何韜，毛艷，顧政一

1.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011；2.新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，新疆 烏魯木齊 830004

過敏性鼻炎（allergic rhinitis，AR）是一種常見的非特異性炎癥疾病，臨床以陣發(fā)性噴嚏、清水樣鼻涕、鼻癢和鼻塞為主要癥狀。AR引起的相關(guān)并發(fā)癥（如支氣管哮喘、中耳炎等）可導(dǎo)致食欲減退、乏力、情緒失調(diào)、記憶力減退和睡眠障礙等，嚴重影響患者的生活質(zhì)量，已成為全球性的健康問題[1]。

芩蒿滴鼻劑是維吾爾醫(yī)經(jīng)典驗方制劑，由新疆一枝蒿、蒼耳子、白芷、麻黃和黃芩5味藥組成，具有抗炎、抗過敏等藥理作用，功效清熱解毒、通鼻竅[2]。方中君藥新疆一枝蒿可清熱解毒、散瘀消腫、抗過敏、抗菌，常用于治療過敏性疾病、感冒等[3]。芩蒿滴鼻劑目前缺乏藥效學(xué)研究，相關(guān)研究停留于藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和工藝優(yōu)化方面，系統(tǒng)研究芩蒿滴鼻劑治療AR的靶點和作用機制具有重要意義。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)基于生物信息學(xué)理論，結(jié)合藥動學(xué)、基因組學(xué)等多學(xué)科，通過網(wǎng)絡(luò)模型可視化分析，闡釋藥物有效成分和作用機制。本研究以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法為基礎(chǔ)，結(jié)合分子對接技術(shù)，深入研究芩蒿滴鼻劑治療AR的主要活性成分和核心靶點，闡述其可能的作用機制，為后續(xù)實驗和臨床研究奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 芩蒿滴鼻劑化學(xué)成分收集

檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺（TCMSP，https://tcmspw.com/tcmsp.php）及萬方數(shù)據(jù)知識服務(wù)平臺、中國知識資源總庫，分別以“新疆一枝蒿”“蒼耳子”“白芷”“麻黃”和“黃芩”為關(guān)鍵詞，收集芩蒿滴鼻劑的化學(xué)成分。

1.2 活性成分及靶點蛋白篩選

根據(jù)藥物體內(nèi)ADME過程，借助TCMSP篩選新疆一枝蒿、蒼耳子、白芷、麻黃、黃芩化學(xué)成分中口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18的活性成分。將獲得的活性成分導(dǎo)入DrugBank數(shù)據(jù)庫（http://www.drugbank.ca/），獲得其作用靶點，并利用Uniprot（http://www.uniprot.org/）進行靶點信息核查及整理。采用Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建藥物-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)。

1.3 疾病相關(guān)靶點檢索

以“allergic rhinitis”為關(guān)鍵詞，利用DrugBank（http://www.drugbank.ca/）、DisGenet（http://www. disgenet.org/）、TTD（http://db.idrblad.org/ttd/）及PharmGKB（http://www.pharmgkb.org/）數(shù)據(jù)庫進行檢索，獲得AR疾病相關(guān)靶點。

1.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將篩選到的藥物和疾病靶點上傳到在線韋恩圖（http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html），獲得交集靶點，將其輸入STRING在線分析工具（http://string-db.org），選取combined_score＞0.4的靶點作為核心靶點，導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件，繪制蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)。

1.5 GO和KEGG富集分析

將上述核心靶點輸入DAVID6.8數(shù)據(jù)庫（https:// david.ncifcrf.gov/home.jsp），設(shè)定條件為P＜0.05和FDR＜0.05，進行GO功能和KEGG通路富集分析。采用Omishare Tools（http://www. omicshare.com/tools/ index.php/）將分析結(jié)果可視化。

1.6 分子對接

應(yīng)用AutoDock vina軟件將PPI網(wǎng)絡(luò)中度值前5位的靶點分別與度值前5位的活性成分進行分子對接驗證。分別從PDB蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫和ZINC數(shù)據(jù)庫下載受體的晶體結(jié)構(gòu)和配體的化學(xué)結(jié)構(gòu)，MAPK1、IL6、TNF、PTGS2和VEGFA對應(yīng)的PDB ID分別為4FV7、1ALU、5MU8、5IKR和6FMC，采用AutoDock Tools對上述蛋白受體和配體進行預(yù)處理，再用其Autogrid模塊得到對接活性位點，進行分子對接。結(jié)合能＜-5.0 kcal/mol的成分與靶點結(jié)合性能較好。

