郭美娟,史國華,張 斌,李楊薇宇,張 巖*,張?zhí)m天*
(河北省食品檢驗研究院,河北省食品安全重點實驗室,河北 石家莊 050200)
我國每年新出生嬰兒有上千萬,其中一部分嬰兒由于各種疾病的影響,母乳或普通嬰兒配方奶粉不能滿足其營養(yǎng)需要。特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品是這些嬰兒生命早期或相當(dāng)長時間內(nèi)賴以生存的主要食物來源,所以特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品的安全性、營養(yǎng)成分分析以及適用性等問題應(yīng)給予更多重視。常見的特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品包括無乳糖配方或低乳糖配方、乳蛋白部分水解配方、乳蛋白深度水解配方、氨基酸配方、早產(chǎn)/低出生體重嬰兒配方、嬰兒營養(yǎng)補(bǔ)充劑、氨基酸代謝障礙配方。每種特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品均有其自身的產(chǎn)品特點。本實驗選取在特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品較常見且比較有代表性的3 種配方。乳蛋白部分水解配方食品的主要技術(shù)要求此類食品是將牛奶蛋白經(jīng)過加熱和(或)酶水解為小分子乳蛋白、肽段和氨基酸,以降低大分子牛奶蛋白的致敏性。乳蛋白深度水解配方的主要技術(shù)要求應(yīng)用一定工藝手段將過敏原去除或不含過敏原,適用于牛奶蛋白過敏的嬰兒,另還需要根據(jù)嬰兒的代謝情況調(diào)整部分維生素和礦物質(zhì)。氨基酸配方的主要技術(shù)要求以氨基酸為主要原料,但不含或僅含少量與代謝障礙有關(guān)的氨基酸,滿足患者的部分蛋白質(zhì)(氨基酸)需求。GB 10765—2010《嬰兒配方食品》中將嬰兒配方食品分為乳基嬰兒配方食品和豆基嬰兒配方食品。乳基嬰兒配方食品是指以乳類及乳蛋白制品為主要原料,加入適量的維生素、礦物質(zhì)和/或其他成分,僅用物理方法生產(chǎn)加工制成的液態(tài)或粉狀產(chǎn)品。豆基嬰兒配方食品是指以大豆及大豆蛋白制品為主要原料得到的產(chǎn)品。因其以植物蛋白為主要原料,對乳糖不耐受、牛奶蛋白過敏、易腹瀉的敏感嬰兒更為適用。因此豆基配方在特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品中更為常見??梢姡瑹o論從配方還是基質(zhì)看,特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品是一類既特殊又復(fù)雜的食品。
特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品含有多種維生素和礦物質(zhì)等嬰兒生長不可缺少的營養(yǎng)成分。其中B族維生素是維持人體正常機(jī)能與代謝活動不可或缺的水溶性維生素,可以幫助維持心臟、神經(jīng)系統(tǒng)功能,維持消化系統(tǒng)及皮膚的健康,缺乏B族維生素,會導(dǎo)致代謝障礙,人體易出現(xiàn)怠滯和血壓升高等問題[1-5]。在嬰幼兒配方奶粉中常添加一定量的B族維生素,以保證嬰幼兒攝取的需要。但添加量必須控制在一定范圍,以免產(chǎn)生不良影響。因此檢測嬰幼兒配方奶粉以及特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品中的B族維生素含量有著重要的現(xiàn)實意義。常見的B族維生素有硫胺素(VB1)、核黃素(VB2)、煙酸/煙酰胺(VB3)、泛酸(VB5)、吡哆醇/吡哆醛/吡哆胺(VB6)、生物素(VB7)、葉酸(VB9)、鈷胺素(VB12)等。GB 25596—2010《特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品通則》中規(guī)定了在特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品中VB1、VB2、VB6、VB12、煙酸、泛酸、葉酸、生物素這8 種B族維生素的限量范圍[6]。
目前國內(nèi)外關(guān)于檢測B族維生素的研究較多,文獻(xiàn)報道的檢測方法有毛細(xì)管電泳法[7]、酶聯(lián)免疫法[8]、電化學(xué)發(fā)光法[9]、液相熒光測定法[10]、液相色譜法[11-17]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[18-21]、離子色譜法[22]、電感耦合等離子體質(zhì)譜法[23-24]等,各個方法均存在一定的優(yōu)缺點,且大多數(shù)方法主要針對部分基質(zhì)進(jìn)行方法的開發(fā)和應(yīng)用。
