徐明暢，聞雙全，王莉，張文華，鄒輝，顧建紅，劉學(xué)忠，卞建春，劉宗平，袁燕*

(1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；2.江蘇高校動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009)

鎘(cadmium, Cd)為一種重金屬元素，鎘對動物及人體危害較大，可引起呼吸系統(tǒng)、骨骼、泌尿系統(tǒng)、血液循環(huán)系統(tǒng)等的嚴(yán)重?fù)p傷。20世紀(jì)40年代以來，鎘隨著其他金屬的開采而釋放進(jìn)入環(huán)境中，工業(yè)的發(fā)展也使鎘的排放量愈發(fā)增加[1]。直至現(xiàn)在，重金屬鎘在大氣、飲水、土壤等環(huán)境中的蓄積量劇增，加之其生物蓄積性強(qiáng)、蓄積時間持久的特性，導(dǎo)致鎘對人體及動物體的危害已成為令人棘手的問題。鎘對人畜機(jī)體的危害可通過其對各組織臟器的損傷來實(shí)現(xiàn)，其中包括對肝、腎、腦、睪丸、骨骼等的損傷作用。鎘進(jìn)入機(jī)體后迅速分布于各組織臟器，其中絕大多數(shù)進(jìn)入肝臟和腎臟[2]。腎臟是鎘慢性毒性的靶器官，鎘在腎臟中的半衰期最多能達(dá)到30年[3]。鎘能造成近端腎小管和腎小球的損傷，使其對尿液的重吸收下降，引起低分子量蛋白尿癥、氨基酸尿癥、碳酸氫鹽尿癥、糖尿病等[3]。體外試驗(yàn)表明，鎘致使腎小管上皮細(xì)胞活性氧(ROS)水平升高，在體內(nèi)大量聚積從而造成氧化損傷[4]。

葛根素(puerarin, Pur)又稱葛根黃素，為一種單體化合物，化學(xué)名為4,7-二羥基8-β-D吡喃葡萄糖醛基異黃酮，相對分子質(zhì)量416。葛根素的藥理學(xué)應(yīng)用包括抵抗心律失常、降血壓、舒張血管、增加腦血流量、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、改善血脂水平、治療糖尿病、降低眼壓和解酒等[5]。葛根素對腎臟具有保護(hù)效應(yīng)，這體現(xiàn)在能降低過高的血糖[6]，改善腎小球?yàn)V過功能和代謝紊亂等[7]。目前有研究指出葛根素能降低鎘致腎上皮細(xì)胞和血清中的ROS升高，并提高機(jī)體抗氧化能力、減少腎臟內(nèi)脂質(zhì)過氧化的生成與蓄積，保護(hù)腎臟免受過氧化損傷[8]。然而，葛根素對于鎘造成的腎臟損傷的作用尚未闡明。因此，本試驗(yàn)旨在通過體內(nèi)試驗(yàn)，研究鎘暴露對大鼠腎臟的毒性損傷作用和葛根素的保護(hù)效應(yīng)，為臨床上葛根素防治鎘暴露引起的腎臟損傷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

清潔級健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠36只，體重(70±5)g，由江蘇大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供。

1.2 主要試劑

葛根素(Sigma, USA)；醋酸鎘(CdAc2, 國產(chǎn)分析純)；羧甲基纖維素鈉(索萊寶科技有限公司)；丙二醛(MDA)、還原性谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；BCA蛋白質(zhì)量濃度測定試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)；標(biāo)準(zhǔn)蛋白(新賽美生物科技有限公司)。

1.3 動物分組與處理

將36只SD雄性大鼠于安靜清潔干燥的室溫(22±2)℃環(huán)境中預(yù)飼養(yǎng)21 d，預(yù)飼養(yǎng)后稱重并將其隨機(jī)分為4組，分別為對照組(Con)、鎘組(Cd)、葛根素組(Pur)、鎘與葛根素共處理組(Cd+Pur)。葛根素組、鎘與葛根素共處理組每天灌胃葛根素200 mg/kg體重(用0.5%羧甲基纖維素鈉溶解)，其他組灌胃相同劑量的0.5%羧甲基纖維素鈉，灌胃14 d后，在灌胃的同時，鎘組、鎘與葛根素共處理組用50 mg/L鎘自由飲水。處理90 d后，稱重，每只大鼠按60 mg/kg體重的劑量肌肉注射戊巴比妥鈉麻醉，斷頸處死大鼠，分離完整腎臟。腎臟分離背膜，從腎臟剝離出皮質(zhì)并剪碎，放入凍存管中，置-80 ℃冰箱，待用。

