王澤晗，陶昱豪，孫黎明，劉 嘉,2，杜 明，王震宇,*

（1.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，國(guó)家海洋食品工程技術(shù)研究中心，海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，遼寧 大連 116034；2.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 貴州生物技術(shù)研究所，貴州 貴陽(yáng) 550006）

酸酢魚(yú)是一種苗族特色傳統(tǒng)發(fā)酵水產(chǎn)制品，以貴州為代表的中國(guó)西南地區(qū)自古缺少食鹽資源，酸酢魚(yú)通過(guò)發(fā)酵階段，微生物的生長(zhǎng)而隨之產(chǎn)生酸性物質(zhì)可降低產(chǎn)品pH值，從而達(dá)到延長(zhǎng)蛋白類(lèi)食品保質(zhì)期的目的。酸酢魚(yú)產(chǎn)品酸辣可口，具有鮮明的民族特色，是能夠走向世界的、具有較高開(kāi)發(fā)價(jià)值的傳統(tǒng)民族水產(chǎn)制品[1]。但是現(xiàn)階段酸酢魚(yú)的加工方式主要以傳統(tǒng)小作坊及家庭自制為主，其發(fā)酵過(guò)程中微生物菌群變化、產(chǎn)品品質(zhì)變化規(guī)律等基礎(chǔ)性問(wèn)題尚未揭示，造成了產(chǎn)品發(fā)酵生產(chǎn)周期長(zhǎng)、批次間品質(zhì)不穩(wěn)定等突出問(wèn)題。為解決上述問(wèn)題，挖掘傳統(tǒng)工藝中酸酢魚(yú)產(chǎn)品的品質(zhì)變化規(guī)律對(duì)指導(dǎo)產(chǎn)品穩(wěn)定化、規(guī)?；a(chǎn)具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)以傳統(tǒng)制作工藝加工的苗族酸酢魚(yú)為研究對(duì)象，對(duì)發(fā)酵過(guò)程中微生物菌群結(jié)構(gòu)變化、游離氨基酸含量和水分分布動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行了分析，為探索和實(shí)現(xiàn)這一傳統(tǒng)美食的工業(yè)化奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豐鯉品種的鯉魚(yú)35 條，每尾質(zhì)量約2 kg，購(gòu)買(mǎi)于大連市甘井子區(qū)仟和農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

氨基酸標(biāo)準(zhǔn)混合溶液 日立高新技術(shù)公司；BCA蛋白定量試劑盒 北京Solarbio有限公司；E.Z.N.A.?soil試劑盒 美國(guó)Omega BioTek公司；AxyPrep DNA Gel Extraction試劑盒 美國(guó)Axygen Biosciences公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LA 8080氨基酸分析儀 日本Hitachi公司；Flx800酶標(biāo)儀 美國(guó)BioTek公司；QuantiFluor?-ST微型熒光計(jì) 美國(guó)Promega公司；NMI20-030H-1核磁共振成像分析儀 蘇州紐邁分析儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酸酢魚(yú)制作

采用貴州苗族傳統(tǒng)加工工藝制作酸酢魚(yú)。將鯉魚(yú)去掉頭、尾、鱗和內(nèi)臟；清洗后切段，將魚(yú)切成每段約100 g；在魚(yú)肉的內(nèi)外均勻涂抹食鹽，食鹽使用量為魚(yú)肉質(zhì)量的8%；涂抹玉米粉，玉米粉的使用量約為加食鹽前魚(yú)肉質(zhì)量的6%；涂抹后晾曬12 h以瀝干水分；最后裝罐密封，將魚(yú)放置在25 ℃左右的環(huán)境中發(fā)酵。在發(fā)酵第0、2、4、8、12、18、24天時(shí)取魚(yú)肉樣品，樣品一式3 份，取出的樣品在－80 ℃保存。

