崔曉穎，彭新顏,,*，賀紅軍，張 敏，張曉彤

（1.煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264005；2.魯東大學(xué)生物納米技術(shù)研究院，山東 煙臺(tái) 264025）

芋頭（Colocasia esculenta(L.) S.chott）屬于塊莖植物[1-2]，富含淀粉、酚類化合物、蛋白質(zhì)、多糖、維生素和多種礦物質(zhì)[3-5]，具有健脾消食、預(yù)防齲齒、降低膽固醇水平、提高機(jī)體免疫力、改善便秘等諸多生理功能[6-7]。近年來(lái)，鮮切是食品工業(yè)重要加工方式之一[8]。然而，鮮切果蔬在貯藏和加工過(guò)程中很容易發(fā)生褐變，致使產(chǎn)品的質(zhì)地、風(fēng)味和適銷性變差，甚至失去產(chǎn)品原有的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[9-10]。酶促褐變是果蔬加工和貯藏過(guò)程中的常見(jiàn)現(xiàn)象，其褐變程度與果蔬中多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活性及含量密切相關(guān)。PPO是一種含銅的酶類，可以在分子氧存在下催化酚類物質(zhì)，并氧化成鄰醌，這些醌類與內(nèi)源性氨基酸或蛋白質(zhì)自發(fā)聚合成復(fù)雜的棕色色素[11-12]。目前有許多防止PPO褐變的方法，包括調(diào)節(jié)pH值、加熱、冷凍、除氧和干燥等方法[13-15]。此外，越來(lái)越多的研究表明[16-18]，添加抗壞血酸、檸檬酸、亞硫酸鈉、植酸、氯化鈉和L-半胱氨酸等抑制劑能有效控制食品加工過(guò)程中的褐變現(xiàn)象。國(guó)內(nèi)外對(duì)果蔬中PPO的分離純化及其特性的研究深入而廣泛，包括香蕉[19]、硬粒小麥[20]、芒果[21]、山藥[9]和茶葉等[22]。然而，對(duì)芋頭PPO分離、純化和特性表征方面的研究較少。因此，本實(shí)驗(yàn)以鮮芋頭為原料，通過(guò)緩沖液粗提、硫酸銨分級(jí)沉淀、透析、超濾和柱層析等步驟對(duì)芋頭PPO進(jìn)行分離純化，探究其酶學(xué)特性和抑制劑對(duì)PPO的影響規(guī)律。以期為芋頭PPO作用機(jī)制和加工貯藏過(guò)程中褐變的控制提供理論依據(jù)，提高芋頭的商品價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山東煙臺(tái)產(chǎn)“魯芋1號(hào)”芋頭的子芋，采收于2019年10月，選購(gòu)自山東煙臺(tái)惠安小區(qū)市場(chǎng)，挑選新鮮、無(wú)腐爛變質(zhì)、無(wú)機(jī)械傷、色澤正常的為實(shí)驗(yàn)材料。

磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、硫酸銨、聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100）、聚乙二醇6000（polyethylene glycol 6000，PEG 6000）、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮（crosslinked polyvinylpyrrolidone，PVPP）、鄰苯二酚、間苯二酚、間苯三酚、焦沒(méi)食子酸、L-酪氨酸（電泳純）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）（色譜純）、抗壞血酸、L-半胱氨酸（電泳純）、檸檬酸、偏亞硫酸氫鈉、三羥甲基氨基甲烷（tris(hydroxymethyl)methyl aminomethane，Tris）、考馬斯亮藍(lán)G-250、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、過(guò)硫酸銨（ammonium persulphate，AP）、四甲基乙二胺（N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine，TEMED）煙臺(tái)魯杰試劑公司。其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

