皮江一，胡家勇，汪 薇，劉國嬌，林 津，周陶鴻*

（湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗研究院，湖北省食品質(zhì)量安全檢測工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430075）

在我國食品安全和環(huán)保的雙重要求下，水產(chǎn)畜禽用藥提倡無抗或少抗，因此國家對抗生素的管控也更加嚴(yán)格，杜絕副作用大、對人和動物有危害的藥物濫用[1-2]。但是在養(yǎng)殖環(huán)境中，積少成多的病害如果得不到及時控制，經(jīng)濟(jì)損失將會非常巨大，因此預(yù)防和殺菌力強(qiáng)、安全性高、耐藥性低的藥物如氟苯尼考（florfenicol，F(xiàn)F）深受青睞[3]。但是，藥物濫用會導(dǎo)致畜禽及水產(chǎn)中有較高劑量的藥物殘留，人體長期攝入含有該類抗生素殘留的食物易導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性增加、過敏反應(yīng)和體內(nèi)菌群失調(diào)等癥狀[4-5]。如不規(guī)范使用此類抗生素，這個用在動物病原體的“核武器”未來會對人類自身安全造成危害[6-7]。

FF又稱氟甲砜霉素，是一種新型氯霉素（chloramphenicol，CAP）類動物專用廣譜抗生素，該藥物抗菌廣譜，安全高效，對眾多畜禽細(xì)菌性疾病的治療效果顯著，F(xiàn)F一般通過飼料添加或者家禽疾病治療從而廣泛在水產(chǎn)及畜禽體內(nèi)殘留并積累[8-9]。FF對雞的生殖系統(tǒng)有消炎作用，但同時會輕度抑制生殖激素的產(chǎn)生，造成雞蛋早期胚胎的死亡，所以235號公告《動物性食品中獸藥最高殘留限量》規(guī)定“家禽限量（產(chǎn)蛋禁用）”[10]。FF的主要代謝物有氟苯尼考胺（florfenicol amine，F(xiàn)FA）、氟苯尼考醇、氟苯尼考草氨酸等，且FFA是組織中最主要的代謝物[11-13]，因此GB 31650—2019《食品中獸藥最大殘留限量》以FF及FFA含量之和作為動物體內(nèi)FF的殘留標(biāo)志物，且標(biāo)準(zhǔn)明確規(guī)定家禽產(chǎn)蛋期禁用。

目前國內(nèi)研究動物食品中FF及其主要代謝物FFA的檢測方法多為色譜、質(zhì)譜、電位、酶聯(lián)免疫檢測[14-19]等方法，這些方法只適用于專業(yè)實驗室檢測，不適用于日常快速檢查、重大活動保障、案件查辦等；膠體金免疫層析技術(shù)[20-21]是近些年快速發(fā)展起來的一種檢測方法，具有簡單、快速、成本低等優(yōu)點，目前FF膠體金免疫層析方法較為成熟，但是關(guān)于FF的代謝物FFA快速檢測的相關(guān)研究卻寥寥無幾，本研究旨在通過將代謝物FFA衍生化為FF從而實現(xiàn)FF殘留標(biāo)志物的檢測，進(jìn)而為規(guī)范我國FF的使用，以及為食品安全監(jiān)管部門提供技術(shù)支撐，滿足食品安全執(zhí)法“即時查、現(xiàn)場辦”的實際需求，本實驗以雞蛋為研究對象，建立禽蛋中FF及其代謝物的免疫層析同步快速檢測方法，為日常監(jiān)管、案件稽查提供簡便、快捷、準(zhǔn)確的技術(shù)支撐，提高監(jiān)管效率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞蛋，監(jiān)督抽檢農(nóng)貿(mào)市場采購。用于檢測的3 種禽蛋中FF快速檢測盒分別購買于武漢華美生物工程有限公司、深圳市寶安康生物技術(shù)有限公司和北京贊普生物技術(shù)有限公司。

FF、FFA、CAP、甲砜霉素（thiamphenicol，TAP）北京曼哈格生物科技有限公司；二氯乙酸酐（純度97%） 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；硼酸緩沖液（0.2 mol/L，pH 9）、其他試劑均為分析純 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

M204型電子天平 梅特勒-托利多國際貿(mào)易有限公司；WXHEY-08渦旋混合器、YPNSY-12便攜式樣品濃縮儀 武漢華美生物有限公司；API 5500型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀、4500高效液相色譜儀 美國AB SCIEX公司。