1.3.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增

使用E.Z.N.A.?soil試劑盒將樣品中細(xì)菌的總DNA抽提出來(lái)，利用Nano Drop 2000檢測(cè)DNA的濃度和純度，再用1 g/100 mL瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取質(zhì)量。選用引物338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’），通過(guò)此引物擴(kuò)增細(xì)菌基因的V3-V4可變區(qū)，擴(kuò)增時(shí)首先95 ℃預(yù)變性3 min，之后以95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共27 個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。

1.3.3 Illumina MiSeq測(cè)序及數(shù)據(jù)處理

利用QuantiFluorTM-ST微型熒光計(jì)進(jìn)行檢測(cè)定量。利用Illumina公司的MiSeq PE300平臺(tái)對(duì)純化的樣本進(jìn)行細(xì)菌rRNA基因的高通量測(cè)序分析。使用UCHIME軟件剔除嵌合體。利用RDP classifier對(duì)每條序列進(jìn)行物種分類(lèi)注釋?zhuān)葘?duì)Silva數(shù)據(jù)庫(kù)（SSU123），設(shè)置比對(duì)閾值為70%。利用軟件Mothur 1.30.1分析，用于微生物單樣本多樣性（a多樣性）指數(shù)的計(jì)算。

1.3.4 游離氨基酸的測(cè)定

稱(chēng)取發(fā)酵第0、2、4、8、12、18、24天的魚(yú)肉3 g，加入12 mL去離子水，7 000 r/min勻漿2 min。將所獲得的勻漿液4 ℃、10 000×g離心10 min。取0.5 mL的上清液加入1 mL丙酮，充分搖勻，靜置5 min；10 000×g、4 ℃離心15 min，離心后的上清液氮?dú)獯蹈?。加?.02 mol/L的鹽酸溶液1 mL進(jìn)行復(fù)溶，經(jīng)過(guò)0.22 μm濾膜過(guò)濾，采用LA 8080氨基酸分析儀進(jìn)行測(cè)定。

在電力行業(yè)的市場(chǎng)化運(yùn)營(yíng)中，市場(chǎng)需求的不確定性和風(fēng)險(xiǎn)偏好直接影響到購(gòu)電商的決策。研究基于用電戶(hù)隨機(jī)需求構(gòu)建購(gòu)電商決策模型，用前景理論刻畫(huà)購(gòu)電商的風(fēng)險(xiǎn)規(guī)避度，為購(gòu)電商提供最優(yōu)決策。結(jié)論表明購(gòu)電商最優(yōu)購(gòu)電量隨市場(chǎng)風(fēng)險(xiǎn)或零售價(jià)格的增大而增大；購(gòu)電商最優(yōu)購(gòu)電量隨購(gòu)電商風(fēng)險(xiǎn)規(guī)避度、批發(fā)價(jià)格或銷(xiāo)售變動(dòng)成本增大而減少。以上結(jié)論為電力體制改制背景下的電力企業(yè)最優(yōu)決策提供了理論參考。

1.3.5 低場(chǎng)核磁共振（low-field nuclear magnetic resonance，LF-NMR）技術(shù)檢測(cè)水分分布

在NMI20-030H-1核磁共振成像分析儀上，采用Carr-Purcell-Meiboom-Gill（CPMG）脈沖序列[2-3]，磁場(chǎng)強(qiáng)度（0.50±0.08） T，測(cè)量溫度為25 ℃。首先沿肌纖維方向取3.5 g魚(yú)肉，修整為20 mm×10 mm×10 mm的樣品3 份，分別放入直徑40 mm的檢測(cè)管中。選用Q-CPMG序列測(cè)定橫向弛豫時(shí)間T2，其參數(shù)值為：采樣頻率200 MHz，累加次數(shù)4，射頻頻率21 MHz，采樣等待時(shí)間5 500 ms，回波數(shù)1 500，射頻延時(shí)0.080 ms，回波時(shí)間0.500 ms；脈沖寬度（pulse width，PW）在90°為26.00 μs（PW1），在180°為54.00 μs（PW2）。每次測(cè)試重復(fù)3 次。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

