蘇 丹，黃剛驊，李亞莉，任洪濤，包云秀，周紅杰,*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術學院，云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學龍潤普洱茶學院，云南 昆明 650201；3.云南農(nóng)業(yè)大學香料研究所，云南 昆明 650201；4.云南省農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所，云南 勐海 666200）

茶葉的香氣物質(zhì)來源大致分為3 類。一類來自于茶葉品種本身[1]，在茶鮮葉生長過程中形成[2]，如紫娟品種的獨特香氣；另一類香氣是茶葉在制造過程中一系列化學變化產(chǎn)生的效應產(chǎn)物，這些物質(zhì)使茶葉的香氣更加豐富[3]，如：不同的黑茶由于作用微生物的不同而有不同的香氣特征，普洱熟茶的陳香[4-5]、六堡茶的檳榔香[6-8]、茯磚茶的菌花香[9]等；第3類香氣是耐貯藏型茶葉在科學貯藏的過程中發(fā)展而成的，此種茶葉的第1類和第2類香氣物質(zhì)會在貯藏過程中發(fā)生新的化學變化，使香氣更加醇厚，如普洱生茶經(jīng)陳化由清香、花香逐漸向陳香遞變[10-11]。

紫娟是云南大葉群體種中的一種高花青素茶樹品種[12]，具有良好的抗氧化活性和抗炎活性[13-14]。目前，關于紫娟茶香氣的研究主要集中在成茶香氣成分分析[15-19]，對紫娟（熟茶）香氣物質(zhì)在加工過程中的動態(tài)變化方面尚待探明。本研究采用頂空-固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜（headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）技術對紫娟（熟茶）7 個人工發(fā)酵階段樣進行揮發(fā)性成分分析，探明紫娟（熟茶）不同發(fā)酵階段揮發(fā)性香氣組分及香氣特征的動態(tài)變化，旨在為進一步探明紫娟（熟茶）發(fā)酵風味香與微生物之間的代謝關系提供理論依據(jù)，同時為紫娟（熟茶）微生物定向發(fā)酵、精準提升發(fā)酵茶產(chǎn)品質(zhì)量、提高發(fā)酵過程生物安全保障及發(fā)酵茶葉風味多元化開發(fā)提供基礎數(shù)據(jù)和理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗材料來自云南省西雙版納傣族自治州勐?？h。采集同一批從原料入堆（0 d）到發(fā)酵結(jié)束（42 d）的紫娟（熟茶）加工階段樣：F0：紫娟曬青茶（0 d）；F1：第1翻（7 d）；F2：第2翻（14 d）；F3：第3翻（21 d）；F4：第4翻（28 d）；F5：第5翻（35 d）；F6：出堆（42 d）。

1.2 儀器與設備

CTC自動進樣器、HP 7890A-5975C型GC-MS聯(lián)用儀、HP-5MS色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；65 μm聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯（polydimethylsiloxane/divinylbenzene，PDMS/DVB）萃取頭 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 HS-SPME條件

稱取磨碎均勻茶樣1.00 g（精確至0.001 g），放入20 mL頂空瓶中，加入1.00 μg癸酸乙酯作為內(nèi)標，對樣品的質(zhì)量進行監(jiān)控和對比，加入5 mL沸水，密封瓶口孵化。將CTC自動進樣器于60 ℃條件下穩(wěn)定10 min，保證進樣穩(wěn)定性；并采用65 μm PDMS/DVB萃取頭，在250 r/min、60 ℃條件下孵化50 min，所有樣品重復3 次，進行數(shù)據(jù)采集。

1.3.2 GC-MS聯(lián)用分析條件

以氦氣（He，純度＞99.999%）為載氣。HP-5MS色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），不分流進樣，進樣口溫度230 ℃，脫吸附時間5 min；升溫程序：初始溫度50 ℃保持5 min，再以6 ℃/min升至250 ℃，保持15 min。MS條件：電子電離源；離子源溫度230 ℃；接口溫度280 ℃；四極桿溫度150 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z35～500。

1.3.3 感官審評

依據(jù)GB/T 23776—2018《茶葉感官審評方法》，按照初制茶審評因子從外形（A）、湯色（B）、香氣（C）、滋味（D）和葉底（E）“五項因子”進行，茶湯制備方法參照黑茶（散茶）；品質(zhì)評定的綜合評分（Y）按百分制采用權(quán)數(shù)法：Y＝A×20%+B×15%+C×25%+D×30%+E×10%。