我國有一系列食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)可用于對食品包括嬰幼兒配方奶粉中B族維生素的檢測[25-28],若檢測方法不適用于特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品,不利于特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品的研發(fā),同樣不利于監(jiān)管部門的監(jiān)督。特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品作為特殊食品,其基質(zhì)與普通食品區(qū)別較大,但國標(biāo)方法中并沒有專門針對特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品的檢測方法,國標(biāo)方法在特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品中的適用性有待研究。本研究聯(lián)合7 家實驗室按國標(biāo)方法分別對3 類不同配方的8 種特殊醫(yī)學(xué)用途配方奶粉中的VB1、VB2、VB6和煙酸進(jìn)行測定,分析國標(biāo)方法在特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品中的適用性,旨在推動我國特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品中成分檢測方法的完善。
選用特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品共3 類配方,8 種產(chǎn)品。分別為乳蛋白部分水解配方奶粉4 種,乳蛋白深度水解配方奶粉2 種,氨基酸配方奶粉2 種,樣品編號及配方信息見表1。
表1 樣品信息Table 1Information about samples selected in this study
儀器、試劑及標(biāo)準(zhǔn)溶液配制分別參照GB 5009.84—2016《食品中維生素B1的測定》第一法 高效液相色譜法、GB 5009.85—2016《食品中維生素B2的測定》第一法 高效液相色譜法、GB 5009.89—2016《食品中維生素?zé)熕岬臏y定》第二法 高效液相色譜法、GB 5009.154—2016《食品中維生素B6的測定》第一法 高效液相色譜法中要求進(jìn)行[25-28]。
VB1的樣品前處理以及檢測分析:采用GB 5009.84—2016第一法 高效液相色譜法[25];VB2的樣品前處理以及檢測分析:采用GB 5009.85—2016第一法 高效液相色譜法[26];煙酸的樣品前處理以及檢測分析:采用GB 5009.89—2016第二法 高效液相色譜法[27];VB6的樣品前處理以及檢測分析:采用GB 5009.154—2016第一法 高效液相色譜法[28]。
目前因無法得到特殊醫(yī)學(xué)用途產(chǎn)品的參考樣品,代以嬰兒配方奶粉參考樣品作為參考,參考值由具有ISO 17043資質(zhì)的實驗室基于EN 14122、EN 14152、EN 14164、EN 15652的內(nèi)部檢測方法依據(jù)能力驗證統(tǒng)計方法計算得出。本研究參加比對的7 家實驗室分別使用GB 5009.84—2016第一法、GB 5009.85—2016第一法、GB 5009.154—2016第一法、GB 5009.89—2016第二法對VB1、B2、B6和煙酸進(jìn)行檢測,檢測參考樣品結(jié)果,如表2、3所示。
表2 嬰兒配方奶粉參考樣品含量檢測結(jié)果Table 2Results for the determination of B vitamins in reference samples of infant formula milk powder
表3 嬰兒配方奶粉參考樣品Z值檢測結(jié)果Table 3Results obtained for the determination of B vitamins in reference samples of infant formula milk powder
Z值用于衡量某一測試結(jié)果在一組數(shù)據(jù)中相對中位值的偏離程度,Z值絕對值越小,表明該結(jié)果的偏離程度越低。Z=(測試結(jié)果-中位值)/NIQR,其中NIQR為測試結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)四分位數(shù)間距。Z值的判定原則:|Z|≤2,為滿意結(jié)果;2<|Z|<3,為可疑或有問題結(jié)果;|Z|≥3,為不滿意結(jié)果。
從以上數(shù)據(jù)可以看出,除VB1的檢測結(jié)果普遍偏高以外,其他檢測項目數(shù)值均與參考值相近,標(biāo)準(zhǔn)偏差比(standard deviation ratio,SDR)非常小,Z值小于2,證明檢測結(jié)果滿意。在VB1的測定中,參考樣品的結(jié)果使用EN 14122方法測定的,在鹽酸硫胺素?fù)Q算時選用系數(shù)1.26,而本研究采用的GB 5009.84—2016選用系數(shù)1.12。因此,本研究用各實驗室測定的結(jié)果普遍比參考樣品的參考值高。使用EN 14152與GB 5009.85—2016第一法測定VB2,使用EN 14164與GB 5009.154—2016第一法測定VB6,使用EN 15652的內(nèi)部方法與GB 5009.89—2016第二法測定煙酸,在嬰兒配方產(chǎn)品中檢測結(jié)果一致。驗證了國標(biāo)方法在嬰兒配方奶粉中的適用性以及7 家實驗室的檢驗?zāi)芰δ軌驖M足本研究的要求。