1.3 方法

1.3.1 FF殘留物提取實驗

根據(jù)雞蛋中FF及FFA代謝模型[22-23]，實驗將陰性雞蛋攪拌液分為8 組，在前4 組雞蛋攪拌液中加入一定量FF標(biāo)品，后4 組蛋液中加入FFA標(biāo)品，使得蛋液樣品中FF及FFA含量分別為5、50、100、150 μg/kg。分別稱取3 g（精確至0.01 g）蛋液于15 mL離心管內(nèi)，加入體積比99%乙酸乙酯-1%氨水提取溶液2 mL，輕微顛倒30余次以充分混合樣品，但要避免形成乳化物，于25 ℃、4 000 r/min離心5 min后取上清液，經(jīng)便攜式氮吹儀40 ℃吹干，用5.0 mL體積分?jǐn)?shù)30%甲醇溶液定容，混勻，液體過0.22 μm濾膜，供液相色譜-質(zhì)譜儀測定其回收率，測定條件參照SN/T 1865—2016《出口動物食品中甲砜霉素、氟甲砜霉素和FFA殘留量的測定 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》[24]。

1.3.2 FFA衍生化及測定

吸取0.5 mL上清液，用鹽酸溶液中和氨水至pH值為7.0后，加入2 μL二氯乙酸酐迅速渦旋振蕩3 min，將渦旋后液體經(jīng)便攜式氮吹儀40 ℃吹干后加入等體積硼酸緩沖液復(fù)溶，復(fù)溶后液體經(jīng)液相色譜-質(zhì)譜儀和飛行時間高分辨率質(zhì)譜儀檢測。高分辨靜電場軌道阱質(zhì)譜采集參數(shù)：電噴霧電離源，噴霧電壓3 kV，正離子模式；一級全掃描分辨率R=120 000，掃描范圍m/z100～1 000，二級采用數(shù)據(jù)依賴掃描，達(dá)到設(shè)定閾值后觸發(fā)二級碎裂，二級掃描分辨率R=60 000；自動增益控制目標(biāo)離子數(shù)為5×105，質(zhì)量偏差窗口為5×10－6，高能碰撞裂解碎裂能量為（40±15）%，離子源溫度325 ℃，離子傳輸桿溫度350 ℃，鞘氣265 kPa，輔助氣70 kPa。

1.3.3 方法檢出限與結(jié)果判定

將一定濃度的FF及FFA標(biāo)準(zhǔn)品添加于10 組陰性雞蛋液中混勻，使FF加標(biāo)含量為0、1、2、3、5 μg/kg，F(xiàn)FA加標(biāo)含量為0、1、2、3、5 μg/kg，按照上述前處理提取步驟和衍生化步驟進(jìn)行處理，渦旋后的液體經(jīng)衍生化及濃縮儀空氣吹干后，加入等體積硼酸緩沖液復(fù)溶，使得復(fù)溶后待測液pH值在6～9之間，取150 μL樣液加入膠體金免疫層析檢測卡樣品孔中。如試劑盒中包含有金標(biāo)微孔，將150 μL樣液與金標(biāo)微孔中的金標(biāo)抗體混勻，室溫孵育2 min后再滴入至樣品孔中，室溫放置5～8 min后進(jìn)行結(jié)果判定[25]。

1.3.4 方法特異性與加標(biāo)樣品檢測

本方法選用的檢測卡為FF檢測卡，用所選用的檢測卡分別檢測FFA、CAP、TAP和FF加標(biāo)樣品，設(shè)最低樣品檢測濃度為Y，按下式計算測定該方法對加標(biāo)樣品的交叉反應(yīng)率。

在陰性雞蛋樣品中分別添加10、20、50、100 μg/kg的FF單標(biāo)、FFA單標(biāo)、FF/FFA混標(biāo)，制成3 組加標(biāo)樣本，用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀對加標(biāo)樣本進(jìn)行含量檢測，液相條件及質(zhì)譜條件參照SN/T 1865—2016[24]，分析其準(zhǔn)確度和重復(fù)性。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

使用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，采用Microsoft Excel 2007進(jìn)行圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑選擇

