盧 潔，田 婧，梁振華，王金梅，康文藝,3，馬常陽(yáng),*，李昌勤,*

（1.河南大學(xué) 國(guó)家食用菌加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心，河南 開(kāi)封 475004；2.河南省功能食品工程技術(shù)研究中心，河南 開(kāi)封 475004；3.開(kāi)封市保健食品功效成分研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 開(kāi)封 475004）

香菇（Lentinula edodes）隸屬香菇屬，又稱香菌、冬菇等[1]，味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，含有大量蛋白質(zhì)、維生素、膳食纖維及礦質(zhì)元素，且能量、脂肪較低，廣受大眾喜愛(ài)。香菇富含有纖維素、多肽、多糖等活性成分，現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)其具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒、抗抑郁、抗疲勞、抗氧化、抗衰老和保護(hù)肝損傷等作用[2-3]，具有開(kāi)發(fā)為保健食品或藥品的潛力。

香菇一直是我國(guó)食用菌的主要品種，據(jù)我國(guó)食用菌協(xié)會(huì)的統(tǒng)計(jì)調(diào)查表明，其產(chǎn)量常年居我國(guó)食用菌生產(chǎn)量和消費(fèi)量的首位，市場(chǎng)流通量大。由此，快速檢測(cè)及分析香菇及其產(chǎn)品的關(guān)鍵質(zhì)量成分對(duì)評(píng)價(jià)其品質(zhì)愈發(fā)重要[4]。糖類作為香菇中的重要營(yíng)養(yǎng)和功能成分，是評(píng)價(jià)香菇品質(zhì)的重要參考指標(biāo)。目前用于檢測(cè)香菇中含糖量的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法為GB/T 15672—2009《食用菌中總糖含量的測(cè)定》[5]，但此方法耗時(shí)長(zhǎng)、試劑危險(xiǎn)性高[6]。

近紅外（near infrared，NIR）光譜技術(shù)是集合多種技術(shù)優(yōu)點(diǎn)的綜合分析方法，因其操作簡(jiǎn)便、快捷、成本低、無(wú)試劑污染等特點(diǎn)而被廣泛研究和應(yīng)用于制藥、食品、石油化工以及農(nóng)業(yè)等各個(gè)領(lǐng)域[7-9]。此方法常用于產(chǎn)品質(zhì)量的快速檢測(cè)分析以節(jié)省時(shí)間、提高效率。Diaz等[10]結(jié)合糙米的NIR光譜和理化信息建立了測(cè)定糙米中直鏈淀粉含量的精確校準(zhǔn)模型；Chen Yi等[11]的實(shí)驗(yàn)證明NIR光譜結(jié)合偏最小二乘（partial least square，PLS）法可用于靈芝樣品中多糖和三萜物質(zhì)含量的快速測(cè)定；解育靜等[12]建立了肉桂中香豆素、肉桂醇、肉桂酸、肉桂醛共4 種有效成分的NIR定量分析模型，并具有較好的預(yù)測(cè)精準(zhǔn)性；此外，NIR技術(shù)在淫羊藿、茶葉質(zhì)量的快速預(yù)測(cè)方面也有研究[13-14]。本實(shí)驗(yàn)建立基于NIR技術(shù)的快速檢測(cè)香菇總糖的方法，提高香菇質(zhì)量的檢測(cè)效率。

在NIR光譜分析中，常用的建模方法有多元線性回歸、主成分回歸、PLS、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和支持向量機(jī)等非線性校正方法。其中，PLS法理論成熟，應(yīng)用較為廣泛，在食用菌領(lǐng)域有很好的應(yīng)用效果[15-16]，故本實(shí)驗(yàn)采用PLS法建立NIR分析模型，以期實(shí)現(xiàn)對(duì)香菇品質(zhì)的快速評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)共從市場(chǎng)中隨機(jī)獲取香菇樣品106 批，具體信息如表1所示，并未有明確的香菇品種區(qū)分。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（批號(hào)CS30062-69727） 法國(guó)Extrasynthese公司；鹽酸 北京化工廠；純凈水 杭州娃哈哈百利食品有限公司。

表1 香菇樣品信息Table 1Information about L.edodes samples collected in this study

1.2 儀器與設(shè)備

Spot light 400型中-近紅外光譜儀 美國(guó)鉑金埃爾默公司；Multiskan MK3酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo Electron公司；HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州翔天實(shí)驗(yàn)儀器廠；SK-1快速混勻器 金壇市華峰儀器有限公司；AB135-S型電子天平 梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 香菇總糖含量的測(cè)定