表5 VB1 ZB值實驗結(jié)果(GB 5009.84—2016第一法)Table 5ZB value for vitamin B1in infant formula foods for special medical purposes determined by method I in the national standard GB 5009.84—2016 in seven laboratories
實驗室間測量結(jié)果的Z值被定義為ZB值,用來衡量實驗室間測試結(jié)果的系統(tǒng)誤差。如表4、5所示,除實驗室3外,其他6 個實驗室的檢測結(jié)果精密度符合檢測要求,|ZB|值均不大于2。實驗室3有6 個偏高的離群結(jié)果,可能是由于選用了不合適的色譜柱,使目標(biāo)物VB1不能與干擾物完全分離造成的。根據(jù)GB/T 27404—2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢驗》中對于精密度的要求,被測組分含量為1 mg/kg時,實驗室內(nèi)變異系數(shù)為11%。從表4可以看出,所有樣品的實驗室間變異系數(shù)處于17.9%~39.2%之間,說明實驗室間結(jié)果有一定差異性。
表4 VB1實驗結(jié)果(GB 5009.84—2016第一法)Table 4Results obtained for the determination of vitamin B1 in infant formula foods for special medical purpose by method I in the national standard GB 5009.84—2016
Cm可以根據(jù)公差范圍和標(biāo)準(zhǔn)偏差得到。一般認(rèn)為,Cm≥1.67,為滿意結(jié)果,方法適用能力好;1.33<Cm<1.67,為有問題結(jié)果,方法能力有待進(jìn)一步確認(rèn);Cm<1.33,為不滿意結(jié)果,方法不適用。從表4看出,除深度水解配方的2 個樣品外,其余所有樣品的方法能力Cm值均小于1.33,認(rèn)為樣品與方法不適配。實驗室3幾乎所有樣品均為偏高的離群結(jié)果,剔除該實驗室的數(shù)據(jù)后重新計算,所有實驗室的方法能力Cm值均大于設(shè)定值1.67,認(rèn)為樣品與方法適配。
表7 VB2 ZB值實驗結(jié)果(GB 5009.85—2016第一法)Table 7ZB values for vitamin B2in infant formula foods for special medical purposes determined by method I in the national standard GB 5009.85—2016 in seven laboratories
從表6、7可以看出,除實驗室5的乳蛋白部分水解配方A和D、實驗室6的乳蛋白部分水解配方B和E、實驗室1的乳蛋白深度水解配方G的5 個檢測|ZB|值大于2,其余所有7 個實驗室的51 個檢測結(jié)果的|ZB|值不大于2,說明檢測結(jié)果精密度符合實驗要求。根據(jù)GB/T 27404—2008規(guī)定實驗室內(nèi)變異系數(shù)為11%,只有乳蛋白部分水解配方A樣品的變異系數(shù)為11.2%,略高于11%,其他樣品的實驗室間變異系數(shù)均小于11%,說明各實驗室間結(jié)果沒有差異性。所有樣品的方法能力Cm值均大于設(shè)定值1.67,認(rèn)為樣品與方法適配。
表6 VB2實驗結(jié)果(GB 5009.85—2016第一法)Table 6Results for the determination of vitamin B2in infant formula foods for special medical purposes by method I in the national standard GB 5009.85—2016
表9 VB6 ZB值實驗結(jié)果(GB 5009.154—2016第一法)Table 9ZB values for vitamin B6in infant formula foods for special medical purposes determined by method I in the national standard GB 5009.154—2016 in seven laboratories
如表8、9所示,實驗室6 有5 個異常偏高的離群結(jié)果,剔除該實驗室數(shù)據(jù)后結(jié)果如表10、11所示。
表8 VB6實驗結(jié)果(GB 5009.154—2016第一法)Table 8Results for the determination of vitamin B6in infant formula foods for special medical purposes by method I in the national standard GB 5009.154—2016