超濾離心管（10 kDa） 德國(guó)Millipore公司；AKTA蛋白質(zhì)層析純化系統(tǒng) 美國(guó)General Elecric公司；DEAE-Sepharose Fast Flow（DEAE-SFF）層析柱 英國(guó)Waterman公司；Superdex G-75凝膠柱 瑞典Amersham Pharmacia Biotech公司；CR22N/21N冷凍離心機(jī) 日本日立公司；UV-5500紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司；GJ-18S冷凍干燥機(jī) 北京松源華興科技發(fā)展公司；低溫冰箱（－80 ℃） 日本Sanyo公司；WH-600-LCD型電泳儀 北京市六一儀器廠；HHS型數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；Biodoc-IT 220普通凝膠成像系統(tǒng) Analytik Jena美國(guó)有限責(zé)任合伙公司；iMark全自動(dòng)酶標(biāo)儀 美國(guó)Bio-Rad公司；BL35A11多功能料理機(jī) 中國(guó)美的集團(tuán)股份有限公司；XHF-D勻漿機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；101FA-2電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Delta 320 pH計(jì) 瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 PPO粗酶液的提取與純化

參考Zhou Xiran等[23]的方法進(jìn)行修改。4 ℃預(yù)冷24 h的500 g新鮮芋頭去皮切小塊，加入到所配制的500 mL的預(yù)冷磷酸鹽緩沖液中，冰水浴勻漿3 min，勻漿液4 ℃提取2 h，過(guò)濾后離心（4 ℃、10 000 r/min、20 min），棄渣取上清液得粗酶液，30%～80%飽和度的硫酸銨分級(jí)沉淀，pH 6.8的磷酸鹽溶液再溶解沉淀，透析，采用10 kDa膜超濾（8 000 r/min、20 min）濃縮2 次，DEAE-SFF離子交換柱層析，Superdex G-75凝膠柱層析，得到電泳純芋頭PPO。

1.3.1.1 提取緩沖液的配制

稱取10 mg PVPP、體積分?jǐn)?shù)0.50%的TritonX-100、體積分?jǐn)?shù)0.34%的PEG6000，充分溶解在500 mL的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液中冷藏備用。

1.3.1.2 30%～80%硫酸銨分級(jí)沉淀

將硫酸銨用研缽磨細(xì)后烘干備用，根據(jù)提取所得粗酶液的量，查表計(jì)算4 ℃達(dá)到30%飽和度所需要硫酸銨的量，然后在0 ℃的冰水浴，向粗酶液中慢速加入所稱量的硫酸銨，沉淀24 h后離心（4 ℃、10 000 r/min、20 min）取上清液，用同樣的方式繼續(xù)用30%～80%的硫酸銨沉淀，棄上清液后取沉淀用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.1.3 透析與超濾

用0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH 6.8）將硫酸銨沉淀的粗酶液復(fù)溶，然后裝入透析袋中，用超純水透析4 次（3～4 h更換1 次去離子水）后，再用0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH 6.8）脫鹽透析24～48 h。透析結(jié)束后用10 kDa超濾離心管離心（4 ℃、8 000 r/min、20 min）2 次，得超濾濃縮粗酶。

1.3.1.4 DEAE-SFF陰離子交換層析

利用DEAE-SFF柱將超濾處理后的粗酶液進(jìn)行分離純化。將超純水、1 mol/L NaCl溶液、0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH 6.8）、體積分?jǐn)?shù)20%的乙醇溶液過(guò)0.22 μm膜備用。先利用過(guò)膜的超純水清洗系統(tǒng)和DEAE-SFF層析柱，再使用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH 6.8）清洗系統(tǒng)和平衡柱子。超濾后樣品經(jīng)過(guò)0.22 μm膜過(guò)濾后上樣，洗脫流速為1.0 mL/min，收集速度5 mL/管，并按收集順序從標(biāo)記管號(hào)，測(cè)定所收集各峰組分的PPO活性和蛋白質(zhì)濃度。

1.3.1.5 Superdex G-75凝膠柱層析

為了進(jìn)一步純化，收集DEAE-SFF色譜柱層析后酶活性高的部分，繼續(xù)用Superdex G-75色譜柱純化。利用0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH 6.8）進(jìn)行平衡，通過(guò)進(jìn)樣環(huán)上樣2 mL，用含有0.2 mol/L NaCl的磷酸緩沖液以1 mL/min的速度洗脫，收集速度5 mL/管，并按收集順序從1開(kāi)始標(biāo)記管號(hào)；繪制洗脫曲線，測(cè)定所收集各組分的PPO活性和蛋白含量。