所有結(jié)果使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和方差分析（P＜0.05），確定數(shù)據(jù)的差異顯著性。結(jié)果表示為±s。作圖使用Origin 2018軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 α多樣性指數(shù)分析

對(duì)傳統(tǒng)酸酢魚(yú)不同發(fā)酵時(shí)間的樣本提取總細(xì)菌DNA，經(jīng)過(guò)處理后運(yùn)用Illumina HiSeq PE250平臺(tái)對(duì)操作分類(lèi)單元（operational taxonomic unit，OTU）進(jìn)行測(cè)序分析，采用Sobs指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、ACE指數(shù)、Chao指數(shù)、覆蓋率等多樣性指數(shù)對(duì)樣品微生物物種豐富度和多樣性進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果如表1所示。

表1 酸酢魚(yú)的微生物DNA序列信息和微生物多樣性指數(shù)Table 1Sequence abundance and microbial diversity indices in Suanzuo fish

在酸酢魚(yú)中有效序列有429 062 條，191 種OTU。有效序列越多，進(jìn)入分類(lèi)的序列也越多。各樣品的覆蓋率均大于0.999，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)的測(cè)序量已經(jīng)達(dá)到飽和，測(cè)序的結(jié)果能夠有效反映酸酢魚(yú)在發(fā)酵過(guò)程中微生物菌群多樣性組成。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，酸酢魚(yú)中樣品的細(xì)菌多樣性總體呈現(xiàn)迅速下降然后緩慢上升再下降的趨勢(shì)。在發(fā)酵初期到第4天，OTU數(shù)從122下降到50，Chao指數(shù)從133.000 00下降到62.363 64，表明樣品初始種類(lèi)豐富度開(kāi)始下降，原因是由于加入鹽腌制可殺死一些細(xì)菌，無(wú)氧的條件中，一些微生物的生長(zhǎng)也受到抑制。在發(fā)酵第4～24天，OTU數(shù)、Chao指數(shù)、Shannon指數(shù)等多樣性指數(shù)的浮動(dòng)趨勢(shì)不大，樣品中的微生物在逐漸適應(yīng)生長(zhǎng)環(huán)境，細(xì)菌數(shù)量趨于平穩(wěn)。

2.2 發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化

根據(jù)分類(lèi)學(xué)分析結(jié)果，傳統(tǒng)發(fā)酵酸酢魚(yú)中微生物群落結(jié)構(gòu)組成主要分布有4 個(gè)門(mén)類(lèi)群、5 個(gè)綱類(lèi)群、9 個(gè)目類(lèi)群、14 個(gè)科類(lèi)群、10 個(gè)屬類(lèi)群，各發(fā)酵階段的酸酢魚(yú)所含原核微生物門(mén)水平、目水平和屬水平的種類(lèi)基本相似，但是相對(duì)豐度隨著發(fā)酵進(jìn)程發(fā)生一定改變。

圖1 苗族酸酢魚(yú)發(fā)酵過(guò)程中微生物物種在門(mén)水平（A）、目水平（B）、屬水平（C）的相對(duì)豐度Fig.1 Relative abundance of bacterial community members at (A)phylum, (B) order and (C) genus levels in Suanzuo fish

由圖1B可知，在目水平上，酸酢魚(yú)的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分布中主要有厚壁菌門(mén)的芽孢桿菌目（Bacillales）、乳酸桿菌目（Lactobacillales）；放線菌門(mén)的放線菌目（Actinomycetales）、微球菌目（Micrococcales）；變形菌門(mén)的腸桿菌目（Enterobacteriales）、海洋螺菌目（Oceanospirillales）、根瘤菌目（Rhizobiales）、立克次體目（Rickettsiales）、假單胞菌目（Pseudomonadales）；以及擬桿菌門(mén)中的黃桿菌目（Flavobacteriales）。其中酸酢魚(yú)發(fā)酵過(guò)程中的芽孢桿菌目的相對(duì)豐度一直較高，其對(duì)應(yīng)值在發(fā)酵第4天達(dá)到最大。其次是乳酸桿菌目，發(fā)酵前期雖生長(zhǎng)不明顯，但是其相對(duì)豐度在發(fā)酵8～12 d顯著增加，此后略有波動(dòng)，但是整體呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，并在發(fā)酵第24天結(jié)束時(shí)達(dá)到豐度的最大值，這也與酸酢魚(yú)發(fā)酵時(shí)逐漸產(chǎn)酸的過(guò)程相一致。放線菌門(mén)的微球菌目在發(fā)酵初期存在，但是很快消失，發(fā)酵后期，即發(fā)酵的第12、18天，放線菌門(mén)相對(duì)豐度的增加主要是由放線菌目的相對(duì)豐度增長(zhǎng)引起的。