1.4 病理切片制作與HE染色

將分離的完整腎臟在固定液中浸泡24 h，取出后用手術(shù)刀進(jìn)行切割，使用脫水機(jī)梯度酒精脫水、二甲苯透明，石蠟浸泡并包埋。用切片機(jī)切片后滴加30%酒精，后移入40 ℃恒溫水浴使其完全展開，再貼附于載玻片上，并經(jīng)烤片機(jī)烘干。經(jīng)二甲苯脫蠟、蒸餾水漂洗后，分別用蘇木素染色、鹽酸酒精分色、自來水沖洗、氨水返藍(lán)、伊紅染色、酒精脫色脫水、二甲苯透明，最后用中性樹膠封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察(日本尼康公司)。

1.5 測定氧化損傷相關(guān)指標(biāo)

測定腎臟皮質(zhì)內(nèi)GSH、MDA含量和GSH-Px、SOD、CAT活性，根據(jù)南京建成生物工程研究所檢測試劑盒的說明書進(jìn)行操作。

1.6 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用數(shù)據(jù)分析軟件SPSS 24.0對檢測結(jié)果進(jìn)行顯著性t檢驗(yàn)和單因素方差(ANOVA)統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 腎臟病理組織學(xué)觀察

對照組(圖1A)和葛根素組(圖1B)大鼠腎組織染色均勻，腎小球形態(tài)結(jié)構(gòu)未見明顯異常；鎘組(圖1C)大鼠腎組織可見較多腎小管上皮細(xì)胞顆粒變性(黑色箭頭)，胞質(zhì)疏松淡染，可見刷狀緣脫落(藍(lán)色箭頭)，少數(shù)血管周圍可見較多炎性細(xì)胞浸潤(紅色箭頭)；與鎘組相比，鎘與葛根素共處理組(圖1D)病變有所減輕，腎小球形態(tài)結(jié)構(gòu)未見明顯異常，局部可見少量腎小管上皮細(xì)胞顆粒變性(黑色箭頭)、胞質(zhì)疏松淡染、刷狀緣脫落(藍(lán)色箭頭)。

A. Con組；B. Pur組；C. Cd組；D. (Cd+Pur)組

2.2 鎘與葛根素對大鼠腎臟皮質(zhì)內(nèi)MDA含量的影響

如圖2所示，與對照組相比，鎘組腎皮質(zhì)中MDA含量極顯著升高(P<0.01)；與鎘組相比，鎘與葛根素共處理組MDA含量極顯著降低(P<0.01)；對照組、葛根素組與共處理組之間MDA含量無顯著差異(P>0.05)。

2.3 鎘與葛根素對大鼠腎臟皮質(zhì)內(nèi)SOD活性的影響

如圖3所示，與對照組相比，鎘組腎皮質(zhì)SOD活性顯著降低(P<0.05)；與鎘組相比，鎘與葛根素共處理組SOD活性顯著升高(P<0.05)；對照組、葛根素組與共處理組之間SOD活性無顯著差異(P>0.05)。

注：大寫字母不同表示差異極顯著(P<0.01)，小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)，字母相同表示差異不顯著(P>0.05)。下同

圖3 大鼠腎皮質(zhì)中SOD活性變化

2.4 鎘與葛根素對大鼠腎臟皮質(zhì)內(nèi)CAT活性的影響

如圖4所示，與對照組相比，鎘組腎皮質(zhì)中CAT活性顯著降低(P<0.05)；與鎘組相比，鎘與葛根素共處理組CAT活性顯著升高(P<0.05)；對照組、葛根素組與共處理組之間CAT活性無顯著差異(P>0.05)。

圖4 大鼠腎皮質(zhì)中CAT活性變化

2.5 鎘與葛根素對大鼠腎臟皮質(zhì)內(nèi)GSH-Px活性的影響

如圖5所示，與對照組相比，鎘組腎皮質(zhì)中GSH-Px活性極顯著降低(P<0.01)；與鎘組相比，鎘與葛根素共處理組GSH-Px活性極顯著升高(P<0.01)；對照組、葛根素組與共處理組之間GSH-Px活性無顯著差異(P>0.05)。