1.4 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)GC-MS分析得到色譜峰，色譜峰總離子流圖通過譜庫檢索（Wiley和NIST庫），根據(jù)相對保留指數(shù)，取相似指數(shù)大于80為有效數(shù)據(jù)，并結(jié)合相關文獻保留指數(shù)進行人工定性解析。對所有的相對峰面積數(shù)據(jù)進行標準化處理，依據(jù)各香氣成分峰面積歸一化的方法確定其相對含量。數(shù)據(jù)采用Origin Pro 20.0及Excel軟件（Excel 2016）處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫娟（熟茶）發(fā)酵階段揮發(fā)性成分的定性及含量分析

紫娟（熟茶）發(fā)酵過程中，共計定性鑒定出92 種已知揮發(fā)性成分（表1），根據(jù)主要官能團的差異，可分為7 類（圖1）：醇類、酮類、醛類、碳氫化合物、酸類、酚醚類和含氧雜環(huán)化合物。其中，碳氫化合物的種類最多（54 種），以烴、烯、烷、萘及其衍生物為主，酮類（11 種）、酚醚類（7 種）、醇類（7 種）、醛類（7 種）和含氧雜環(huán)化合物（5 種）的種類次之，最少的是酸類（1 種）。

圖1 揮發(fā)性成分分類Fig.1 Classification of volatile components identified

表1 揮發(fā)性成分及其相對含量Table 1Volatile components identified from tea samples and their relative contents

續(xù)表1

紫娟曬青茶揮發(fā)性成分相對含量為94.90%，共7 類56 種：醇類5 種，酮類5 種，醛類5 種，碳氫化合物37 種，酸類1 種，酚醚類2 種，含氧雜環(huán)化合物1 種。7、14、21、28、35 d和42 d，分別檢測出7 類64 種（97.86%）、7 類55 種（90.60%）、7 類46 種（93.06%）、7 類52 種（95.64%）、7 類60 種（94.66%）、7 類51 種（92.83%）。黑茶發(fā)酵過程中微生物胞外酶與底物相作用，促使底物發(fā)生轉(zhuǎn)化、降解、聚合或產(chǎn)生異構(gòu)體，從而形成不同的揮發(fā)性成分[20]。隨著發(fā)酵的進行，碳氫化合物大部分從C15～C20的烴、烯、烷、萘及其衍生物成為C8～C15的碳氫化合物，研究表明，碳氫化合物越高級香氣越濃、在C8～C15之間香氣最強[21]。

2.2 紫娟（熟茶）發(fā)酵過程中揮發(fā)性成分變化

2.2.1 不同發(fā)酵階段揮發(fā)性成分變化

茶鮮葉中揮發(fā)性物質(zhì)的種類相對較少，但制茶過程產(chǎn)物對茶香形成具有重要作用[20]。通過自然渥堆發(fā)酵，微生物與濕熱條件使紫娟曬青的揮發(fā)性香氣組分發(fā)生復雜的變化，形成紫娟（熟茶）獨特的風味特征。對應表1編號結(jié)合圖2進行分析。

圖2 紫娟（熟茶）發(fā)酵過程中揮發(fā)性成分動態(tài)變化Fig.2 Dynamic changes of volatile components in ripe Zijuan tea during fermentation

醛類：(E,E)-2,4-壬二烯醛、β-環(huán)檸檬醛、β-環(huán)檸檬醛混合物、異環(huán)檸檬醛、藏花醛幾乎存在于整個發(fā)酵過程，發(fā)酵結(jié)束(E,E)-2,4-壬二烯醛（4.60%）、β-環(huán)檸檬醛混合物（0.30%）、藏花醛（0.46%）的相對含量均低于紫娟曬青。苯甲醛、壬醛、異環(huán)檸檬醛存在發(fā)酵中間過程，可能是形成其他香氣組分的中間體。

碳氫化合物：發(fā)酵過程中，碳氫化合物具有種類多、含量微的特點，隨著發(fā)酵時間的延長，碳氫化合物的種類逐漸減少、單個物質(zhì)相對含量逐漸增加，其中，D-檸檬烯、γ-松油烯、β-石竹烯、(－)-氧化石竹烯、甜沒藥烯、長葉烯、δ-杜松烯、2,2,6,9-四甲基三環(huán)[8.1.0.01.6]十一烷-8-烯、2-環(huán)己基辛烷、十二烷、2-甲基十二烷、2,6,11-三甲基十二烷、5-丙基十三烷、環(huán)十四烷、3-甲基十五烷、十六烷、十七烷、十八烷、2-甲基十八烷、二十烷、姥鮫烷、萘、1-甲基萘、2,6-二甲基萘、1,1,6-三甲基-1,2-二氫萘及1,2,3,4-四氫-1,1,6-三甲基萘在發(fā)酵過程中含量豐富。