如圖1C所示，發(fā)酵初始階段的酸酢魚(yú)發(fā)酵體系中優(yōu)勢(shì)菌屬為葡萄球菌屬（Staphylococcus），其隸屬于厚壁菌門(mén)、芽孢桿菌目，該菌屬大部分為非致病菌，其能夠利用糖類(lèi)產(chǎn)酸，可將蛋白質(zhì)降解為微分子肽和游離氨基酸[4-5]，為發(fā)酵后期的乳酸桿菌屬（Lactobacillus）和魏斯氏菌屬（Weissella）等典型乳酸菌的生長(zhǎng)和繁殖提供營(yíng)養(yǎng)，在發(fā)酵第24天葡萄球菌屬的相對(duì)豐度為64.65%，其相對(duì)豐度始終維持在60%以上，是貫穿酸酢魚(yú)整個(gè)發(fā)酵周期的優(yōu)勢(shì)菌屬。此外芽孢桿菌目的巨球菌屬（Macrococcus）、乳酸桿菌目的乳桿菌屬（Lactobacillus）、魏斯氏菌屬和四聯(lián)球菌屬（Tetragenococcus）也在酸酢魚(yú)的發(fā)酵過(guò)程中起到了關(guān)鍵作用。根據(jù)相關(guān)報(bào)道，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，巨球菌屬具有水解蛋白質(zhì)和脂類(lèi)的能力，不僅為發(fā)酵后期乳酸菌的生長(zhǎng)發(fā)育及產(chǎn)酸提供豐富營(yíng)養(yǎng)，同時(shí)脂類(lèi)的降解也釋放出豐富的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，形成發(fā)酵魚(yú)制品獨(dú)特的產(chǎn)品風(fēng)味[6-7]。在中國(guó)傳統(tǒng)的發(fā)酵魚(yú)制品的臭鱖魚(yú)中也發(fā)現(xiàn)了巨球菌屬[8-10]。在酸酢魚(yú)發(fā)酵的中后期，以乳桿菌屬、魏斯氏菌屬和四聯(lián)球菌屬為代表的乳桿菌目微生物的相對(duì)豐度開(kāi)始顯著增加，上述3 個(gè)種屬的微生物均屬于乳酸菌，其廣泛存在于發(fā)酵食品微生物群落中，在其他發(fā)酵食品的微生物群落分析中被廣泛報(bào)道[11-12]。乳酸菌的生長(zhǎng)會(huì)加速乳酸積累，迅速降低發(fā)酵體系的pH值，進(jìn)而抑制放線菌目的羅斯氏菌屬（Rithia）、海洋螺菌目的食堿菌屬（Alcanivorax）和假單胞菌目的不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）等常見(jiàn)食源性污染微生物的生長(zhǎng)。