分別吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液至10 mL具塞試管，用蒸餾水補(bǔ)至1.0 mL。按GB/T 15672—2009的苯酚-硫酸法[5]測(cè)定其吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

精密稱取0.250 g香菇粉（20 目），浸泡于65 mL體積分?jǐn)?shù)23%的鹽酸溶液，微沸回流3 h，冷卻后取濾液，洗滌濾渣，合并濾液和洗液置于250 mL容量瓶中，定容。準(zhǔn)確吸取0.2 mL定容后的樣品溶液于10 mL具塞試管，加蒸餾水補(bǔ)至1.0 mL，按照苯酚-硫酸法操作，以1 mL不含葡萄糖的苯酚-硫酸溶液，調(diào)其吸光度至零，測(cè)定樣品溶液的吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算樣品溶液的總糖含量，并核算出原始樣品中的總糖含量。

1.3.2 NIR光譜采集與分析

逐一將香菇粉碎至80 目，均勻平鋪于測(cè)試用平皿底部，分辨率設(shè)置為8 cm－1，在4 000～10 000 cm－1光譜范圍內(nèi)掃描64 次，即得樣品的原始光譜圖（圖1）。

圖1 香菇樣品的NIR原始光譜圖Fig.1 Raw NIR spectra of L.edodes samples

1.4 模型建立及驗(yàn)證

使用Spectrum QUANT軟件分析數(shù)據(jù)，選取PLS法建立NIR分析模型。校正均方根誤差（root mean square error of calibration，RMSEC）、預(yù)測(cè)集均方根誤差（root mean square error of prediction，RMSEP）、R2、相對(duì)分析誤差（relative percent deviation，RPD）是評(píng)價(jià)模型的4 個(gè)關(guān)鍵參數(shù)。分析模型一般需具有較高的R2，較小的RMSEC和RMSEP及較高的RPD，且RMSEC/RMSEP的值需在0.8～1.2之間。RPD一般采取閾值分割法進(jìn)行評(píng)價(jià)[17-19]，當(dāng)RPD＞3.0時(shí)，模型能夠很好地滿足預(yù)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)[20-21]。按下式計(jì)算RPD：

2 結(jié)果與分析

2.1 香菇樣品總糖含量值

通過(guò)對(duì)香菇總糖含量的測(cè)定，得出106 批樣品中總糖含量的數(shù)據(jù)制成散點(diǎn)圖，結(jié)果如圖2所示，標(biāo)記點(diǎn)為106 批樣品對(duì)應(yīng)的點(diǎn)。

圖2 香菇樣品總糖含量的散點(diǎn)圖Fig.2 Scatter plot of total sugar content in L.edodes samples

為了開(kāi)展NIR分析模型的構(gòu)建過(guò)程和驗(yàn)證過(guò)程，需首先將樣品分成校正集和驗(yàn)證集。將樣品隨機(jī)抽選13 批樣品劃為驗(yàn)證集，而剩余的93 批樣品為校正集，但驗(yàn)證集的樣品需包含于篩選后的校正集范圍內(nèi)。

2.2 NIR分析模型中校正集樣品的篩選

在建模之前，需要剔除杠桿值異常樣品和學(xué)生化殘差樣品。第1類樣品含有比較極端的成分組成，如樣品中總糖含量信息和NIR色譜信息較突出，屬于同批次產(chǎn)品中的極端樣品，無(wú)法代表樣品的一般特性；第2類樣品受系統(tǒng)因素的嚴(yán)重影響，相較于一般市場(chǎng)中的香菇樣品，貯藏時(shí)間的長(zhǎng)短也會(huì)影響香菇糖類物質(zhì)的含量，其還受種植條件和管理方式的影響，也不符合樣品結(jié)果的一般分布規(guī)律，亦不適合放入校正集中。通過(guò)樣品篩選，保留代表香菇特征的樣品，可提高構(gòu)建香菇總糖含量預(yù)測(cè)模型的精準(zhǔn)度。

使用NIR數(shù)據(jù)分析軟件自動(dòng)識(shí)別異常樣品的結(jié)果如圖3所示，將學(xué)生化殘差和杠桿值遠(yuǎn)離大多數(shù)樣品的個(gè)體判定為潛在異常樣品[13]，利用剩余樣品建模型，觀察模型的R2、RMSEC和RMSEP等各項(xiàng)指標(biāo)決定異常點(diǎn)的刪除，此過(guò)程循環(huán)往復(fù)，直至模型的各項(xiàng)評(píng)價(jià)指標(biāo)符合標(biāo)準(zhǔn)且預(yù)測(cè)結(jié)果良好。最終，共篩選出65 批具備香菇一般特征的樣品，納入到NIR分析模型的構(gòu)建中。