1.3.2 聚丙烯酰胺凝膠電泳

實(shí)驗(yàn)采用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（native polyacrylamide gel electrophoresis，Native-PAGE）檢測(cè)以上步驟分離的樣品；利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）變性凝膠電泳法檢測(cè)經(jīng)DEAE-SFF層析柱、Superdex G-75凝膠色譜柱純化后PPO的純度及其分子質(zhì)量。配制體積分?jǐn)?shù)為5%的濃縮膠和體積分?jǐn)?shù)為12%的分離膠，設(shè)定起始電壓為80 V，電泳一段時(shí)間至指示劑進(jìn)入分離膠時(shí)，改變電壓至100 V繼續(xù)電泳，結(jié)束電泳后用考馬斯亮藍(lán)G-250染色。最后凝膠在10%乙酸-20%甲醇-70%去離子水中脫色。脫色開(kāi)始1 h換1 次脫色液，連續(xù)換3 次后，再脫色過(guò)夜。

1.3.3 PPO活性和蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

將0.3 mL PPO液和2.7 mL 14 mmol/L鄰苯二酚溶液混勻，30 ℃測(cè)定混合溶液在420 nm處的吸光度，空白對(duì)照為3 mL的底物溶液。以每分鐘反應(yīng)混合液在420 nm波長(zhǎng)處吸光度變化0.001為1 個(gè)酶活力單位，即1 U/mL。以BSA為標(biāo)準(zhǔn)試劑，按Bradford法測(cè)定PPO蛋白濃度。

1.3.4 芋頭PPO特性分析

1.3.4.1 底物特異性和特征吸收波長(zhǎng)的確定

通過(guò)全波長(zhǎng)掃描確定PPO的特征吸收波長(zhǎng)。以鄰苯二酚、間苯二酚、間苯三酚、焦沒(méi)食子酸和L-酪氨酸共5 種溶液為反應(yīng)底物，待酶液和底物反應(yīng)完全后，用分光光度法測(cè)定混合液在300～900 nm之間的吸光度變化，將得到的最佳吸收波長(zhǎng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

分別以不同濃度（2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22 mmol/L）的鄰苯二酚、間苯二酚、間苯三酚、焦沒(méi)食子酸和L-酪氨酸為底物與粗酶反應(yīng)，通過(guò)檢測(cè)PPO活性確定芋頭PPO的底物特異性。測(cè)定不同底物濃度[S]對(duì)應(yīng)PPO的反應(yīng)速率V，求出二者對(duì)應(yīng)的倒數(shù)，參照Lineweaver-Burk作圖法，將數(shù)據(jù)按照1/V和1/[S]繪制作圖，擬合線性方程為y=ax+b，按式（1）、（2）、（3）分別計(jì)算最大反應(yīng)速率（Vmax）、米氏常數(shù)（Km）、底物親和力（substrate affinity，SA）[24]。

1.3.4.2 最適pH值的確定

用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液將PPO活性測(cè)定體系的pH值范圍調(diào)整到4.0～8.0之間，并按照0.4的pH值衡量單位以確定PPO的最適反應(yīng)pH值。以鄰苯二酚溶液為底物，待鄰苯二酚溶液在指定pH值（pH 4～8）平衡后，迅速加入PPO，測(cè)定其420 nm的吸光度，后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用最佳pH值。

1.3.4.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)PPO活性的影響

為確定PPO的最適反應(yīng)時(shí)間，以鄰苯二酚為底物，加入0.3 mL含0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.8）的粗酶液，在10～210 s的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行反應(yīng)，在設(shè)定的反應(yīng)時(shí)間每間隔10 s取樣測(cè)定PPO活性。