含氧雜環(huán)化合物：反式芳樟醇氧化物（呋喃），14 d相對含量達到最高5.70%，42 d相對含量降至0.25%；隨著發(fā)酵的進行，氧化芳樟醇、1,2,3-三甲氧基苯、1,2,4-三甲氧基苯和2-異丙基-1-甲氧基-4-甲基苯逐漸出現(xiàn)，其化合物的生成可能與發(fā)酵的堆溫及微生物的代謝活動有關。甲氧基苯呈現(xiàn)陳味與甜味，對花香及愉悅香氣具有掩蔽作用[22]，可作為紫娟（熟茶）發(fā)酵過程中的潛在氣味標記物[23]。

醇類：紫娟曬青檢測出芳樟醇（5.40%）、脫氫芳樟醇（3.51%）、法呢醇（0.17%）、柏木腦（1.10%）、2,2,6-三甲基-6-乙烯基四氫-2H-呋喃-3-醇（0.79%），發(fā)酵結(jié)束檢測出芳樟醇（9.69%）、α-松油醇（0.71%）、法呢醇（0.37%）、柏木腦（0.93%），但從紫娟曬青（5.40%）至7 d （33.44%）、14 d（24.88%）至21 d（9.92%）時芳樟醇的相對含量達到整個發(fā)酵最大變化階段。芳樟醇屬于單萜化合物，具有誘發(fā)鎮(zhèn)靜和增強睡眠的生理作用[24]，研究[25-27]表明，可由原核微生物中的大腸桿菌、真核微生物中的釀酒酵母[21]、解酯耶氏酵母、畢赤酵母、惡臭假單胞菌等微生物所分泌的萜類合酶及修飾酶作用于前體物質(zhì)生成，紫娟（熟茶）發(fā)酵7 d時芳樟醇相對含量增加，可能是發(fā)酵時所形成的微生物群落代謝的結(jié)果，對紫娟（熟茶）風味形成的作用仍需進一步研究。

酚醚類、酮類及酸類：β-萘甲醚、4-乙基苯甲醚、對苯二甲醚、2,4-二氨基苯甲醚、鄰硝基苯十二烷醚只在紫娟（熟茶）發(fā)酵過程（7～35 d）檢測出，酚醚類一般具有煙熏、刺鼻、異味等氣息[21]，可能是造成紫娟（熟茶）發(fā)酵過程中刺鼻性氣味、雜味的原因。酮類在發(fā)酵后期具有明顯的變化，特別是β-胡蘿卜素的降解產(chǎn)物[28]（α-紫羅蘭酮、β-紫羅酮），其中，具有紫羅蘭花的粉甜花香帶木香底韻的α-紫羅蘭酮和木香比α-紫羅蘭酮濃郁并帶果香香韻[21]的β-紫羅蘭酮含量逐漸降低甚至消失，具木香、花香、果香的二氫-β-紫羅蘭酮含量逐漸升高，揮發(fā)性成分種類的迭變可作為紫娟（熟茶）發(fā)酵進度判別的標準。

酸類：檢出1 種。(Z,Z)-5,11-二十碳二烯酸從紫娟曬青（0.50%）、7 d（0.53%）、14 d（0.37%）、35 d（0.38%）至發(fā)酵結(jié)束（0.16%）呈現(xiàn)連續(xù)變化。

2.2.2 不同發(fā)酵階段對香氣形成的相互作用

為解析紫娟（熟茶）不同發(fā)酵階段之間揮發(fā)性成分變化的相互關系及相互影響程度，對結(jié)果進行相關性分析，按照相關系數(shù)的大小主要將相關程度分為以下4 個情況：|r|≥0.8時，變量之間高度相關；0.5≤|r|＜0.8時，中度相關；0.3≤|r|＜0.5時，低度相關或弱相關；|r|＜0.3時，極弱相關或不相關[29-30]。表2表明：F0（0 d）和F1（7 d）之間相關系數(shù)為0.446 8，低度相關；F1（7 d）和F2（14 d）之間相關系數(shù)為0.920 36，高度相關；F2（14 d）和F3（21 d）之間相關系數(shù)為0.541 37，中度相關；F3（21 d）和F4（28 d）之間相關系數(shù)為0.978 34，高度相關；F4（28 d）和F5（35 d）之間相關系數(shù)為0.985 82，高度相關；F5（35 d）和F6（42 d）之間相關系數(shù)為0.245 53，小于0.3，極弱相關；7 個樣品間的所有相關系數(shù)大于0，則7 個樣品相互之間均為正相關。由此可知，發(fā)酵開始時紫娟曬青茶原料的質(zhì)量對于生產(chǎn)過程中品質(zhì)的改善及發(fā)酵結(jié)束后成品茶香氣質(zhì)量的提升具有重要作用，7 d（F1）至35 d（F5）的過程，是紫娟（熟茶）揮發(fā)性成分發(fā)生重要變化，奠定紫娟（熟茶）香氣品質(zhì)形成的關鍵時期。

