劉靜波，王子秦，于一丁，張 婷，劉博群*

（吉林大學食品科學與工程學院，吉林省營養(yǎng)與功能重點實驗室，吉林 長春 130062）

本研究以豆粕為原料，通過超聲輔助酶解制備ACE抑制活性肽，并進行分離純化、結構鑒定，采用分子對接技術闡述ACE抑制活性肽的作用機理，旨在為豆粕原料深加工和高效利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂大豆粕 中國長春市華程生物技術有限公司；復合風味蛋白酶（酶活力500 LAPU/g） 諾維信公司；馬尿酸馬尿酰-組胺酰-亮氨酸、A6778 ACE（來自兔肺，3.7 U/mg蛋白質(zhì)（Warbur-Christian改性），批號SLBZ2889） 美國Sigma公司；氫氧化鈉 北京化工廠；乙腈、甲酸、三氟乙酸（均為色譜純） 美國Fisher Scientific公司；合成肽 生工生物工程（上海）股份有限公司；P0017考馬斯亮藍快速染色液 上海碧云天生物技術公司；PR1300超低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)Marker（3.3～20.1 kDa）、P1320 Tris-Tricine-十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝膠制備試劑盒 北京索萊寶生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

JY92-2D超聲波細胞破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；XX8200230小型切向流超濾系統(tǒng)美國密理博公司；蛋白純化系統(tǒng) 瑞典?KTA公司；FD-1A-50冷凍干燥機 上海比朗儀器制造有限公司；Orbitrap Elite高場靜電場軌道離子阱質(zhì)譜儀 美國Thermo Fisher公司；LC-2010超高效液相色譜儀 日本Shimadzu公司；Z800計算工作站 美國惠普公司；FD-1A-50冷凍干燥機 上海比朗儀器制造有限公司；Chemi Doc凝膠成像儀 美國伯樂公司；TY-80B脫色搖床常州市國立實驗設備研究所。

1.3 方法

1.3.1 豆粕肽的制備

將豆粕粉碎后過60 目篩，按底物質(zhì)量濃度4 g/100 mL制備豆粕水溶液，并調(diào)至復合風味蛋白酶的最適pH值為6.5，磁力攪拌15 min。隨后進行超聲波預處理（150 W，12 min），再置于酶的最適溫度50 ℃恒溫水浴鍋中，酶與底物質(zhì)量之比為1∶100，酶解7 h后，進行滅酶操作（90 ℃，10 min），將酶解液冷卻至室溫后，進行離心處理（4 ℃、4 000 r/min離心10 min），收集上清液進行下一步分離純化。

1.3.2 豆粕肽的分離純化及分子質(zhì)量分布鑒定

所以，不能簡單地認為模式創(chuàng)新降低了某方面成本，就意味著整體成本的降低。在今天看來，成本這本賬不是一個簡單的加減法。

將酶解上清液用Tris-Tricine-SDS-PAGE方法對其分子質(zhì)量分布進行鑒定，隨后用截留分子質(zhì)量為0.2、1、3、10 kDa和30 kDa的超濾膜進行分離，收集5 種豆粕肽組分（0.2～1、1～3、3～10、10～30、＞30 kDa），對比各自體外ACE抑制活性值，并選取最優(yōu)的活性組分（0.2～1 kDa）經(jīng)過?KTA蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)（層析介質(zhì)SephadexG15、上樣量4 mL、洗脫流速1.0 mL/min）進一步分離純化，將分離得到的5 個不同峰（F1、F2、F3、F4、F5）組分進行收集，經(jīng)真空冷凍干燥后，－20 ℃貯存，以備進行體外ACE抑制活性指標測定。