2.3 呈味氨基酸變化規(guī)律

酸酢魚(yú)中的游離氨基酸主要來(lái)源于魚(yú)肉自身的蛋白酶和微生物共同分解的蛋白質(zhì)[13-14]。游離氨基酸是酸酢魚(yú)發(fā)酵過(guò)程的主要代謝產(chǎn)物之一。由表2可知，在苗族酸酢魚(yú)樣品中含量豐富的有蘇氨酸（Thr）、谷氨酸（Glu）、丙氨酸（Ala）、纈氨酸（Val）、亮氨酸（Leu）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）和賴(lài)氨酸（Lys）。發(fā)酵到第24天，酸酢魚(yú)中總游離氨基酸含量為1 406.09 mg/100 g，與新鮮魚(yú)肉相比，總游離氨基酸含量增加了3.69 倍，必需氨基酸的含量增加了7.6 倍。此外，隨著發(fā)酵進(jìn)程的進(jìn)行，游離氨基酸含量在發(fā)酵第4天和發(fā)酵第8天出現(xiàn)了顯著增加的現(xiàn)象。同時(shí)，微生物群落結(jié)構(gòu)在第4天時(shí)，以葡萄球菌屬和巨球菌屬為代表的芽孢桿菌目微生物的相對(duì)豐度達(dá)到最大值。2 個(gè)菌屬微生物的快速增長(zhǎng)不但極大地壓縮了原生食品污染微生物的生長(zhǎng)空間，還通過(guò)產(chǎn)酶降解蛋白質(zhì)、脂類(lèi)產(chǎn)生的氨基酸等小分子有機(jī)物，為發(fā)酵中后期乳酸桿菌目微生物的生長(zhǎng)提供了豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)基礎(chǔ)。

表2 不同發(fā)酵時(shí)間的酸酢魚(yú)中游離氨基酸的含量Table 2 Changes in the contents of free amino acids in Suanzuo fish during fermentation mg/100 g

除了提供微生物生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)，氨基酸還是關(guān)鍵的呈味物質(zhì)，對(duì)產(chǎn)品風(fēng)味的形成有重要作用，魚(yú)肉中的氨基酸和酸酢魚(yú)獨(dú)特濃郁的風(fēng)味有著密切的關(guān)系[15-16]。采用味道強(qiáng)度值（taste activity value，TAV）對(duì)各種呈味氨基酸進(jìn)行分析。TAV通常以化合物的濃度和其閾值的比計(jì)算[17]，如果TAV大于1，則認(rèn)為該氨基酸對(duì)于食物的滋味具有顯著的貢獻(xiàn)；如果TAV小于1，則該氨基酸對(duì)滋味的呈味效果不顯著。天冬氨酸（Asp）和Glu為酸味氨基酸，Thr、絲氨酸（Ser）、甘氨酸（Gly）、Ala、脯氨酸（Pro）和Lys是甜味氨基酸，Val、甲硫氨酸（Met）、異亮氨酸（Ile）、Leu、Tyr、Phe、組氨酸（His）、半胱氨酸（Cys）、精氨酸（Arg）是苦味氨基酸。酸酢魚(yú)中游離氨基酸的TAV如表3所示，TAV越大，表示氨基酸的呈味作用越明顯，對(duì)產(chǎn)品滋味的貢獻(xiàn)也越大。發(fā)酵成熟的貴州酸酢魚(yú)中的呈味氨基酸有Asp、Glu、Ala、Val、Met、Phe、Lys和His。Glu的TAV為30.69，對(duì)貴州酸酢魚(yú)的整體滋味貢獻(xiàn)最為顯著，能夠顯著提高魚(yú)肉的鮮味。His是苦味氨基酸，具有增添食品呈味復(fù)雜度的功能，并且具有提高食品鮮味的能力。產(chǎn)品無(wú)明顯苦味的原因可能是各種呈味氨基酸呈現(xiàn)不同的口味，多重口味互相消減[18]，此外Glu還能夠與呈味5’-核苷酸發(fā)生協(xié)同作用，從而提升鮮味[19]。

表3 不同發(fā)酵時(shí)間酸酢魚(yú)中氨基酸TAV的變化Table 3Changes in TAV of free amino acids in Suanzuo fish during fermentation