表2 相關系數(shù)Table 2Correlation coefficients

2.3 紫娟（熟茶）發(fā)酵過程中香氣特征分析

食品的風味根據(jù)來源不同，有植物的風味、肉類的風味[31]，風味濃度不同造成食品的營養(yǎng)性或毒性不同[32]，利用分析儀器與評價人員感官評價相結(jié)合方法成為感官科學研究的新方向[33]。感官審評結(jié)合GCMS、GC-嗅聞等技術探明普洱茶發(fā)酵過程中的香氣變化規(guī)律，實現(xiàn)發(fā)酵茶的工業(yè)化生產(chǎn)監(jiān)控并用于形成應用廣泛、具有實際應用效果的茶葉風味輪，是保證普洱茶質(zhì)量及實現(xiàn)茶產(chǎn)業(yè)科學化、安全化發(fā)展的前提。由表3可知，根據(jù)審評總得分，發(fā)酵過程中第3翻（F3）整體品質(zhì)較好；香氣方面，紫娟曬青（F0）呈現(xiàn)花香、果香、辛香，第1翻（F1）為果香、花果香，第2翻（F2）為熟果香、菌香有陳香，隨著發(fā)酵的進行，陳香及酵香逐漸成為主要的香氣特征，出堆時陳香減弱、香氣呈現(xiàn)為木香帶甜香、清涼感有辛香。紫娟（熟茶）人工發(fā)酵階段具有較多不可控因素的影響，結(jié)合GC-MS技術探明發(fā)酵過程中香氣變化規(guī)律，對實現(xiàn)發(fā)酵茶工業(yè)化監(jiān)控具有重要意義。

表3 感官審評結(jié)果Table 3Sensory evaluation results

根據(jù)GC-MS分析結(jié)果，從7 個發(fā)酵階段樣中共檢測出揮發(fā)性成分92 種，結(jié)合相關文獻[21,34]，其中47 種具有明確的香氣特征定性結(jié)果。結(jié)合定量分析，47 種明確香氣特征定性成分從紫娟曬青、7、14、21、28、35 d和42 d相對含量分別為58.49%、70.53%、59.08%、36.14%、44.94%、42.98%、67.17%，發(fā)酵結(jié)束時具有明顯香氣特征的物質(zhì)貢獻率比紫娟曬青高8.68%，紫娟經(jīng)過發(fā)酵過程可以豐富茶葉香氣。

表4表明，(E,E)-2,4-壬二烯醛、p-傘花烴、芳樟醇、四氫-2,2,6-三甲基-6-乙烯基-3-吡喃酮、脫氫芳樟醇、2,2,6-三甲基-6-乙烯基四氫-2H-呋喃-3-醇、β-環(huán)檸檬醛、異環(huán)檸檬醛、α-紫羅蘭酮、β-紫羅蘭酮及法呢醇具有花香，累計相對含量為27.73%；脫氫芳樟醇、β-石竹烯及甜沒藥烯具有辛香，累計相對含量為8.69%；5,6,7-六氫-1,1,4a-三甲基-2(1H)-萘酮、2,2,6-三甲基環(huán)庚烷、反式芳樟醇氧化物、芳樟醇、藏花醛、β-石竹烯、α-紫羅蘭酮、β-紫羅蘭酮、δ-杜松烯、柏木腦具有木香，累計相對含量為18.13%；(E)-β-羅勒烯、羅勒烯、脫氫芳樟醇、甜沒藥烯及法呢醇具有草本香，累計相對含量為7.20%；松油烯、D-檸檬烯、γ-松油烯、β-環(huán)檸檬醛、β-紫羅蘭酮及芳樟醇具有果香，累計相對含量為19.79%；萘、1-甲基萘及(－)-氧化石竹烯具有刺激性，累計相對含量為1.21%。由此可知，紫娟曬青的香氣特征主要為花香、果香、辛香，此結(jié)果與感官審評結(jié)果一致。