1.3.3 豆粕肽體外ACE抑制活性的測定

采用實驗室已建立的高效液相色譜法[24]。

1.3.4 ACE抑制肽序列鑒定

利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜對ACE抑制活性最高的純化組分F2峰進行鑒定。通過Orbitrap Elite質(zhì)譜儀的EASY-nLC 1000系統(tǒng)分析樣品，色譜條件：色譜柱填料為C18，預柱（長度2 cm、內(nèi)徑100 μm），分析柱（長度15 cm、內(nèi)徑75 μm）；流動相：A相為0.1%甲酸溶液（V/V），B相為0.1%甲酸-乙腈溶液（V/V）；梯度洗脫：0～2 min，98%A，2% B；2～77 min，98%～65% A，2%～35% B；77～81 min，65%～25% A，35%～75% B；81～91 min，25% A，75% B；進樣量2 μL；流速300 nL/min。

質(zhì)譜條件：離子化方式：電子電離源；電壓：2 200 V；質(zhì)量掃描范圍m/z350～1 600，選取一級譜后3 s內(nèi)信號最好的峰做二級碎裂，碎裂模式為高能誘導裂解技術（higher energy collision induced dissociation，HCD）。在數(shù)據(jù)依賴模式下運行，在傅里葉變換模式下進行全質(zhì)譜掃描，分辨率為60 000。自動增益控制目標為4×105一級離子軌道掃描和5×104二級質(zhì)譜掃描。動態(tài)排除采用以下參數(shù)：隔離窗口m/z2；重復計數(shù)1；重復持續(xù)時間25 s；排除時間為60 s。所得結果經(jīng)過與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（UniProt）比對，得到氨基酸序列。

1.3.5 ACE抑制活性肽的合成

采用9-芴基甲氧基羰基保護基（9-fluorenylmethyloxycarbonyl，F(xiàn)MOC）固相合成方法合成寡肽（純度98%），由上海生工生物工程股份有限公司協(xié)助完成。

1.3.6 分子對接[25]及ACE抑制肽活性機制解析

先利用AutoDock Tools 1.5.4軟件對活性肽配體和ACE受體進行對接前的準備，再通過軟件AutoDock 4.2進行活性肽與ACE晶體結構展開半柔性分子對接計算[26]，最后對分子對接的結果進行可視化處理，具體操作如下：

從RCSB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（http://www.rcsb.org/）獲得ACE晶體結構（PDB ID：1O86）。大分子受體的準備：去除1O86周圍的水分子以及小分子配體（GLY2000、LPR702），保留Zn2+、Cl－和ACE蛋白，再加力場，獲得pdb格式文件；加極性氫并添加原子類型后保存為pdbqt格式文件。小分子肽配體的準備：運用CHARMM力場對小分子肽進行能量最小化處理獲得pdb格式文件；判定肽的root后選擇配體的可旋轉鍵，保存為pdbqt格式文件并手動更改可旋轉鍵數(shù)。格點（Grid）文件的準備：為了提高ACE與活性肽對接的準確度，采用Zn2+的空間坐標為中心（中心坐標為x=43.821，y=38.240，z=46.712）建立一個間距為0.375 ?，大小為100 ?×100 ?×100 ?的反應約束盒子[27]。將準備好的受體“1O86”的pdbqt格式文件和配體“肽”的pdbqt格式文件進行分子對接：運用拉馬克遺傳算法對分子對接能量進行優(yōu)化并進行200 次對接模擬，最終保存為“1O86-肽”dpf格式文件。分別通過Discovery Studio可視化版本、PyMOL蛋白可視化軟件對ACE抑制肽與ACE蛋白分子間相互作用（靜電力、氫鍵、親水/疏水作用力等）進行分析和展示[28]，同時確定肽周圍3.5 ?的ACE上的氨基酸殘基，從而對ACE抑制肽活性機制進行解析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結果與分析