根據(jù)FF及FFA化學(xué)性質(zhì)，F(xiàn)F在二甲基甲酰胺中極易溶解，在甲醇和冰醋酸中略溶，微溶于水，溶于有機(jī)溶劑。代謝物FFA極性強(qiáng)，易溶于水，不溶于有機(jī)試劑，溶解時可用少許純凈水溶解，然后加入有機(jī)溶劑溶解，國內(nèi)外關(guān)于禽蛋中FF和FFA的提取方法有許多報道[26-28]，提取劑一般為乙酸乙酯、乙腈、丙酮等。所以實驗選取4 種提取溶劑作比較：乙腈、99%乙酸乙酯-1%氨水、50%乙腈-50%乙酸乙酯、硼酸提取液。乙腈可沉淀蛋液中的蛋白，減少內(nèi)源雜質(zhì)，有利于樣品的凈化，由于有機(jī)溶劑無法上樣檢測，需用空氣吹干后用復(fù)溶劑復(fù)溶后上樣，而乙腈揮發(fā)較慢，且提取實驗表明乙腈提取目標(biāo)物質(zhì)效率較差，回收率較低；乙腈-乙酸乙酯雖能有效提取樣品中的FF和FFA，但同樣由于殘留乙腈的吹干較為緩慢，所以不適合膠體金免疫層析法的快速檢測，且回收率較低；硼酸提取液可直接上樣檢測，但蛋液中蛋白、脂質(zhì)等使得樣液在樣品墊上難以延展；乙酸乙酯可有效提取組織中FF，在偏堿性環(huán)境中同樣有效提取FFA，且乙酸乙酯易吹干，但在提取過程中需要注意的是與樣品混合過程中需輕緩搖晃，避免其形成持久乳化液。而本實驗采用99%乙酸乙酯-1%氨水作為提取溶劑，其加標(biāo)回收率均大于80%。FF和代謝物FFA的添加回收率及相對偏差結(jié)果見表1。

表1 雞蛋中FF和FFA的添加回收率（n=5）Table 1Recoveries of florfenicol and florfenicol-amine from spiked egg ssamples (n= 5)

2.1.2 復(fù)溶溶劑確定

實驗得出最適復(fù)溶溶劑為0.2 mol/L硼酸緩沖液（pH 9.0），加入體積分?jǐn)?shù)0.4%曲拉通100，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%酪蛋白鈉。硼砂緩沖液主要起緩沖作用，穩(wěn)定整個體系的pH值；曲拉通100、酪蛋白具備良好的表面活性性能，能降低油-水界面的張力，使蛋白樣液能夠形成穩(wěn)定的體系，以便樣本能夠在試紙條上均勻爬動。

2.1.3 加樣量選擇

分別吸取50、100、150、200、300 μL樣品待測液（樣品中分別添加了50 μg/kg FF、50 μg/kg FFA共2 組標(biāo)準(zhǔn)品）于膠體金加樣孔中。結(jié)果表明，當(dāng)取樣量為150 μL時，檢測結(jié)果重復(fù)性好，C線和T線顏色區(qū)分明顯，利于判斷，故FF及FFA的檢測加樣量均選擇150 μL。

2.2 衍生試劑的選擇

FF是CAP的結(jié)構(gòu)同系物，化學(xué)名稱為D(+)-蘇-對甲砜基苯基-2-二氯乙酰氨基-3氟丙醇，分子式為C12H14Cl2FNSO4，相對分子質(zhì)量為358.2；FFA分子式為C10H15ClFNSO3，相對分子質(zhì)量為283.75。研究表明，F(xiàn)F的主要代謝產(chǎn)物有FFA、氟苯尼考醇和氟苯尼考草氨酸等[29-30]（圖1），F(xiàn)FA是在動物肝臟中殘留時間最長的代謝物[31]，因此以FFA作為休藥期計算的標(biāo)志殘留物，且FF及其代謝產(chǎn)物在酸條件下水解能夠全部衍生化為無活性的FFA。通過結(jié)構(gòu)分析，F(xiàn)FA在酸性條件下可以衍生化為FF，由于二氯乙酸酐不穩(wěn)定，水解后的羥基基團(tuán)與FFA氨基結(jié)合，從而實現(xiàn)FF的衍生化，其反應(yīng)機(jī)理如圖2所示。

圖1 FF主要代謝產(chǎn)物Fig.1 Metabolism of florfenicol

圖2 FFA衍生化反應(yīng)Fig.2 Derivatization reaction of florfenicol-amine

2.3 FFA衍生產(chǎn)物分析

如圖3所示，F(xiàn)FA衍生物和FF標(biāo)準(zhǔn)品保留時間一致；將FFA衍生物進(jìn)行高分辨質(zhì)譜采集一級全掃和數(shù)據(jù)依賴二級掃描并與FF標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖進(jìn)行參考比對（圖4、5），結(jié)果表明，其特征峰在m/z170、206、241、254處與FF標(biāo)準(zhǔn)品的特征峰一致。以上結(jié)果可以得出FFA衍生化實驗的產(chǎn)物中中存在FF，且FF的衍生化效率在35%左右。

