣泛參與了許多中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病[25]。研究表明，HIE新生兔模型中PI3K-Akt通路被激活，并抑制神經(jīng)元的凋亡[26]，阻斷PI3K-Akt通路則會(huì)誘導(dǎo)腦內(nèi)炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡，加重神經(jīng)功能損害[27]。有實(shí)驗(yàn)顯示，在腦缺血后活化的MAPK通路會(huì)激活Nrf2通路，而補(bǔ)腎中藥能夠抑制MAPK通路的磷酸化，扭轉(zhuǎn)Nrf2核移位，減少氧化應(yīng)激[28]；亦有研究發(fā)現(xiàn)，MAPK信號(hào)通路與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，其在大腦缺血后可激活下游的NF-κB通路，促進(jìn)炎癥反應(yīng)[29]，而抑制MAPK通路活化則可以減輕炎癥反應(yīng)，具有神經(jīng)保護(hù)作用[30]。此外，IL-17信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路為腦損傷后主要的炎癥反應(yīng)通路[31]。前期研究顯示，腦損傷后會(huì)導(dǎo)致腦內(nèi)炎癥“級(jí)聯(lián)反應(yīng)”產(chǎn)生，而六味地黃湯能夠抑制炎癥反應(yīng)，減輕腦損傷[4]。Wnt信號(hào)通路則是腦損傷后神經(jīng)再生的重要調(diào)控通路[32]。綜上，六味地黃湯治療HIE的作用機(jī)制與多條通路、多個(gè)生物過(guò)程存在一定的聯(lián)系，這與中醫(yī)標(biāo)本兼治的整體觀念相吻合，同時(shí)體現(xiàn)了中藥復(fù)方多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)的治療特點(diǎn)。

基于生物信息學(xué)技術(shù)，本研究初步構(gòu)建了六味地黃湯治療HIE的lncRNA-miRNA-mRNA轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)，其中，H19和miR-17-5p分別在lncRNA組及miRNA組節(jié)點(diǎn)度值最高，且miR-17-5p可以靶向調(diào)控KEGG通路富集居前列的PI3K-Akt通路及MAPK通路中MAPK1、CCND1、CDKN1A等多個(gè)基因。lncRNA H19與中樞神經(jīng)系統(tǒng)聯(lián)系密切，有研究顯示其在大腦缺血后表達(dá)顯著增加，并且與美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院卒中量表（NIHSS）評(píng)分及腫瘤壞死因子-α表達(dá)水平呈正相關(guān)[33]；敲除lncRNA H19則會(huì)抑制腦缺血后的炎癥反應(yīng)，并促進(jìn)神經(jīng)再生[34]。lncRNA H19還能作為ceRNA海綿吸附miR-17-5p[35]，且敲除lncRNA H19可上調(diào)miR-17-5p的表達(dá)[36]。miR-17-5p不僅能在腦缺血后抑制下游PTEN基因表達(dá)進(jìn)而磷酸化PI3K-Akt通路，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[37]，還能通過(guò)抑制下游p38-MAPK表達(dá)水平，減少HIE大鼠的神經(jīng)細(xì)胞凋亡[38]。此外，有研究顯示miR-17-5p能夠通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)等方式促進(jìn)HIE大鼠的神經(jīng)修復(fù)[39]。上述研究表明，lncRNA H19/miR-17-5p網(wǎng)絡(luò)是一個(gè)與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)及修復(fù)有密切聯(lián)系的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，據(jù)此推測(cè)六味地黃湯治療HIE過(guò)程中，lncRNA H19可能作為ceRNA海綿參與miR-17-5p對(duì)下游各類基因的調(diào)控，進(jìn)而具有影響神經(jīng)修復(fù)的作用。

綜上所述，本研究運(yùn)用生物信息學(xué)及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，初步探討了六味地黃湯治療HIE的有效成分及其潛在作用靶點(diǎn)，并構(gòu)建了lncRNA-miRNA-mRNA三元轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)靶基因與大腦缺血缺氧后的氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)及凋亡等病理過(guò)程密切相關(guān)，還預(yù)測(cè)lncRNA H19/miR-17-5p軸可能是其重要ceRNA調(diào)控軸，并進(jìn)行了分子對(duì)接驗(yàn)證，可為六味地黃湯的臨床運(yùn)用和實(shí)驗(yàn)研究提供依據(jù)和方向?？紤]到中藥活性成分在煎煮過(guò)程中及進(jìn)入體內(nèi)可能發(fā)生的復(fù)雜變化，有必要通過(guò)后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。