2.4 水分變化規(guī)律分析

LF-NMR能夠顯示不同魚(yú)肉樣品中水分的分布，為分析魚(yú)肉中水分分布狀態(tài)和產(chǎn)品品質(zhì)特性之間的關(guān)系奠定理論基礎(chǔ)[20]。通過(guò)采用LF-NMR技術(shù)對(duì)酸酢魚(yú)進(jìn)行檢測(cè)，分析所得的弛豫時(shí)間T2的數(shù)據(jù)分布揭示了酸酢魚(yú)的不同水分狀態(tài)。橫向弛豫時(shí)間T2可以間接表示水的自由度，T2的橫向弛豫時(shí)間越長(zhǎng)，水就越自由；相對(duì)面積反映不同分布狀態(tài)水分含量的變化。

如圖2所示，3 個(gè)峰表示發(fā)酵過(guò)程中水分的3 種分布：T21（0.1～10 ms）、T22（10～100 ms）和T23（200～1 000 ms）。不同的水分分布弛豫時(shí)間T2和所占面積對(duì)應(yīng)著魚(yú)肉中不同狀態(tài)的水。T21（0.1～10 ms）代表與蛋白質(zhì)等大分子表面緊密結(jié)合的水分子層，水分單分子層與蛋白質(zhì)羰基、氨基結(jié)合，是不會(huì)受外界壓力影響的結(jié)合水組成的分子層。T22（10～100 ms）代表的水分子存在于高度組織化蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中，是位于肌原纖維和膜之間不易流動(dòng)的水分子，這部分水的峰面積約占總水量的80%以上。T23（100～1 000 ms）是指存在于肌細(xì)胞外空間、靠毛細(xì)管凝結(jié)作用聚集的，且具有流動(dòng)性的自由水[21-23]。近年來(lái)，根據(jù)肉與肉制品水分T2分布的理論研究，已有研究者分析肉中水分的分布和流動(dòng)性對(duì)其品質(zhì)特性的影響[24-25]。Xu Yanshun等[26]在不同階段發(fā)酵香腸模型的系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)了3 種水分分布狀態(tài)，并且肉制品發(fā)酵成熟的過(guò)程可看作是向更短的弛豫時(shí)間轉(zhuǎn)變的過(guò)程。

圖2 酸酢魚(yú)在發(fā)酵過(guò)程中弛豫時(shí)間T2分布圖Fig.2 Changes in distribution of T2 relaxation time in Suanzuo fish during fermentation

由圖2可知，貴州酸酢魚(yú)在發(fā)酵第4天后的結(jié)合水向更強(qiáng)結(jié)合方向遷移。此外，隨著酸酢魚(yú)的發(fā)酵，魚(yú)肉中自由水含量逐漸減少，可能是因?yàn)辂}腌形成魚(yú)肉與環(huán)境中的滲透壓差異，導(dǎo)致部分自由水滲出魚(yú)肉外造成魚(yú)肉內(nèi)部自由水含量降低[27]。另外，發(fā)酵時(shí)微生物的生長(zhǎng)繁殖消耗了部分自由水，也能夠形成相似的結(jié)果。而不易流動(dòng)的水分在發(fā)酵第8天之后的自由度顯著下降說(shuō)明魚(yú)肉肌原纖維中束縛的水分更加牢固。

在酸酢魚(yú)發(fā)酵階段中，不同水分（結(jié)合水與不易流動(dòng)水）對(duì)應(yīng)的弛豫時(shí)間和相對(duì)面積（T21和T22）的變化如表4所示，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，T21和T22的相對(duì)面積隨著發(fā)酵進(jìn)程逐漸變小，弛豫時(shí)間也大體呈現(xiàn)逐漸降低的規(guī)律，水分自由度也隨發(fā)酵進(jìn)程逐漸下降。

表4 貴州酸酢魚(yú)中弛豫時(shí)間（T21和T22）和相對(duì)面積的變化Table 4Changes in relaxation time (T21 and T22) and relaxation area ratio in Suanzuo fish during fermentation