2 結(jié)果

2.1 藥物活性成分

共檢索到新疆一枝蒿、蒼耳子、白芷、麻黃、黃芩化合物895個，其中查閱文獻[3-4]獲得新疆一枝蒿化合物58個，通過TCMSP獲得化合物分別為蒼耳子108個、白芷223個、麻黃363個和黃芩143個。基于OB≥30%、DL≥0.18，并去除缺少靶點預(yù)測信息的化合物，共篩選出83個活性成分，其中新疆一枝蒿12個、蒼耳子11個、白芷22個、麻黃23個、黃芩31個。芩蒿滴鼻劑主要活性成分信息見表1。

表1 芩蒿滴鼻劑主要活性成分信息

2.2 藥物-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)

由83個活性成分及其對應(yīng)的273個靶點構(gòu)建的藥物-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)見圖1。該網(wǎng)絡(luò)包括361個節(jié)點、1 443條相互作用關(guān)系。

圖1 芩蒿滴鼻劑藥物-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)

2.3 疾病相關(guān)靶點

通過TTD、DrugBank、DisGenet、PharmGKB數(shù)據(jù)庫分別檢索到17、16、446、9個與AR相關(guān)靶點，刪除重復(fù)靶點，得到AR相關(guān)靶點473個。

2.4 藥物與疾病蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

將芩蒿滴鼻劑活性成分靶點與AR相關(guān)靶點取交集，獲得51個交集靶點。構(gòu)建交集靶點PPI網(wǎng)絡(luò)，并進行節(jié)點參數(shù)拓撲分析，去除3個與其他蛋白無相互作用的蛋白質(zhì)，結(jié)果見圖2。其關(guān)聯(lián)的化合物共63個，包括新疆一枝蒿10個、麻黃15個、白芷12個、蒼耳子4個、黃芩26個。借助Cytoscape3.7.2軟件對藥物-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)及PPI網(wǎng)絡(luò)進行Merge，得到其交集網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。運用Network Analyzer插件對化合物和靶點按度值從大到小排序，度值居前10位的化合物及靶點見表2、表3。

表2 芩蒿滴鼻劑治療AR關(guān)鍵化合物（前10位）

表3 芩蒿滴鼻劑治療AR核心靶點（前10位）

圖2 芩蒿滴鼻劑治療AR關(guān)鍵靶點PPI網(wǎng)絡(luò)

2.5 GO和KEGG通路富集分析

核心靶點GO分析包括生物過程（biological process）、分子功能（molecular function）和細胞組分（cellular component）三部分，結(jié)果見圖3?？梢钥闯?，芩蒿滴鼻劑治療AR的生物過程主要有刺激性應(yīng)答、新陳代謝過程等，分子功能主要包括結(jié)合反應(yīng)、酶催化活性等，細胞組分主要包含細胞膜、蛋白復(fù)合物等。

圖3 芩蒿滴鼻劑治療AR核心靶點GO富集分析

KEGG富集分析共得到128條通路，前20條顯著富集（P＜0.05）的通路見圖4，涉及HIF-1信號通路、IL-17信號通路、TNF信號通路等。

圖4 芩蒿滴鼻劑治療AR核心靶點KEGG通路富集分析

2.6 芩蒿滴鼻劑主要成分與核心靶點分子對接

選取“2.4”項下度值排名前5位的靶點和化合物，分別進行分子對接驗證，結(jié)果見表4。配體與受體結(jié)合的構(gòu)象穩(wěn)定時，能量越低其結(jié)合可能性越大。結(jié)合能＜-5.0 kcal/mol表明其結(jié)合良好，結(jié)合能越小其結(jié)合性越好[5]?？梢钥闯觯@5種活性成分與靶點蛋白結(jié)合性能均較好。其中，木犀草素與MAPK1結(jié)合性最好。木犀草素與MAPK1的活性位點ASPA165等形成氫鍵作用力，與CYSA164形成π-烷基相互作用，見圖5。