1.3.4.4 最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性的確定

將含有2.7 mL 14 mmol/L鄰苯二酚作為底物的0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH 6.8）在指定溫度（20、30、40、50 ℃）分別保溫3 min后，加入相同溫度中保溫3 min的粗酶液0.3 mL，每隔10 s檢測(cè)420 nm波長(zhǎng)處吸光度的變化以確定溫度對(duì)酶活性的影響。為了確定PPO的熱穩(wěn)定性，按照上述方法將底物溶液分別在60、70、80、90 ℃的條件中保溫1 min后加入0.3 mL粗酶液，每隔10 s取樣，并置于0 ℃冰水浴以冷卻樣品，然后用吸光度表征PPO活性的變化。

1.3.4.5 抑制劑對(duì)PPO活性的影響

為了測(cè)定PPO在不同濃度抑制劑存在時(shí)的活性，以14 mmol/L鄰苯二酚溶液為底物，探究不同濃度（0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L）的抗壞血酸、L-半胱氨酸、檸檬酸和焦亞硫酸鈉對(duì)PPO活性的抑制作用。同樣參照Lineweaver-Burk作圖法，根據(jù)Zhou Xiran等[23]的方法可求得最大反應(yīng)速率Vmax、米氏常數(shù)Km。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 PPO分離純化結(jié)果

實(shí)驗(yàn)的分離純化步驟主要包括：利用提取緩沖液進(jìn)行簡(jiǎn)單的提取得到粗酶液770 mL，進(jìn)而測(cè)定了PPO的總活力、蛋白含量、比活力等指標(biāo)；30%～80%的硫酸銨對(duì)粗酶液進(jìn)行分級(jí)沉淀后，得到117 mL酶液；磷酸鹽溶液透析后，得到302 mL酶液；將粗酶液進(jìn)行超濾處理得到的蛋白液為45 mL；將超濾之后的粗酶液通過(guò)DEAE-SFF純化，得到27 mL酶液；再通過(guò)Superdex G-75處理后得到5 mL目的蛋白酶。由表1可知，大部分雜蛋白在DEAE-SFF、Superdex G-75色譜柱的純化過(guò)程中被去除，PPO比活力從初始值4 312.60 U/mg增加到27 471.26 U/mg，純化倍數(shù)達(dá)到粗酶的6.37 倍，回收率為5.29%。說(shuō)明整個(gè)純化步驟，特別是運(yùn)用DEAESFF、Superdex G-75色譜柱的方法是純化PPO的有效方法。與其他果蔬比，芋頭PPO比活力（27 471.26 U/mg）明顯低于黃金梨（519 895.73 U/mg）[23]、富士蘋果（370 004.30 U/mg）[24]以及琉璃苣（410 090 U/mg）[25]，而高于金銀花（4 458.24 U/mg）[26]和茄果（5.95 U/mg）[27]，可見(jiàn)果蔬的PPO活性存在品種依賴性。

表1 芋頭中PPO的分離純化結(jié)果Table 1Summary of the isolation and purification of PPO from taro

由圖1a可以看出，利用NaCl梯度洗脫后從DEAESFF色譜柱得到5 個(gè)蛋白峰，洗脫曲線在第3、4個(gè)峰具有較高的酶活性。其中第3個(gè)峰時(shí)活性最高，達(dá)到761.752 U/mL，因此將活性峰組分（9～42管）合并，并利用Superdex G-75色譜柱進(jìn)一步純化。如圖1b所示，通過(guò)對(duì)洗脫液的收集以及對(duì)每管洗脫液的酶活力檢測(cè)可以發(fā)現(xiàn)，第2峰收集的洗脫液檢測(cè)到的酶活性最高，達(dá)到674.285 U/mL，證明第30～65管收集的是目的蛋白。第1個(gè)蛋白峰（1～29管）和最后一個(gè)蛋白峰（66～100管）的活性很低，說(shuō)明這2 部分的主要成分不是純蛋白，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Zaini等[13]的洗脫結(jié)果相似。

圖1 芋頭PPO粗酶經(jīng)DEAE-SFF色譜柱處理的離子交換層析圖（a）和Superdex G-75凝膠色譜柱（b）洗脫曲線Fig.1 Chromatographic elution profiles of crude PPO on DEAE-SFF column (a) and Superdex G-75 column (b)