值得注意的是，不易流動(dòng)水的相對(duì)含量以及弛豫時(shí)間在酸酢魚(yú)發(fā)酵第4天和第8天明顯降低，這與微生物菌群結(jié)構(gòu)的變化也具有相關(guān)性。在第4天和第8天時(shí)，芽孢桿菌目微生物快速生長(zhǎng)，達(dá)到了其相對(duì)豐度的最大值，而以葡萄球菌屬和巨球菌屬為代表的芽孢桿菌目微生物快速生長(zhǎng)，能夠快速降解蛋白質(zhì)積累的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，此時(shí)魚(yú)肉中肌原纖維蛋白發(fā)生一定程度的崩解，魚(yú)肉組織的保水能力下降，使得被束縛的不易流動(dòng)水含量發(fā)生顯著性降低，因此自由水流失；同時(shí)由于發(fā)酵后期，以乳酸桿菌屬和魏斯氏菌屬為代表的乳酸桿菌目微生物開(kāi)始大量生長(zhǎng)，發(fā)酵體系中開(kāi)始逐漸積累乳酸，較低的pH值可能會(huì)促進(jìn)蛋白質(zhì)凝膠化，并產(chǎn)生聚集物，由于發(fā)酵體系從黏性蛋白系統(tǒng)轉(zhuǎn)變?yōu)槟z體黏性蛋白系統(tǒng)，且蛋白質(zhì)鏈間相互作用，因此形成了緊密結(jié)合的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)，極大地增加了水分子流動(dòng)的難度，導(dǎo)致了水分子不易流動(dòng)，因此水的自由度降低[28-29]。本實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象與Yang Zhaoxia等[10]的研究結(jié)論類(lèi)似，發(fā)酵過(guò)程中臭鱖魚(yú)樣品結(jié)構(gòu)特性和水分狀態(tài)的變化高度相關(guān)，肌原纖維束間的作用逐漸減弱，不易流動(dòng)水的含量降低，水的自由度隨發(fā)酵時(shí)間增加而逐漸降低[30]。不同于自由水的流失和不易流動(dòng)水的減少，結(jié)合水始終緊密結(jié)合在蛋白質(zhì)大分子的表面，絕對(duì)含量并未發(fā)生顯著變化，最終造成了相對(duì)含量逐漸升高的現(xiàn)象。

本實(shí)驗(yàn)與已經(jīng)報(bào)道的酸酢魚(yú)發(fā)酵過(guò)程中質(zhì)構(gòu)變化相比較發(fā)現(xiàn)，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，自由水和不易流動(dòng)水的含量均顯著降低，此時(shí)魚(yú)肉的保水能力顯著下降，肉質(zhì)硬度逐漸升高、彈性顯著下降[1]。

3 結(jié) 論

苗族傳統(tǒng)酸酢魚(yú)的發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵前期的優(yōu)勢(shì)菌主要是葡萄球菌屬和巨球菌屬，二者能夠有效降解蛋白質(zhì)和脂類(lèi)，發(fā)酵過(guò)程中游離氨基酸的含量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，積累營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的同時(shí)，釋放發(fā)酵酸酢魚(yú)的特征揮發(fā)風(fēng)味物質(zhì)。隨著發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌的繁殖，一些腐敗菌如腸桿菌屬等食品污染微生物的相對(duì)豐度逐漸降低；乳酸桿菌屬和魏斯氏菌屬利用前期積累的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在發(fā)酵中后期快速生長(zhǎng)，并積累乳酸，有效地抑制了原生食品污染微生物的生長(zhǎng)。酸酢魚(yú)發(fā)酵過(guò)程中的氨基酸是其關(guān)鍵呈味物質(zhì)，Glu對(duì)貴州酸酢魚(yú)的整體滋味貢獻(xiàn)最為顯著，能夠顯著提高魚(yú)肉的鮮味。魚(yú)肉中水分分布的整體趨勢(shì)向更低自由度的方向遷移，水分的流動(dòng)性變差，自由水和不易流動(dòng)水的相對(duì)含量逐漸降低，結(jié)合水的相對(duì)含量顯著升高，進(jìn)而可能影響到酸酢魚(yú)的質(zhì)構(gòu)。