表10 特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品樣品中VB6檢測結(jié)果分析(剔除離群數(shù)據(jù))Table 10Analysis of test results for vitamin B6in infant formula foods for special medical purposes (excluding outlier data)
剔除實驗室6的數(shù)據(jù)后,從表11可以看出,除實驗室1的乳蛋白深度水解配方G、實驗室4的乳蛋白部分水解配方F的2 個檢測|ZB|值大于2,其余所有6 個實驗室的54 個檢測結(jié)果的|ZB|值不大于2,說明檢測結(jié)果精密度符合實驗要求。根據(jù)GB/T 27404—2008規(guī)定實驗室內(nèi)變異系數(shù)為11%,實驗室間結(jié)果差異性不大。除2 個乳蛋白部分水解配方樣品E、F和1 個氨基酸配方樣品H外,其余所有樣品的方法能力Cm值均大于1.67,認(rèn)為樣品與方法適配,樣品E、F和H與方法不適配。在樣品處理過程中發(fā)現(xiàn),C、D、H三個樣品的濾液不澄清,對檢測結(jié)果的影響還需進(jìn)一步研究。從配方上分析C、D、H三個樣品,發(fā)現(xiàn)這3 款產(chǎn)品的配方中都添加有經(jīng)預(yù)糊化處理的淀粉,這是其他配方和普通嬰兒配方奶粉所不具有的成分。在VB6的前處理過程中,將奶粉溶解后首先用淀粉酶進(jìn)行酶解,很有可能是經(jīng)預(yù)糊化處理的淀粉經(jīng)酶解后產(chǎn)生的渾濁導(dǎo)致濾液無法澄清。
表11 特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品樣品中VB6檢測結(jié)果分析(剔除離群數(shù)據(jù))Table 11Analysis of test results for vitamin B6in infant formula foods for special medical purposes (excluding outlier data)
實驗室6有5 個偏高的離群結(jié)果,此樣品吡哆胺附近有雜峰,積分有干擾,通過加標(biāo)確認(rèn)目標(biāo)峰。C、D、E、G樣品吡哆胺出峰位置有很大的雜峰,出峰時間與吡哆胺一致,容易被當(dāng)成吡哆胺積分。在現(xiàn)有色譜柱上進(jìn)行條件優(yōu)化后,除氨基酸配方D結(jié)果差異仍較大外,其他樣品均得到比較合理的結(jié)果。
表13 煙酸ZB值實驗結(jié)果(GB 5009.89—2016第二法)Table 13ZB values for niacin in infant formula foods for special medical purposes determined by method II in the national standard GB 5009.89—2016 in seven laboratories
如表12、13所示,實驗室2有5 個偏高的離群結(jié)果,|ZB|值大于2,很可能是選用了不合適的色譜柱,使目標(biāo)物煙酸不能與干擾物完全分離造成,還需進(jìn)一步內(nèi)部調(diào)查原因。根據(jù)GB/T 27404—2008的要求,被測組分含量為10 mg/kg時,實驗室內(nèi)變異系數(shù)為7.5%。所有樣品的實驗室間變異系數(shù)處于10.6%~30.8%之間,實驗室間結(jié)果有一定差異性。所有樣品的方法能力Cm值均小于1.67,認(rèn)為樣品與方法不適配。剔除實驗室2的數(shù)據(jù)后,仍有一半樣品的方法能力Cm值小于1.67,認(rèn)為樣品與方法不適配。在樣品處理過程中發(fā)現(xiàn),同樣也是C、D、H三個樣品的濾液不澄清,除了與VB6的分析一樣考慮淀粉成分對濾液澄清度的影響,還考慮到可能是基質(zhì)的問題,導(dǎo)致國標(biāo)方法的前處理不適用于氨基酸配方和深度水解配方食品。VB1和VB2前處理都是用0.1 mol/L的鹽酸溶液溶解,經(jīng)高溫酸水解,調(diào)節(jié)pH值后用混合酶溶液酶解,取濾液。VB6和煙酸的前處理都是用水溶解后調(diào)pH值到1.7酸化再用氫氧化鈉溶液調(diào)pH值到4.5后進(jìn)行超聲過濾。很多的特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品的主要成分是乳糖、麥芽糊精、葡萄糖漿、玉米糖漿等,與普通的嬰兒配方奶粉以生牛乳為主要原料截然不同。說明該前處理方法不適用于特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品。
表12 煙酸實驗結(jié)果(GB 5009.89—2016第二法)Table 12Results obtained for the determination of niacin in infant formula foods for special medical purposes by method II in the national standard GB 5009.89—2016