圖3 杠桿值與參差異常測(cè)試值關(guān)系圖Fig.3 Relationship between studentized residual and leverage value

對(duì)比驗(yàn)證集的13 個(gè)樣品與校正集的65 個(gè)樣品信息的結(jié)果如表2所示。驗(yàn)證集樣品的總糖含量包含于校正集的范圍內(nèi)，即驗(yàn)證集的樣品可以使用校正集建立模型進(jìn)行分析。

表2 校正集和驗(yàn)證集香菇樣品中總糖含量范圍Table 2 Range of L.edodes samples’total sugar content in calibration set and validation set

2.3 NIR分析模型光譜區(qū)間的篩選

不同物質(zhì)在NIR光譜中吸收效果不同，而構(gòu)建NIR預(yù)測(cè)模型首先需要為樣品確定吸收度最好的光譜區(qū)間[22]。本實(shí)驗(yàn)分別利用4 個(gè)光譜區(qū)間對(duì)校正集的香菇樣品進(jìn)行建模，利用評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)模型的進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果如表3所示。

表3 光譜區(qū)間的篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3Results of screening for spectral ranges

光譜區(qū)間為4 000～10 000 cm－1時(shí)，即全光譜范圍的R2最大，RMSEC和RMSEP相對(duì)較小，其最小值分別為1.393、1.557，二者之比為0.895，符合模型構(gòu)建的基本要求，且RPD值大于3，RPD建模效果最好，且明顯優(yōu)于其他任一光譜區(qū)間。

2.4 NIR分析模型光譜預(yù)處理方法的選擇

在分析過(guò)程中，樣品的NIR光譜會(huì)存在噪聲信息，造成吸收光譜出現(xiàn)基線偏移、漂移等情況，這主要是受樣品的粒度、表面散射等因素影響[23-25]。因此，NIR光譜數(shù)據(jù)在使用前還需進(jìn)行預(yù)處理，減少非目標(biāo)因素對(duì)光譜的影響。本實(shí)驗(yàn)以多元散射校正（multiplicative scatter correlation，MSC）、標(biāo)準(zhǔn)正規(guī)變換（standard normal variation，SNV）、二階導(dǎo)數(shù)（SD，second derivative）、一階導(dǎo)數(shù)（first derivative，F(xiàn)D）共4 種預(yù)處理方式組合成不同的光譜預(yù)處理方法，且每種方法的降噪點(diǎn)數(shù)均為31，校正集樣品構(gòu)建模型的評(píng)價(jià)結(jié)果如表4所示。

表4 光譜預(yù)處理方法的篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4Results of screening for spectral preprocessing methods

由表4可知，香菇NIR分析模型的最佳預(yù)處理方法為MSC、SD，其R2最大，RMSEC和RMSEP最小值分別為1.393、1.557，二者之比為0.895，且RPD值大于3，各指標(biāo)均符合模型構(gòu)建的基本要求，由此得到的光譜圖如圖4。香菇樣品的NIR光譜信息經(jīng)預(yù)處理后基線十分平穩(wěn)，具有多個(gè)特定光譜吸收區(qū)間且吸收峰尖銳、對(duì)稱。

圖4 香菇樣品的最佳預(yù)處理NIR光譜圖Fig.4 NIR spectra of L.edodes samples after optimal data preprocessing

2.5 NIR分析模型PLS主因子數(shù)的確定

在使用PLS建立NIR分析模型時(shí)，PLS主因子數(shù)也是影響模型質(zhì)量的關(guān)鍵因素。主因子數(shù)過(guò)少或過(guò)多會(huì)出現(xiàn)欠擬合或過(guò)擬合情況，導(dǎo)致模型的預(yù)測(cè)誤差增加[26]。利用不同主因子數(shù)對(duì)校正集樣品構(gòu)建NIR分析模型，評(píng)價(jià)結(jié)果如表5所示。綜合模型評(píng)價(jià)指標(biāo)可知，當(dāng)主因子數(shù)為10時(shí)建模效果最好，其RPD值大于3，因此其結(jié)果明顯優(yōu)于其余2 組。

表5 主因子數(shù)的篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5Screening results for the number of PLS factors