2.1 豆粕肽分子質(zhì)量和分離純化后不同組分體外ACE抑制活性分析

首先對制備出豆粕肽的分子質(zhì)量進行鑒定，Tris-Tricine-SDS-PAGE結果如圖1A所示，豆粕肽的分子質(zhì)量主要集中在6 000 Da以下分布。對其超濾分離后，得到了5 組不同分子質(zhì)量的豆粕肽進行ACE抑制活性測定，低分子質(zhì)量（200～1 000 Da）的抑制活性較高，達到了217.33 μg/mL（圖1B）。這一現(xiàn)象與Pihlanto等[29]研究結果相符合，一方面可能是因為分子質(zhì)量在1 000 Da以下的超濾組分可能包含了酶解液中多數(shù)的ACE抑制活性肽，另一方面可能是因為ACE與肽結合位點是在ACE的活性中心，且存在疏水孔道，分子質(zhì)量太大的肽無法進入此通道，導致分子質(zhì)量較小的肽可能具有更高的ACE抑制活性。對低分子質(zhì)量（200～1 000 Da）的豆粕肽進一步經(jīng)過色譜純化，得到了峰圖（圖1C）并經(jīng)體外ACE抑制活性實驗得到F2峰的ACE抑制活性較高，其IC50可低至（97±0.5）μg/mL（圖1D）。故本研究將低分子質(zhì)量（200～1 000 Da）肽中的F2組分進行肽序列鑒定。

圖1 豆粕肽分子質(zhì)量及ACE抑制活性分析Fig.1 The analysis for molecular mass of peptides from soybean meal and ACE-inhibiting activity

2.2 ACE抑制肽序列鑒定結果

將200～1 000 Da的豆粕肽酶解液組分經(jīng)?KTA繼續(xù)純化得到的F2組分凍干樣品通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進行鑒定，所得二級質(zhì)譜結合軟件分析及蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，鑒定并選取三肽22 條（GCP、GDP、GGP、GGW、GHP、GMP、GRP、GTY、GVW、GYW、IEW、ILP、IQP、LEP、LLY、VHP、VPP、VPW、VRP、VSP、VTP、VWW）；四肽序列25 條（GCPP、GGCP、GGGW、GHDP、GKSP、GLVP、GNLP、GPVY、GTYW、GVRP、GWCP、IVTP、LALP、LASP、LCGY、LGRP、LKIW、LDDY、LILP、LNKY、LVPP、VPWP、VQVP、VVTP、VYVW）；五肽序列34 條（GDDFW、GEQMP、GGCPP、GGPVY、GGVRP、GGWCP、GHDPY、GLDDY、GLVPP、GSCLY、GWCTW、IDDGW、IIVTP、IQFAP、IQPDW、ISGGP、LAKAY、LCGYW、LEENY、LFEDP、LKVHP、LSEEY、LTEVP、LTVSP、VEQVY、VFAVY、VGHDP、VGLVP、VHCAY、VKFDY、VPGMP、VQVPW、VSLEP、VTPSP），再以最低預測自由能為評價指標，通過AutoDock進行虛擬篩選，共得到2 個最低預測結合能較優(yōu)的多肽序列，四肽GVRP和五肽IIVTP的最低預測自由能分別為－8.44 kcal/mol和－9.04 kcal/mol。一般來說，對接最低預測結合能值越低，表示ACE-肽結合越緊密，ACE-肽復合物越穩(wěn)定。

圖2C表明GVRP通過HCD碰撞斷裂所產(chǎn)生的bn與yn離子系列，其中b2離子157.12、b3離子313.23分別與m/z157.10、313.20相匹配，y1離子116.10、y2離子272.14、y3離子371.19以及y4離子427.23分別與m/z116.07、272.17、371.24以及427.25相匹配，其中有誤差的均為部分減水、減氫導致，并已經(jīng)標注。

圖2 GVRP（A）、IIVTP（B）的結構式及GVRP（C）、IIVTP（D）的二級質(zhì)譜圖Fig.2 Structural formulae of GVRP (A) and IIVTP (B), and secondary MS of GVRP (C) and IIVTP (D)