2.2 PPO純度及分子質(zhì)量的確定

實(shí)驗(yàn)通過(guò)Native-PAGE和SDS-PAGE對(duì)6 步分離純化得到的PPO樣品進(jìn)行分析，結(jié)果如圖2所示。利用Native-PAGE檢測(cè)到泳道2、3、4、5均有3 個(gè)蛋白條帶，其分子質(zhì)量分別約為12、24、66 kDa。SDS-PAGE分析了經(jīng)DEAE-SFF柱和Superdex G-75柱洗脫后的PPO樣品。泳道6有2 個(gè)蛋白條帶，這表明PPO樣品尚未完全純化。因此，通過(guò)Superdex G-75柱進(jìn)一步純化PPO，結(jié)果泳道7出現(xiàn)單一條帶，此現(xiàn)象說(shuō)明Superdex G-75柱洗脫后得到了電泳純PPO。說(shuō)明Superdex G-75柱對(duì)芋頭PPO純化十分有效，達(dá)到了去除雜蛋白、純化目的酶的作用。由SDS-PAGE變性電泳可以判定芋頭PPO的分子質(zhì)量約為24 kDa。目前，關(guān)于果蔬中PPO分子質(zhì)量的研究比較廣泛，如Waliszewski等[28]發(fā)現(xiàn)香草豆PPO分子質(zhì)量為34 kDa，Navarro等[29]發(fā)現(xiàn)柿子PPO分子質(zhì)量為60 kDa，Mishra等[30]發(fā)現(xiàn)茄子PPO分子質(zhì)量為56 kDa。

圖2 芋頭不同分離提取和純化階段PPO的Native-PAGE和SDS-PAGE圖譜Fig.2 Native-PAGE and SDS-PAGE patterns of crude and purified PPO

2.3 芋頭PPO主要參數(shù)的確定

本實(shí)驗(yàn)以鄰苯二酚、間苯二酚、間苯三酚、焦性沒(méi)食子酸和L-酪氨酸為底物，探究了芋頭PPO粗酶的底物特異性。實(shí)驗(yàn)以鄰苯二酚共5 種底物與芋頭PPO粗酶反應(yīng)，將產(chǎn)物在300～900 nm范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，如圖3a所示，得到產(chǎn)物的最大吸收波長(zhǎng)為420 nm。藍(lán)莓[18]和西蘭花[31]中PPO的最大吸收波長(zhǎng)也為420 nm。然而，栗子仁PPO的最大吸收波長(zhǎng)為470 nm[32]，而黃金梨PPO的最大吸收波長(zhǎng)為412 nm[23]，酚類化合物是PPO的重要底物，PPO的底物特異性因植物來(lái)源而異。因此，果蔬PPO的最大吸收波長(zhǎng)隨其來(lái)源而變化。底物種類以及濃度對(duì)芋頭PPO活性的影響關(guān)系，側(cè)面反映了不同底物與芋頭PPO的親和力。

圖3 PPO參數(shù)的確定（a）及底物特異性分析（b）Fig.3 Confirmation of PPO parameters (a) and substrate specificity of PPO (b)

如圖3b所示，以鄰苯二酚為底物時(shí)，芋頭PPO活性遠(yuǎn)高于以其他酚類物質(zhì)為底物時(shí)的活性。當(dāng)鄰苯二酚濃度在2～8 mmol/L時(shí)，PPO活性隨著底物濃度的增大而呈現(xiàn)明顯的上升趨勢(shì)，在8～14 mmol/L時(shí)PPO活性上升緩慢，當(dāng)?shù)孜餄舛却笥?4 mmol/L時(shí)，PPO活性不再上升，因此鄰苯二酚的最佳濃度為14 mmol/L；當(dāng)間苯二酚和間苯三酚為底物時(shí)，變化趨勢(shì)與鄰苯二酚相似，但PPO活性較鄰苯二酚低。以焦沒(méi)食子酸和L-酪氨酸為底物時(shí)的芋頭PPO活性很低，且其活性隨底物濃度增大而幾乎沒(méi)有顯著變化。此結(jié)果與洋薊頭[33]、歐芹[34]PPO的結(jié)果一致。然而，茄果PPO對(duì)4-甲基鄰苯二酚的親和力比鄰苯二酚高[27]。因此，可以通過(guò)減少相應(yīng)的酚類底物控制食品加工過(guò)程中的酶促褐變。

