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        CKS1siRNA聯(lián)合化療藥物對舌癌Tca8113細胞中CKS1蛋白表達影響的研究

        2015-02-24 03:42:43徐亞娟,李兆東,高元奇
        中國實驗診斷學(xué) 2015年7期
        關(guān)鍵詞:長春新堿舌癌氟尿嘧啶

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        CKS1siRNA聯(lián)合化療藥物對舌癌Tca8113細胞中CKS1蛋白表達影響的研究

        徐亞娟1,李兆東2,高元奇2,張叢笑3,倫志軍3,畢崇才3,劉文書3*

        (1.吉林省腫瘤醫(yī)院,吉林 長春130012;2.吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,吉林 長春130021;

        3.吉林大學(xué)第一醫(yī)院,吉林 長春130021)

        舌癌是口腔頜面部常見的惡性腫瘤,治療效果不理想。目前,舌癌的治療主要是以手術(shù)和放、化療為主[1],其中化療是目前有效綜合治療舌癌的一個重要的方法,但化療藥物的應(yīng)用存在耐藥和毒副作用等,限制了其用量和時間[2,3]。近年來的研究表明[4],腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是細胞周期調(diào)控因子異常導(dǎo)致的細胞周期紊亂,因此,尋找有關(guān)的調(diào)控因子,并將其作為目的基因與放化療相結(jié)合,對腫瘤治療具有重要意義。

        CKS1是細胞周期蛋白依賴性激酶的亞基,能與其他細胞周期蛋白激酶和磷酸化蛋白結(jié)合,參與細胞周期調(diào)控,與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[5]。現(xiàn)在的研究擬通過CKS1 siRNA轉(zhuǎn)染Tca8113細胞并加用化療藥物,以觀察CKS1 siRNA對化療藥物的增效作用。

        1材料與方法

        1.1 實驗材料

        人舌癌Tca8113細胞系購自北京博楓科生物科技有限公司,DMEM培養(yǎng)液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。平陽霉素(哈爾濱萊博通藥業(yè)有限公司),順鉑(山東羅欣藥業(yè)股份有限公司),氟尿嘧啶(修正藥業(yè)集團股份有限公司),長春新堿(浙江海正藥業(yè)股份有限公司),胰蛋白酶(蘇州新寶制藥有限公司)。

        1.2 實驗方法

        1.2.1細胞培養(yǎng)人舌癌Tca8113細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在5% CO2、37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞生長至90%匯合時,用0.25%胰酶(含1% EDTA)消化,經(jīng)離心后制成單細胞懸液,以1∶4比例傳代,取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

        1.2.2CKS1 siRNA 轉(zhuǎn)染CKS1 siRNA有意義鏈:5’-UGGAGGAAUCUUGGCGUUCUUTT-3’;對照鏈:5’-UUCUUCGAACGUGUCACGUTT-3’由上海GenePharma公司合成,同時對siRNA序列進行2'Ome修飾(穩(wěn)定化學(xué)結(jié)構(gòu))和5'FAM修飾(綠色熒光),具體實驗操作嚴格按GenePharma siRNA-MateTM和siRNA-MateTM轉(zhuǎn)染試劑盒進行。

        1.2.3化療藥物對Tca8113細胞的作用將Tca8113細胞培養(yǎng)于96孔板,細胞分為:空白組、轉(zhuǎn)染組、平陽霉素組、順鉑組、氟尿嘧啶組、長春新堿組、平陽霉素+siRNA組、順鉑+siRNA組、氟尿嘧啶+siRNA組、長春新堿+siRNA 組共10組,每組3個復(fù)孔。細胞以每孔5×103個接種于96孔培養(yǎng)板,在37℃、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h。轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染聯(lián)合化療藥物組細胞先進行CKS1-siRNA轉(zhuǎn)染,濃度為10 nM;其他各組正常培養(yǎng)。24 h后,藥物組分別加入4種藥物,具體濃度梯度按表1進行。

        表1 4種化療藥物的配制濃度

        加藥后繼續(xù)在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,然后每孔加MTT溶液(5 mg/mL)20 μl,37℃孵育4 h,棄培養(yǎng)液后再加入150 μl DMSO,震蕩10 min,于酶標儀(490 nm波長)測定各孔吸光值(OD值),計算抑制率并根據(jù)公式計算轉(zhuǎn)染前后各組細胞的半致死量(IC50),同時根據(jù)半致死量的值用于后續(xù)實驗。

        1.2.4化療藥物對轉(zhuǎn)染后Tca8113細胞的CKS1蛋白表達水平檢測細胞培養(yǎng)及操作方法同前。然后收集細胞,提取蛋白質(zhì)并對蛋白質(zhì)進行定量和變性,通過常規(guī)SDS-PAGE和Western blot對轉(zhuǎn)染后給予不同化療藥物的Tca8113細胞CKS1蛋白表達進行檢測。

        2結(jié)果

        2.1 轉(zhuǎn)染前后4種化療藥物對Tca8113細胞的半數(shù)致死量

        實驗結(jié)果如表2所示,轉(zhuǎn)染CKS1 siRNA后,各化療藥物對Tca8113細胞的半致死劑量明顯低于未轉(zhuǎn)染組,其中以順鉑組差異更明顯。