同理，對IIVTP（Ile-Ile-Val-Thr-Pro）進行同樣的數(shù)據(jù)分析和討論，其結構式如圖2B所示，二級質(zhì)譜圖（圖2D）結果表明IIVTP通過HCD碰撞斷裂所產(chǎn)生的bn與yn離子系列，其中b2離子227.15、b3離子326.20和b3離子427.29分別與m/z227.18、326.24、427.29相匹配，y1離子116.10、y2離子217.12、y3離子316.18、y4離子429.15以及y5離子541.34分別與m/z116.07、217.12、316.19、429.27及541.35相匹配，其中有誤差的均為部分減水、減氫、減氨基的原因所致，并已經(jīng)標注。

2.3 ACE抑制肽的合成與活性測定

對四肽GVRP和五肽IIVTP采用FMOC固相合成方法合成，并利用高效液相色譜法測定其體外ACE抑制活性，IC50值分別為（84±0.06）、（77±0.08）μmol/L，IC50值越小活性越大。經(jīng)過對GVRP、IIVTP的IC50與酶解液的IC50統(tǒng)一單位（μg/mL）進行比較，計算可得其IC50分別為：GVRP（35.91 μg/mL）、IIVTP（41.71 μg/mL），由此可得合成的純肽GVRP、IIVTP的ACE抑制活性明顯好于200～1 000 Da中F2峰酶解液的ACE抑制活性（（97±0.5）μg/mL）。GVRP的分子質(zhì)量是427.5 Da，等電點為pH 11.05；IIVTP的分子質(zhì)量是541.69 Da，等電點為pH 5.52。這與Iwaniak等[30]的研究結果一致：體外ACE抑制活性的肽序列常常表現(xiàn)出以下2 種特征：N端為疏水性氨基酸，尤其是包含有脂鏈的氨基酸Gly、Ile、Leu、Val；C端包含有芳香環(huán)的氨基酸Pro、Tyr、Trp。

2.4 分子對接與豆粕ACE抑制肽的抑制機理解析

研究表明，ACE抑制肽的氨基酸構成與它的抑制活性有著緊密的關系，所以，四肽和五肽的氨基酸殘基和ACE相互作用關系的探討有助于對ACE抑制活性機理進一步解析[31-32]。通過AutoDock程序研究了GVRP、IIVTP對ACE的抑制機制，從分子角度闡述優(yōu)選出的ACE抑制活性肽與ACE結合的具體關系。

配體與ACE殘基的過近接觸示意圖如圖3所示。過近接觸是指至少有一個原子存在于配體周圍3.5 ?范圍內(nèi)。由表1可知，四肽GVRP與ACE的氨基酸殘基Glu403（OE2：2.0 ?；OE1：2.0 ?）、Glu384（OE2：2.0 ?）、Tyr523（OH：2.1 ?）之間形成了4 個氫鍵，其中GVRP和氨基酸殘基Glu403之間含有2 個氫鍵鹽橋；與Glu384之間含有1 個氫鍵鹽橋；與Tyr523之間形成的傳統(tǒng)氫鍵且氫鍵的鍵長最長，結合最不緊密。五肽IIVTP與ACE的氨基酸殘基Lys511（HZ3：2.8 ?）、Gln281（HE22：1.7 ?）、His353（HE2：2.0 ?；HE1：2.1 ?）、His513（HE2：3.0 ?；HE1：1.7 ?）、Glu162（OE2：1.8 ?）、Asp377（OD1：2.6 ?）之間形成了8 個氫鍵，其中GVRP和氨基酸殘基Lys511之間含有1 個氫鍵鹽橋；與Gln281、Glu162之間各含有1 個傳統(tǒng)氫鍵；與His353、His513之間分別形成1 個傳統(tǒng)氫鍵和1 個碳氫鍵；與Asp377之間形成1 個碳氫鍵。其中與Gln281的傳統(tǒng)氫鍵鍵長和與His513的碳氫鍵鍵長較其他氫鍵相比最短，結合最為緊密。

