邵靚，陳弟詩*，陳斌，盧先東，鄧飛，張毅，劉艷紅，周莉媛，李麗

(1. 四川省動物疫病預(yù)防控制中心，四川 成都 610041；2. 寧波愛基因科技有限公司，浙江 寧波 315100)

非洲豬瘟(African swine fever，ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，發(fā)病率和死亡率可達(dá)100%。目前尚無有效疫苗。被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列為法定報告疫病，被我國列為一類傳染病[1-2]。到目前為止，我國共發(fā)生非洲豬瘟疫情190余起，覆蓋全國31個省份。根據(jù)非洲豬瘟防控新形勢，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部正在逐步建立常態(tài)化防控機制。當(dāng)前，各養(yǎng)殖企業(yè)、屠宰場、無害化處理場等場所，以及各級獸醫(yī)主管部門、動物疫病防控和衛(wèi)生監(jiān)督機構(gòu)等都在廣泛開展非洲豬瘟實驗室檢測，亟需大量敏感、快速、操作簡便的檢測試劑。

微流控芯片技術(shù)是通過生物學(xué)、化學(xué)、醫(yī)學(xué)、電子、材料、機械等多學(xué)科交叉，將樣品前處理、分離及檢測等過程集成到幾平方厘米的芯片上，從而實現(xiàn)分析的微型化、自動化、集成化和便攜化的技術(shù)，具有樣品消耗少、檢測速度快、操作簡便、多功能集成、體積小和便于攜帶等優(yōu)點，極大地拓展了體外診斷的應(yīng)用空間，已在分子生物學(xué)、化學(xué)分析、醫(yī)學(xué)等多個領(lǐng)域得到應(yīng)用[3-5]。本研究評估了微流控芯片法在ASFV核酸快速檢測中的各項性能，并和市場上的ASFV熒光定量PCR檢測試劑盒進(jìn)行比對分析，為ASF的快速檢測提供了新手段，也為我省ASF的防控提供了技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

磁珠法核酸提取試劑盒購自天隆生物科技有限公司；明日達(dá)ASFV微流控芯片快速檢測試劑盒由寧波愛基因科技有限公司提供；ASFV熒光定量PCR檢測試劑盒購自哈爾濱國生生物科技股份有限公司。

1.2 樣品

ASFV VP72質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)由中國動物疫病預(yù)防控制中心提供。

豬瘟病毒(CSFV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)和偽狂犬病毒(PRV)培養(yǎng)物由四川省動物疫病預(yù)防控制中心提供。

ASFV臨床樣品為采集自四川養(yǎng)殖場、屠宰場的豬全血、口鼻拭子、環(huán)境拭子，共43份。

1.3 病毒核酸提取

按照磁珠法核酸提取試劑盒說明書提取各檢測樣本核酸，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 微流控芯片檢測系統(tǒng)

本研究采用了預(yù)埋好特異性擴增引物的微流控芯片(如圖1A)，擴增靶基因為ASFV VP72。芯片由4個獨立單元構(gòu)成，每個單元由2個加樣孔和8個反應(yīng)槽構(gòu)成，每個加樣孔與 4個反應(yīng)槽相連，但加樣孔之間以及反應(yīng)槽之間不連通。將核酸和反應(yīng)液混勻后加入加樣孔，用透明膜密封加樣孔，利用離心力定向驅(qū)動樣本流動進(jìn)入反應(yīng)池(圖1B，綠色部分所示)，樣本可以均勻分配到4個反應(yīng)孔；放入微流控芯片檢測儀恒溫擴增(如圖1C)；經(jīng)過實時熒光讀取，信號輸出，呈現(xiàn)結(jié)果。當(dāng)待檢樣品在30 min內(nèi)擴增出特異性曲線，判為ASFV核酸陽性；當(dāng)待檢樣品在30 min內(nèi)未擴增出特異性曲線，判為ASFV核酸陰性。

A. 微流控芯片；B. 微流控芯片的加樣孔、微通道和檢測孔結(jié)構(gòu)；C. 微流控恒溫擴增儀

1.5 敏感性試驗

將ASFV VP72質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行梯度稀釋后，用ASFV微流控芯片法檢測，分析該方法的敏感性，并與熒光定量PCR結(jié)果進(jìn)行比較。

1.6 特異性試驗

采用CSFV、PEDV、TGEV、PCV2、PRV培養(yǎng)物樣本，分析ASFV微流控芯片特異性，ASFV VP72質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為陽性對照。

1.7 重復(fù)性試驗

用稀釋到2.5和5×101copies/μL的ASFV VP72質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為重復(fù)性測試試驗的樣本，用微流控芯片法和熒光定量PCR法同時進(jìn)行檢測，重復(fù)8次。計算微流控芯片測得的2種濃度樣本CV值，評估該方法的重復(fù)性。

1.8 臨床樣本檢測

收集43份臨床樣本，采用微流控芯片法進(jìn)行檢測，并與熒光定量PCR法進(jìn)行對比，分析結(jié)果，并計算符合率。

2 結(jié)果

2.1 ASFV微流控芯片敏感性

采用梯度稀釋的ASFV VP72質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(5×103、5×102、5×101、25、5、2.5、1.0、0.5、0.05 copies/μL)，分析ASFV微流控芯片的檢測敏感性，結(jié)果如圖2、表1所示，微流控芯片的最低檢出限是2.5 copies/μL，與市場上商品化的熒光定量PCR試劑盒的敏感性一致。