表4 紫娟曬青（F0）香氣特征Table 4Aroma characteristics of sun-dried Zijuan tea leaves

表5表明，紫娟人工發(fā)酵過程中揮發(fā)性成分香氣特征類型增多：花香（玫瑰花、海桐花、紫丁花、紫羅蘭花）、果香（熟果香、漿果香）、杏仁香、木香、奶香、脂香、甜香、辛香和清涼感，與紫娟曬青相比，花香型揮發(fā)性成分種類較紫娟曬青增加了順式-α,α,5-三甲基-5-乙烯基四氫呋喃-2-甲醇、二氫-β-紫羅蘭酮、α-松油醇、(+)-二氫香芹酮異構(gòu)體混合物、2-十二酮、壬醛、反-5-癸烯醇、異水菖蒲酮及香樹烯氧化物；果香、木香、辛香及刺激性的揮發(fā)性成分種類差異不大；并在發(fā)酵過程產(chǎn)生發(fā)酵獨有的堅果香——苦杏仁香（苯甲醛）、動物香——奶香（對甲氧基苯乙烯）及微生物發(fā)酵氣味。結(jié)合感官審評，紫娟（熟茶）的香氣特征：花香（紫羅蘭花、玫瑰花）、甜香、木香（溫和木香）及微弱辛香。

表5 紫娟發(fā)酵過程（F1～F6）香氣特征Table 5 Aroma characteristics of ripe Zijuan tea during fermentation

3 討 論

經(jīng)不同發(fā)酵階段揮發(fā)性香氣組分動態(tài)變化分析表明芳樟醇在整個發(fā)酵過程中變化明顯，芳樟醇是香氣比較復雜的化合物，兼有花香、果香和木香且香氣柔和、輕揚透發(fā)[35]，脫氫芳樟醇含量過高，會掩蓋芳樟醇的花香氣息使其果香氣息濃厚，紫娟曬青中脫氫芳樟醇相對含量為3.51%、芳樟醇相對含量為5.40%，此時芳樟醇的香氣表現(xiàn)可能以淡弱的柑桔類果香韻調(diào)[21]為主；隨著發(fā)酵的進行，脫氫芳樟醇在發(fā)酵7 d時消失，則后續(xù)發(fā)酵階段，芳樟醇將會凸顯花香特征，這可能是紫娟（熟茶）發(fā)酵過程香氣逐漸豐富的原因之一。

紫娟經(jīng)過發(fā)酵過程可以提升香氣的豐富性，發(fā)酵過程中產(chǎn)生發(fā)酵獨有的堅果香——苦杏仁香（苯甲醛）、動物香——奶香（對甲氧基苯乙烯）及微生物發(fā)酵氣味。研究[21]表明，微生物發(fā)酵產(chǎn)生的典型香氣化合物主要有萜烯類化合物、酯類及內(nèi)酯類化合物、吡嗪化合物，如橙花醇、癸內(nèi)酯、異戊酸異戊酯等，進一步明確紫娟（熟茶）發(fā)酵風味香與微生物之間的代謝關系，也成為亟待解決的問題，此問題的解決可為微生物定向發(fā)酵、精準控制發(fā)酵茶產(chǎn)品質(zhì)量、發(fā)酵過程生物安全保障及發(fā)酵茶葉風味多元化開發(fā)提供理論基礎和數(shù)據(jù)參考。

4 結(jié) 論

脫氫芳樟醇、β-石竹烯及甜沒藥烯是紫娟茶辛香特征的主要揮發(fā)性成分。紫娟曬青茶原料的質(zhì)量對于生產(chǎn)過程中香氣品質(zhì)的改善及出堆后質(zhì)量的提升具有重要作用，發(fā)酵7～35 d的過程，是紫娟（熟茶）揮發(fā)性成分發(fā)生重要變化，形成紫娟（熟茶）香氣特征的關鍵期。紫娟（熟茶）人工發(fā)酵過程香氣特征的變化：紫娟曬青（花香、果香、辛香）→發(fā)酵過程（花香、木香、辛辣感、微生物發(fā)酵香及杏仁香）→紫娟（熟茶）（花香（紫羅蘭花、玫瑰花）、甜香、溫和木香及微弱辛香），發(fā)酵而成的紫娟（熟茶）香氣豐富性及甜香感增強。