圖5 大鼠腎皮質(zhì)中GSH-Px活性變化

2.6 鎘與葛根素對大鼠腎臟皮質(zhì)內(nèi)GSH含量的影響

如圖6所示，與對照組相比，鎘組腎皮質(zhì)中GSH含量極顯著升高(P<0.01)；與鎘組相比，鎘與葛根素共處理組GSH含量顯著降低(P<0.05)；對照組、葛根素組與共處理組之間GSH含量無顯著差異(P>0.05)。

圖6 大鼠腎皮質(zhì)中GSH含量變化

3 討論

鎘為環(huán)境中常見的重金屬之一，可造成環(huán)境的污染，并進(jìn)一步引起動物和人的健康問題。鎘對各組織器官均有不同程度的毒性作用，其中，腎臟可能為最敏感和重要的器官之一[9]。為了模擬“環(huán)境暴露”與“職業(yè)暴露”的鎘污染狀況，有學(xué)者分別以5 mg/L 和50 mg/L鎘飲水濃度建立了大鼠模型[10-11]。此外，研究表明50 mg/L鎘自由飲水能造成大鼠大腦、肝臟、睪丸等部位的毒性損傷[12-14]。因此本試驗(yàn)選用50 mg/L鎘自由飲水的方式探究鎘對腎臟的毒性損傷作用。本試驗(yàn)中腎臟病理切片結(jié)果顯示，鎘組部分腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)顆粒變性，胞質(zhì)疏松淡染，核淡染，微絨毛圍成的刷狀緣部分脫落，少數(shù)血管周圍可見多種炎性細(xì)胞浸潤，說明重金屬鎘造成了腎臟一定程度的病理損傷。

氧化應(yīng)激為鎘腎臟毒性的重要機(jī)制之一，且為鎘致腎臟損傷的主要原因[15]。脂質(zhì)過氧化為氧化應(yīng)激產(chǎn)生的活性氧自由基與生物膜上的多不飽和脂肪酸發(fā)生氧化反應(yīng)，生成具有毒性的過氧化物的過程，其產(chǎn)生的二級產(chǎn)物包含多種醛酸，MDA包括在內(nèi)，且為整個過程中致突變性最強(qiáng)的一個[16]，故為氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化過程的重要生物標(biāo)志。本試驗(yàn)中，鎘組MDA相比于對照組，含量極顯著升高，表明鎘造成了腎臟皮質(zhì)的氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化。

葛根素為一種由豆科植物野葛、甘葛的根中提取出來的中藥材，中醫(yī)認(rèn)為其有升陽、活血、通絡(luò)的作用，因此對人體心腦血管系統(tǒng)有很多積極影響。葛根素藥理作用強(qiáng)、安全范圍廣，現(xiàn)已在臨床被廣泛運(yùn)用，包括在糖尿病早期降低疾病對腎功能的損害[26]。研究表明，200 mg/kg葛根素能有效逆轉(zhuǎn)各種原因?qū)е碌拇笫蟾髋K器病理損傷[27-28]，因此本研究選用此劑量用以探究葛根素對鎘造成腎臟毒性損傷的保護(hù)作用。本研究的病理切片結(jié)果顯示，葛根素緩解了鎘造成的腎臟病理損傷：腎上皮細(xì)胞見有少量顆粒變性，刷狀緣脫落程度不大，未見明顯的炎性細(xì)胞浸潤。許多研究發(fā)現(xiàn)葛根素能降低不同原因所致的腎臟氧化損傷，如鋁造成的脂質(zhì)過氧化作用[29]、腎臟組織細(xì)胞缺血再灌注引起的氧化應(yīng)激[30]等。龍夢菲等[8]研究發(fā)現(xiàn)葛根素能降低鎘造成的血清中MDA含量的升高和SOD、總抗氧化能力(T-AOC)活性的下降。本研究發(fā)現(xiàn)，葛根素能抑制鎘引起的腎皮質(zhì)中MDA、GSH含量升高，GSH-Px、SOD和CAT活性降低，說明天然抗氧化劑葛根素能在一定程度上減輕重金屬鎘對腎臟造成的氧化應(yīng)激，提高機(jī)體的抗應(yīng)激水平。

綜上，本研究表明，鎘暴露能導(dǎo)致腎臟發(fā)生一定的病理變化，并能引起腎皮質(zhì)中MDA、GSH含量升高，SOD、CAT和 GSH-Px活性降低，導(dǎo)致腎臟氧化損傷；葛根素對鎘造成的腎臟毒性具有一定的保護(hù)作用。