        2.2 轉(zhuǎn)染后4種化療藥物對Tca8113細胞CKS1蛋白表達水平的影響

        圖像經(jīng)Imagej軟件分析灰度值,進行半定量分析。各組之間的比值差異2倍以上認定為有顯著性差異。實驗結(jié)果如表3、圖1所示,轉(zhuǎn)染后再加入4種不同化療藥物的Tca8113細胞CKS1蛋白水平顯著下降,與對照和轉(zhuǎn)染siRNA組比較均有顯著性差異(P<0.05),其中,藥物聯(lián)合siRNA協(xié)同作用對CKS1蛋白水平影響的強度由弱到強依次為:氟尿嘧啶聯(lián)合siRNA,平陽霉素聯(lián)合siRNA,長春新堿聯(lián)合siRNA,順鉑聯(lián)合siRNA。

        表2 轉(zhuǎn)染前后四種化療藥物對Tca8113細胞的

        表3 藥物聯(lián)合siRNA對Tca8113細胞Cks1蛋白水平的影響

        —:轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體的對照組; N:轉(zhuǎn)染siRNA組; Cks:Cks1 siRNA轉(zhuǎn)染組;1:順鉑聯(lián)合siRNA組;

        2:平陽霉素聯(lián)合siRNA組;3:長春新堿聯(lián)合siRNA組;4.氟尿嘧啶聯(lián)合siRNA組

        圖1藥物聯(lián)合siRNA對Tca8113細胞Cks1蛋白水平的影響

        3討論

        惡性腫瘤的目前基因治療有如抑癌基因的附加、癌基因的抑制等[6],但由于腫瘤發(fā)病的多基因和多因素等原因,使基因治療的應(yīng)用受到限制。因此,將抗腫瘤相關(guān)基因與現(xiàn)在治療方法相結(jié)合使其能更好地發(fā)揮療效,是提高化療藥物對舌癌的敏感性的一個重要途徑。

        2001年Ganoth等[7]首次發(fā)現(xiàn)cks1蛋白具有促進p27蛋白泛素化降解功能。P27被認為是一種抑癌基因。此外還具有調(diào)節(jié)腫瘤的耐藥、促進凋亡、誘導(dǎo)分化等作用。張秀梅等[8]應(yīng)用免疫組化和流式細胞術(shù)對肝癌和胃腺癌中的CKS1及CKS1、P27蛋白進行檢測,發(fā)現(xiàn)在腫瘤中CKS1的表達增高,P27的表達降低,且與淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移、浸潤程度等有關(guān)。最近研究發(fā)現(xiàn)[9],CKS1對細胞周期各個時相G1、S、G2、M期都有作用,其可能促進G2/M期的細胞周期激酶抑制劑P27的集聚。本研究結(jié)果提示,轉(zhuǎn)染后細胞的半數(shù)致死劑量明顯低于轉(zhuǎn)染前,藥物聯(lián)合siRNA轉(zhuǎn)染的Tca8113細胞的CKS1蛋白表達顯著下降,表明藥物聯(lián)合siRNA轉(zhuǎn)染可有效抑制CKS1蛋白表達,可能通過防止p27蛋白泛素化降解,抑制腫瘤發(fā)展。為應(yīng)用CKS1 siRNA治療舌癌的研究提供了進一步實驗的證據(jù)。

        參考文獻:

        [1]You YH,Chen WL,Wang YP,et al.Reverse facial-submental artery island flap for the reco nstuction of Maxillary defects after cancer abcation[J].J Craniofac Surg,20009,20(6):2217.

        [2]張書怡,陳永輝.VDP方案術(shù)前誘導(dǎo)化療治療舌癌的近期療效觀察[J].齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2011,32(12):1900.

        [3]汪躍平,游云華,梁軍,等.順鉑-碘化油懸乳膠液經(jīng)數(shù)字減影血管造影舌動脈栓塞化療對晚期舌癌的臨床病理分析[J].中華臨床醫(yī)師雜志,2010,4(9):1658.

        [4]詹啟敏,陳杰.細胞周期與腫瘤轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)[J].中國腫瘤臨床,2014,41(1):1.[5]陳紫萱,黃如欣,張忠英,等.CKS1蛋白在惡性腫瘤中的研究進展[J].檢驗醫(yī)學(xué)與臨床,2009,6(9):705.

        [6]武媛,張壯,潘劍.Rac1基因RNAi慢性病毒載體的構(gòu)建與鑒定[J].中國組織工程研究,2012,16(20):3763.

        [7]Ganoth D,Boinstein G,Ko T,et al.The cell-cycle regulatory protein cks1 is required for SCF skp2-mediated ubiquitinylation[J].Nat Cell Biol,2001,3(3):321.

        [8]張秀梅,顧金松,劉曙,等.老年肝細胞癌中的表達及臨床意義[J].中國腫瘤外科雜志,2013,5(4):239.

        [9]Hoellein A,Graf S,Bassermann F,et al.Cks1 promotion of S phaseentry and proliferation is dependent of p27kip1 suppression[J].Mol cell Biol,2012,32(13):2416.

        (收稿日期:2015-02-08)

        文章編號:1007-4287(2015)07-1054-03

        *通訊作者

        基金項目:吉林省發(fā)展和改革委員會資助(JF2012C006-8)

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