1～9. 分別為5×103、5×102、5×101、25、5、2.5、1.0、0.5和0.05 copies/μL

2.2 ASFV微流控芯片特異性

如圖3所示，除陽性對照出現(xiàn)明顯“S型”擴增曲線外，其他樣本檢測結(jié)果均為陰性，表明該ASFV微流控芯片與其他病原無交叉反應(yīng)，特異性良好。

2.3 ASFV微流控芯片重復(fù)性

用稀釋到2.5 copies/μL的ASFV VP72質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為重復(fù)性測試試驗樣本時，3次陽性，5次陰性(圖4A、表2)，微流控芯片法和熒光定量PCR法結(jié)果一致；用稀釋到5×101copies/μL的ASFV VP72質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為重復(fù)性測試試驗樣本時，8次結(jié)果均為陽性(圖4B、表2)，微流控芯片法和熒光定量PCR法結(jié)果一致。計算微流控芯片測得的2種濃度樣本CV值，結(jié)果表明2.5 copies/μL的測試樣本和5×101copies/μL的測試樣本的CV值分別為2.1%和2.2%(表3)，重復(fù)性良好。

表1 ASFV微流控芯片與熒光定量PCR敏感性測試結(jié)果

1. ASFV VP72質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；2～6. 分別為CSFV、PEDV、TGEV、PCV2、PRV培養(yǎng)物

A. 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度2.5 copies/μL；B. 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度5×101 copies/μL

表2 ASFV微流控芯片與熒光定量PCR重復(fù)性測試結(jié)果

表3 ASFV微流控芯片檢測重復(fù)性的CV值

2.4 臨床樣本檢測分析

如表4所示，微流控芯片法與熒光定量PCR法對43份臨床樣品的檢測陽性率分別為檢測結(jié)果符合率為97.67%(42/43)，不符合的1份樣本為環(huán)境拭子樣品，熒光定量PCR法檢測為陰性，而微流控芯片法為陽性。

表4 微流控芯片與熒光定量PCR對臨床樣本的檢測

3 討論

熒光定量PCR是目前生產(chǎn)實踐中用于檢測ASFV最常見的一類方法。與常規(guī)PCR相比，具有快速、敏感的特點，最低檢出限可達(dá)幾個到幾十個病毒拷貝。盡管如此，熒光定量PCR反應(yīng)需在不同的溫度區(qū)循環(huán)，對儀器要求高；微量加樣步驟多，對操作專業(yè)要求高；出結(jié)果時間較久；且成本也相對高昂。環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(LAMP)方法由日本學(xué)者Notomi等[6]發(fā)明，是一種核酸恒溫擴增技術(shù)，只需水浴鍋或恒溫箱等簡單設(shè)備即能開展實驗，并通過在反應(yīng)體系中加入特殊物質(zhì)使得反應(yīng)結(jié)果肉眼可見，具有靈敏度高、操作簡單、反應(yīng)時間短、臨床使用不需要特殊儀器等優(yōu)點，特別適合在現(xiàn)場和基層部門應(yīng)用。從目前國內(nèi)學(xué)者建立的ASFV的LAMP檢測方法來看，該方法具有較高的核酸檢測敏感性以及良好的特異性[7-8]。ASFV微流控芯片檢測是在已有的LAMP擴增基礎(chǔ)上結(jié)合Exo-NAT技術(shù)的一種新的恒溫擴増技術(shù)，擴增時間僅需要30 min，同時敏感性提高了3～4倍，近年來得到許多研究者的青睞[9]。

本次試驗運用微流控芯片法和熒光定量PCR法對ASFV標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、臨床樣本和其他病毒培養(yǎng)物樣本進(jìn)行檢測，結(jié)果表明微流控芯片檢測方法的敏感性、重復(fù)性和特異性等性能不低于熒光定量PCR方法，符合對ASFV診斷的要求。在敏感性方法，ASFV微流控芯片法可實現(xiàn)2.5 copies/μL的最低檢出限；在特異性方面，該方法對CSFV、PEDV、TGEV、PCV2和PRV等5種病毒培養(yǎng)物均未出現(xiàn)交叉反應(yīng)；同時，該方法具有良好的檢測重復(fù)性；運用該方法與熒光定量PCR法對臨床樣本進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果符合率為97.67%，不符合的一份樣本檢測結(jié)果熒光定量PCR法為陰性，而微流控芯片法為陽性，提示微流控芯片法可能具有更高的檢出率。此外，由于ASFV微流控芯片法檢測時間短，不需要溫度循環(huán)，檢測儀便于攜帶和運輸?shù)忍攸c，特別適合于現(xiàn)場快速檢測和基層部門應(yīng)用。

本次試驗僅對ASFV微流控芯片快速檢測試劑盒及ASFV熒光定量PCR檢測試劑盒的某一批號做了簡要比較分析，如有條件，需擴大樣本量，進(jìn)一步驗證ASFV微流控芯片快速檢測試劑盒的各項性能，為政府監(jiān)管部門、食品生產(chǎn)企業(yè)、畜牧水產(chǎn)養(yǎng)殖企業(yè)的相關(guān)病原體檢測及監(jiān)控提供有力工具。同時，隨著微流控和基因芯片等新技術(shù)開始不斷應(yīng)用于動物疫病檢測領(lǐng)域，未來ASFV病原學(xué)檢測將更加快速、準(zhǔn)確及自動化，必會進(jìn)一步為ASF防控提供有效支持。