圖3 FF標(biāo)準(zhǔn)溶液（a）和FFA衍生物（b）色譜圖Fig.3 Chromatograms of florfenicol standard solution (a) and florfenicol-amine derivative (b)

圖4 FF標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖（a）和質(zhì)譜圖（b）Fig.4 Gas chromatogram (a) and mass spectrum (b) of florfenicol standard solution

圖5 FFA衍生物色譜圖（a）和質(zhì)譜圖（b）Fig.5 Gas chromatogram (a) and mass pectrum (b) of florfenicolamine derivative

2.4 免疫層析試紙檢出限與結(jié)果分析

如圖6所示，用FF試紙條檢測（比線法），F(xiàn)F含量為1 μg/kg時，C線的顏色明顯比T線深，結(jié)果為陽性，因此FF檢出限為1 μg/kg；FFA含量為3 μg/kg時，C線的顏色明顯比T線深，為陽性結(jié)果，因此FFA檢出限為3 μg/kg，與FFA衍生反應(yīng)衍生化率為35%保持一致。實驗檢出限均低于SN/T 1865—2016[24]10 μg/kg的檢出限。

圖6 FF（a）和FFA（b）檢出限Fig.6 Detection limits of florfenicol (a) and florfenicol-amine (b)

2.5 方法特異性及樣品測定結(jié)果

2.5.1 特異性分析

如表2所示，當(dāng)待檢物為FFA時，交叉反應(yīng)率小于0.3%。當(dāng)待檢物為FF、TAP和CAP時，交叉反應(yīng)率分別為100.0%、20.0%和2.0%。這是由于FF是TAP的氟化物，也是CAP的第3代產(chǎn)物，三者都是CAP類藥物，結(jié)構(gòu)上比較相似，因此TAP、CAP能與FF單克隆抗體發(fā)生交叉反應(yīng)，而FFA作為FF代謝物卻不能與FF單克隆抗體發(fā)生交叉反應(yīng)，用FF檢測卡檢測FFA，需先將其衍生為FF再進(jìn)行檢測。

表2 特異性實驗結(jié)果Table 2Specificity of colloidal gold test strip

2.5.2 方法假陽性率、假陰性率

FF陰性樣本40 份、模擬陽性樣本40 份，F(xiàn)FA陰性樣本40 份、模擬陽性樣本40 份，其假陽性率、假陰性率測試結(jié)果見表3，其加標(biāo)樣品的假陽性率和假陰性率均為0%。

表3 假陽性率、假陰性率測定結(jié)果Table 3False positive and false negative rates

2.5.3 準(zhǔn)確度與重復(fù)性分析

在空白雞蛋樣品中添加10、20、50、100 μg/kg的FF單標(biāo)、FFA單標(biāo)、FF/FFA混標(biāo)，制成3 組加標(biāo)樣本，用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀對加標(biāo)樣本進(jìn)行含量檢測，檢測結(jié)果與加標(biāo)理論值比較一致。按照此方法對加標(biāo)樣本進(jìn)行快速檢測，檢測結(jié)果見表4，檢測結(jié)果與加標(biāo)樣本的理論結(jié)果符合率為100%，表明該方法準(zhǔn)確度較高。此外，20 次重復(fù)結(jié)果一致，表明此方法重復(fù)性良好。

表4 準(zhǔn)確性與重復(fù)性評價結(jié)果（n= 20）Table 4Accuracy and repeatability of the method (n= 20)

3 結(jié) 論

本研究通過將雞蛋中FF主要代謝產(chǎn)物FFA簡單地預(yù)處理，并使FFA衍生為FF，為快速檢測禽蛋中FF及FFA提供了理論基礎(chǔ)和新的思路，且該處理方法可用于市面絕大部分FF檢測卡，實驗分別對3 種品牌的FF試紙條進(jìn)行了測試，實際樣品的檢測結(jié)果較為理想。本方法具備操作簡單，穩(wěn)定性好，靈敏度高等特點，且一條試紙卡可同時滿足禽蛋中FF及代謝物FFA定性的檢測，避免了FF及代謝物FFA單獨檢測，省時省力，適合于現(xiàn)場大批量的快速篩查，為日常監(jiān)管、案件稽查提供簡便、快捷、準(zhǔn)確的技術(shù)支撐，且具備較好的應(yīng)用前景。