圖5 木犀草素與MAPK1分子對接示意圖

表4 芩蒿滴鼻劑關(guān)鍵化合物與核心靶點結(jié)合能（kcal/mol）

3 討論

基于系統(tǒng)生物學(xué)理論的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，突破了單一成分作用單一靶點的局限，強調(diào)對疾病實施多靶點、多途徑的調(diào)節(jié)方式[6]，適用于研究由多種可用數(shù)據(jù)庫和軟件支持的復(fù)雜中藥制劑的藥效成分和作用機理[7]。本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)平臺，篩選出芩蒿滴鼻劑中83個活性成分，這些化合物可能是芩蒿滴鼻劑發(fā)揮藥效的重要成分。槲皮素可以緩解AR相關(guān)癥狀，通過抑制巨噬細胞一氧化氮（NO）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）及白細胞介素-6（IL-6）產(chǎn)生，起到抗炎作用[8-9]。漢黃芩素可抑制炎癥相關(guān)酶或下調(diào)促炎基因表達，減少炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，改善炎癥相關(guān)癥狀[10]。木犀草素、山柰酚、豆甾醇等被證實具有抗炎活性和免疫調(diào)節(jié)作用[11-13]。本研究結(jié)果與上述文獻報道一致，表明基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選藥物活性成分的方法具有一定的可行性。

通過活性成分與疾病靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)和GO富集分析，發(fā)現(xiàn)芩蒿滴鼻劑抗AR涉及的生物過程可能與細胞增殖、刺激性應(yīng)答、趨化因子和免疫反應(yīng)有關(guān)。研究表明，這些生物過程均參與了AR的發(fā)生發(fā)展[14]。通過活性成分與疾病靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)篩選出10個核心靶點。其中，VEGFA是一種刺激血管內(nèi)皮細胞增殖的糖蛋白，通過促進血管通透性調(diào)控呼吸道炎癥反應(yīng)。血管內(nèi)皮生長因子不僅能夠調(diào)節(jié)鼻黏膜組織中趨化因子水平，還能阻止嗜酸性粒細胞和肥大細胞浸潤，降低炎性細胞因子水平[15]。此外，MAPK1是調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的重要因子。MAPK1是一種絲裂原活化蛋白激酶，通過對細胞的增殖、分化進行調(diào)控，進而發(fā)揮相應(yīng)的抗炎作用[16]。

從KEGG通路富集分析結(jié)果可知，芩蒿滴鼻劑治療AR主要通過調(diào)控HIF-1信號通路、IL-17信號通路、TNF信號通路、NF-κB信號通路和NOD樣受體信號通路等，表明芩蒿滴鼻劑治療AR主要與調(diào)節(jié)炎癥因子、趨化因子介導(dǎo)的信號通路及免疫應(yīng)答有關(guān)。HIF-1是缺氧狀態(tài)下能特異性發(fā)揮活性的轉(zhuǎn)錄因子，在肥大細胞浸潤引起低氧調(diào)節(jié)中具有重要作用[17]。IL-17是Th17細胞分泌的一種促炎癥細胞因子，具有多種生物學(xué)活性。研究發(fā)現(xiàn)，IL-17能通過刺激靶細胞釋放炎癥細胞因子及調(diào)控中性粒細胞的細胞因子發(fā)揮作用，誘導(dǎo)IL-6、NO和前列腺素E2產(chǎn)生，同時上調(diào)γ-干擾素、TNF-α和CD40配體等炎癥細胞因子的基因表達，促進局部炎癥的發(fā)生發(fā)展[18]。NOD樣受體是天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分，能識別病原微生物的一些結(jié)構(gòu)，如胞漿中的細菌肽聚糖片段、細菌脂多糖和病毒雙鏈RNA等，通過驅(qū)動NF-κB、MAPK和MyD88依賴性通路的激活、細胞因子的產(chǎn)生，參與微生物感染引發(fā)的炎癥和免疫應(yīng)答[19]。本研究結(jié)果還顯示，顯著富集的信號通路中存在著調(diào)控其他部位的通路，如AGE-RAGE信號通路、癌癥信號通路、腸道炎癥信號通路等，表明芩蒿滴鼻劑可能通過多種代謝途徑發(fā)揮協(xié)同治療AR的作用。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接方法對芩蒿滴鼻劑的活性成分、關(guān)鍵靶點及其治療AR的作用機制進行探討，分析結(jié)果初步驗證了芩蒿滴鼻劑的藥效基礎(chǔ)，主要成分及靶點均顯示具有較好的結(jié)合性能，可為芩蒿滴鼻劑治療AR提供一定依據(jù)，并為后期實驗設(shè)計提供思路和方法。