圖3 GRVP（A）與IIVTP（B）結合ACE活性中心Fig.3 Active binding sites of ACE for GVRP (A) and IIVTP (B)

表1 GVRP與ACE間氫鍵作用、IIVTP與ACE間氫鍵作用Table 1Hydrogen bonding between GVRP and ACE, and between IIVTP and ACE

與此同時，找到GVRP、IIVTP配體周圍過近接觸在3.5 ?范圍內(nèi)的ACE氨基酸殘基（表2），因為這些殘基對配體和受體的結合起到至關重要的作用，比如疏水作用力和靜電力，通過比對發(fā)現(xiàn)GVRP和IIVTP配體周圍共有的過近接觸ACE氨基酸殘基為His513、Ala354和Glu384，極大程度上豐富了ACE可能活性位置的研究。

表2 GVRP與ACE間存在過近接觸的ACE殘基、IIVTP與ACE間存在過近接觸的ACE殘基Table 2Residues of ACE closely contacting with GVRP and those closely contacting with IIVTP

樊玥[33]通過分子對接結果得出ACE含有活性口袋S1、S1’、S2，口袋S1中包含氨基酸殘基Ala354、Glu384、Tyr523，口袋S1’包含氨基酸殘基Glu162，口袋S2包含氨基酸殘基Gln281、His353、Lys511、His513和Tyr520。管驍?shù)萚34]指出常見的ACE活性口袋包含以下氨基酸殘基：His353、Ala354、Ser355、Ala356、Val380、His383、Glu384、His387、Glu411、Lys511、Phe512、His513、Val518、Tyr520、Arg522、Tyr523。經(jīng)過比對發(fā)現(xiàn)GVRP可以與ACE的S1活性口袋中的2 個氨基酸殘基Glu384、Tyr523進行結合；IIVTP可以分別與ACE的S1’活性口袋氨基酸殘基Glu162，以及ACE的S2活性口袋氨基酸殘基Lys511、Gln281、His513、His353進行結合。

對比GVRP和IIVTP與ACE結合產(chǎn)生的氫鍵個數(shù)可以發(fā)現(xiàn)，GVRP的氫鍵個數(shù)為4 個，IIVTP的氫鍵個數(shù)為8 個，研究表明短肽與ACE形成越多的氫鍵，具有越強的相互作用[35]，與ACE抑制活性GVRP的IC50值（84±0.06）μmol/L，IIVTP的IC50值（77±0.08）μmol/L相吻合，即IIVTP的活性優(yōu)于GVRP的活性。由此可知，肽和越多的ACE活性口袋結合時，其抑制活性顯著增強；且短肽與ACE形成越多越強的氫鍵，就能夠顯著增強ACE和短肽的分子間相互作用，同時可以提高肽的ACE抑制活性。

3 結 論

目前，豆粕肽的研究主要集中在優(yōu)化制備階段，進一步分離提純、鑒定活性肽氨基酸序列，獲得具有較高生物活性的多功能小肽，是今后研究的主要方向。本實驗采用質(zhì)譜和分子對接技術，最終篩選出ACE抑制活性較強的四肽Gly-Arg-Val-Pro（GVRP）和五肽Ile-Ile-Val-Thr-Pro（IIVTP）。通過體外ACE抑制活性測定其IC50值為（84±0.06）μmol/L和（77±0.08）μmol/L；最低預測結合能分別為－8.44 kcal/mol和－9.04 kcal/mol。通過分子對接技術發(fā)現(xiàn)GVRP、IIVTP與ACE的活性口袋S1、S1′、S2中的殘基具有較強的結合力，且IIVTP可同時與S1′和S2活性口袋中多個氨基酸殘基結合，這也可能是IIVTP活性強于GVRP的原因。本方法的建立為后續(xù)深度開發(fā)豆粕肽的高價值利用提供了參考與借鑒。