分別對3 類不用基質(zhì)的特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品進(jìn)行回收率實驗,如表14所示。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)添加量基本與樣品含量一致進(jìn)行添加,從而驗證方法在特殊醫(yī)學(xué)用途產(chǎn)品基質(zhì)中的正確度。
表14 各實驗室加標(biāo)回收率檢測結(jié)果Table 14Test results of spiked recovery rates in each laboratory
根據(jù)GB/T 27404—2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢驗》中對回收率的要求,被測組分含量為1~100 mg/kg時,實驗室回收率范圍在90%~110%之間,被測組分含量在0.1~1 mg/kg時,實驗室回收率范圍在80%~110%之間。VB1回收率結(jié)果:除實驗室1、2、7外,其他4 家實驗室的回收率均不能達(dá)到國標(biāo)要求的80%~110%。實驗室3在3 個樣品類型上進(jìn)行的回收率實驗結(jié)果比參考范圍上限高出30%~80%。實驗室4~6的回收率結(jié)果整體偏低,實驗室7在乳蛋白深度水解配方和部分水解配方的回收率結(jié)果偏低,在氨基酸配方結(jié)果偏高。VB2回收率結(jié)果:實驗室2、5、6不能達(dá)到國標(biāo)要求的90%~110%,總體處于可接受范圍。最低的實驗室5在乳蛋白深度水解配方、氨基酸配方上分別達(dá)到-13%、-14%。VB6回收率結(jié)果:實驗室2、3、4外回收率偏高,其他實驗室的回收率均能達(dá)到國標(biāo)要求的80%~110%,總體處于可接受范圍。煙酸回收率結(jié)果:除實驗室4回收率均低于90%,實驗室2有1 個數(shù)據(jù)偏高,實驗室6有1 個數(shù)據(jù)偏低。其他實驗室的所有回收率都符合國標(biāo)要求的90%~110%。
特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品回收率達(dá)不到國標(biāo)要求的原因可能是由于其基質(zhì)特殊,特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品基質(zhì)和普通嬰兒配方乳粉基質(zhì)有著很大區(qū)別,普通嬰兒配方乳粉中蛋白質(zhì)來源大多是乳蛋白或大豆蛋白,基質(zhì)相對簡單。特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品中蛋白質(zhì)等物質(zhì)來源多樣,基質(zhì)復(fù)雜。
特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品中部分水解配方、深度水解配方、氨基酸配方產(chǎn)品的基質(zhì)主要是由肽、氨基酸、部分整蛋白(氨基酸配方產(chǎn)品不含)構(gòu)成,不同于嬰幼兒配方乳粉全部為整蛋白的基質(zhì),而肽、氨基酸的物理化學(xué)性質(zhì)與蛋白質(zhì)不同,造成檢測過程中方法不適用的問題。其中,GB 5009.84—2016第一法基本適合檢測嬰兒配方產(chǎn)品及所檢測特殊醫(yī)學(xué)用途產(chǎn)品的VB1含量,但3 種配方都出現(xiàn)回收率偏低的情況。GB 5009.85—2016第一法適合檢測嬰兒配方產(chǎn)品以及特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品VB2含量,特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品產(chǎn)品中乳蛋白深度水解和氨基酸配方產(chǎn)品實驗中出現(xiàn)回收率低的現(xiàn)象,需要更多的實驗和數(shù)據(jù)進(jìn)行確認(rèn)。GB 5009.154—2016第一法適合檢測嬰兒配方產(chǎn)品和所檢測特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品中部分水解配方和深度水解配方產(chǎn)品,不適用于氨基酸配方產(chǎn)品中的VB6檢測。GB 5009.89—2016第二法適合檢測嬰兒配方產(chǎn)品中的煙酸,不適合特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品的檢測。
食品中物質(zhì)的檢測,往往由于不同食品的基質(zhì)不同,其方法的適用性也有所不同,該方法是否適用于被測樣品,需進(jìn)行方法適用性驗證[29-30]。特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品中的VB1、VB2、VB6和煙酸在按照國標(biāo)方法進(jìn)行前處理時蛋白不易沉淀,出峰干擾較大,不同基質(zhì)的食品前處理及檢測分析的方法應(yīng)有差別,可對現(xiàn)有的國標(biāo)方法進(jìn)行改進(jìn),以適用于特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品中的VB1、VB2、VB6和煙酸的檢測[31]。