一般而言，Vmax/Km比值可以表征PPO SA的大小，比值越大表明親和力越大[34]。由表2可知，本實(shí)驗(yàn)的5 種底物對(duì)芋頭PPO的親和能力差異明顯，該酶與底物的結(jié)合能力順序?yàn)椋亨彵蕉樱鹃g苯二酚＞間苯三酚＞焦性沒(méi)食子酸＞L-酪氨酸，說(shuō)明芋頭PPO對(duì)鄰苯二酚的親和力最大。

表2 芋頭PPO與不同底物反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 2 Kinetic parameters for the reaction between taro PPO and different substrates

2.4 pH值、溫度和反應(yīng)時(shí)間對(duì)PPO粗酶活性的影響

圖4a表明，PPO活力在pH 4.0～6.0之間幾乎保持不變，從pH值大于6.0才開(kāi)始急劇增加，在pH 6.8時(shí)，活性最高，因此芋頭PPO的最佳反應(yīng)pH 6.8。此發(fā)現(xiàn)與其他學(xué)者的研究結(jié)論一致，每種果蔬的PPO都有最佳的pH值，如栗仁[32]和巴巴多斯櫻桃[35]的最佳pH值均為7.0，板栗[36]、枇杷果[37]和馬拉蒂亞杏[38]PPO的最佳pH值分別為5.0、4.5和8.5。

由圖4b可以看出，PPO活力隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著增加。在反應(yīng)初期，PPO活力呈線性趨勢(shì)上升，表明反應(yīng)速率在此階段達(dá)到最大值。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間超過(guò)60 s時(shí)，增加速率變得緩慢，并且斜率在120 s后顯著變小且?guī)缀醪辉僮兓?，說(shuō)明此時(shí)PPO酶促反應(yīng)已經(jīng)結(jié)束。因此，芋頭PPO最佳反應(yīng)時(shí)間為60 s。此外，反應(yīng)溫度對(duì)PPO的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)和酶液中氧溶解度有一定影響，因此研究溫度對(duì)PPO活性的影響也是至關(guān)重要的。如圖4c所示，芋頭PPO活力在30 ℃達(dá)到最大值，再升高或降低溫度，酶活性均逐漸降低，說(shuō)明芋頭PPO的最佳反應(yīng)溫度為30 ℃。溫度低于30 ℃時(shí)，底物分子的動(dòng)能隨溫度的升高而增大，PPO活性保持穩(wěn)定增加的趨勢(shì)；當(dāng)溫度超過(guò)30 ℃，特別是高于40 ℃時(shí)，過(guò)高的溫度破壞了PPO活性中心的穩(wěn)定性，導(dǎo)致蛋白分子本身結(jié)構(gòu)或結(jié)合底物的構(gòu)象被破壞，使得芋頭PPO變性。在80 ℃加熱80 s或90 ℃加熱70 s后，PPO完全變性失活。因此，在加工過(guò)程中可以通過(guò)冷藏或熱燙的方法抑制褐變的產(chǎn)生。綜合已有報(bào)道可知，PPO的最佳溫度一般在10～60 ℃范圍內(nèi)，如Unal[19]和Do?an等[39]報(bào)道了香蕉和迷迭香的最佳反應(yīng)溫度均為30 ℃。然而Lin Haibin等[40]發(fā)現(xiàn)，香菜PPO在90 ℃加熱40 min后，其活性僅降低到15%，說(shuō)明其耐熱性較強(qiáng)，此現(xiàn)象與芋頭PPO的實(shí)驗(yàn)結(jié)果差距較大。

圖4 不同實(shí)驗(yàn)條件對(duì)PPO特性的影響Fig.4 Influence of different conditions on enzymatic characteristics of PPO

綜上，PPO活性的最佳pH值和溫度取決于果蔬種類、底物以及提取方法。在芋頭加工和保鮮時(shí)，可以通過(guò)嚴(yán)格地控制反應(yīng)溫度、時(shí)間和pH值，抑制芋頭加工過(guò)程中褐變的發(fā)生。