2.6 香菇總糖含量的NIR分析模型

通過(guò)使用校正集樣品對(duì)光譜預(yù)處理方法、NIR光譜區(qū)間、PLS主因子數(shù)的逐一確定，最終得出預(yù)測(cè)香菇總糖含量的最優(yōu)NIR分析模型，該模型的各參數(shù)如表6所示。

表6 香菇樣品總糖的最優(yōu)NIR分析模型參數(shù)Table 6Parameters of the optimal NIR prediction model for the total sugar content of L.edodes samples

2.7 模型的外部驗(yàn)證與評(píng)價(jià)

用建立的NIR分析模型對(duì)驗(yàn)證集樣品進(jìn)行總糖含量的預(yù)測(cè)，并以預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果如圖5所示。驗(yàn)證集樣品的預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值均圍繞在y=x的參考線附近，因此二者十分接近。同時(shí)借助SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件將對(duì)應(yīng)預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值的比值與數(shù)值1作顯著性分析，結(jié)果如表7所示，二者不存在顯著差異（P=0.993）。此外通過(guò)Pearson相關(guān)性分析可知，二者的相關(guān)系數(shù)為0.971，呈顯著相關(guān)。由此看出本實(shí)驗(yàn)建立基于NIR光譜的定量預(yù)測(cè)模型的預(yù)測(cè)值與化學(xué)實(shí)測(cè)值之間無(wú)顯著差異。

圖5 驗(yàn)證集樣品的模型預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值的散點(diǎn)圖Fig.5 Scatter plot of model predicted versus measured values for validation set samples

表7 顯著性結(jié)果分析Table 7Results of significance test

3 討論與結(jié)論

NIR光譜技術(shù)已經(jīng)在食品行業(yè)廣泛應(yīng)用，且在國(guó)標(biāo)GB/T 25219—2010《糧油檢驗(yàn) 玉米淀粉含量測(cè)定 近紅外法》[27]、GB/T 24896—2010《糧油檢驗(yàn) 稻谷水分含量測(cè)定 近紅外法》[28]和GB/T 24899—2010《糧油檢驗(yàn) 小麥粗蛋白質(zhì)含量測(cè)定 近紅外法》[29]中已有應(yīng)用。Jiang Hui等[30]使用加權(quán)可變乘積散射校正算法處理原始光譜，建立PLS回歸模型，模型的R2為0.961 5，RMSEP為0.362 6，此模型實(shí)現(xiàn)了水稻中脂肪酸值的快速檢測(cè)；韓潔楠等[31]開(kāi)發(fā)了利用近紅外光譜快速檢測(cè)玉米粉中淀粉含量的方法，光譜預(yù)處理方法為旋光法、一階導(dǎo)數(shù)與去一條直線法，利用PLS建立模型，校正集的R2為0.909，RMSEP為0.609 00；孫陽(yáng)等[32]采用SNV、MSC的光譜預(yù)處理方法，利用PLS建模實(shí)現(xiàn)了對(duì)面粉中水分、灰分和面筋含量的快速、無(wú)損檢測(cè)，驗(yàn)證集的R2分別為0.898 77、0.970 81、0.932 37，RMSEP分別為0.327 10、0.041 39、1.314 70。本實(shí)驗(yàn)以我國(guó)香菇主產(chǎn)地的106 批香菇為研究對(duì)象，以香菇總糖含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用NIR光譜技術(shù)，結(jié)合計(jì)量學(xué)方法，采用PLS線性回歸分析，建立了香菇總糖含量測(cè)定NIR模型。

在建立的香菇總糖NIR分析模型時(shí)，最佳的預(yù)處理方式為MSC、SD，最佳光譜區(qū)間為4 000～10 000 cm－1，PLS主因子數(shù)為10時(shí)，模型預(yù)測(cè)能力最好。模型的R2、RMSEC、RMSEP和RPD值分別為0.940 04、1.393、1.557和4.08。根據(jù)驗(yàn)證集的檢驗(yàn)可知，其預(yù)測(cè)值和化學(xué)值之間的不存在顯著差異（P=0.993），Pearson相關(guān)系數(shù)為較理想的0.971。由此可知，相較于GB/T 25219—2010[27]、GB/T 24896—2010[28]和GB/T 24899—2010[29]，NIR光譜技術(shù)可以用于對(duì)香菇總糖含量的快速測(cè)定，且結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。本實(shí)驗(yàn)為市場(chǎng)中香菇的質(zhì)量控制和規(guī)范提供了便捷的檢測(cè)方法，有助于促進(jìn)香菇產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。