2.5 抑制劑對(duì)芋頭粗酶PPO活性的影響

加工過(guò)程中添加適量抑制劑是防止果蔬酶促褐變的有效方法，抑制劑的作用方式取決于抑制劑種類和底物類型，抑制劑主要通過(guò)形成無(wú)色產(chǎn)物或防止鄰苯醌的積累以阻礙黑色素的產(chǎn)生[41]。目前已發(fā)現(xiàn)許多化合物具有抑制PPO活性的功能，本實(shí)驗(yàn)研究了不同濃度的抗壞血酸、L-半胱氨酸、檸檬酸和焦亞硫酸鈉對(duì)芋頭PPO活性的抑制作用。

從圖5可以看出，反應(yīng)混合物的吸光度均隨著抑制劑濃度的增加而降低。以酶的反應(yīng)初速度對(duì)底物濃度作Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖，用于判定不同抑制劑對(duì)芋頭PPO的抑制機(jī)理。由圖5a可知，抗壞血酸濃度（0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L）增加時(shí)，得1 組斜率不變的平行直線，Km值減小，Vmax也減小，說(shuō)明抗壞血酸是反競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。反競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑不能與游離的酶分子結(jié)合，而只能通過(guò)與酶底物絡(luò)合物結(jié)合，阻斷酶促反應(yīng)，抑制褐變的發(fā)生，而且隨著濃度增大，結(jié)合力也增強(qiáng)。由圖5d、f可知，L-半胱氨酸和檸檬酸所得雙倒數(shù)曲線在縱軸分別交于相同點(diǎn)，即2 種抑制劑不改變最大反應(yīng)速度Vmax，而直線的斜率隨抑制劑濃度的增大而增加，Km隨抑制劑濃度的增大而增加，所以二者的抑制機(jī)理屬于競(jìng)爭(zhēng)性抑制。與反競(jìng)爭(zhēng)性抑制不同，L-半胱氨酸和檸檬酸只能與游離酶結(jié)合，從而阻止底物與酶的反應(yīng)，而不能與酶底物絡(luò)合物結(jié)合。圖5d得到1 組相交于橫軸上1 點(diǎn)的直線，說(shuō)明酶促反應(yīng)的Km不變，但Vmax隨著抑制劑濃度增大而下降，其抑制機(jī)理表現(xiàn)為非競(jìng)爭(zhēng)性類型，即焦亞硫酸鈉和底物都能與游離酶結(jié)合，而且2 個(gè)結(jié)合過(guò)程相互不影響。

圖5 不同抑制劑對(duì)芋頭PPO活性的影響Fig.5 Effect of different inhibitors on PPO activity from taro

Km的能夠反映抑制劑對(duì)PPO的作用效果，Km越小，抑制劑越有效。本實(shí)驗(yàn)中，抗壞血酸Km值最低（2.458 5 mmol/L），其次為L(zhǎng)-半胱氨酸（4.754 6 mmol/L）、檸檬酸（5.997 4 mmol/L）和焦亞硫酸氫鈉（11.203 9 mmol/L）。因此，對(duì)于芋頭PPO，抗壞血酸比其他抑制劑更有效，L-半胱氨酸抑制效果僅次于抗壞血酸，而焦亞硫酸鈉最弱。如圖5a所示，即使在0.5～2.0 mmol/L的低濃度條件，抗壞血酸也會(huì)明顯抑制芋頭PPO活性。這可能是因?yàn)榭箟难岬膹?qiáng)還原作用，將PPO生成的鄰醌還原為酚類化合物，阻止醌類物質(zhì)的進(jìn)一步氧化聚合，并作為抗壞血酸酶的底物把溶解的氧分子消耗掉，從而起到良好的抑制褐變效果。Derardja等[42]也發(fā)現(xiàn)，0.1 mmol/L和0.2 mmol/L的抗壞血酸對(duì)杏PPO有良好的抑制效果，PPO的相對(duì)活性分別降低至66%和55%，這說(shuō)明抗壞血酸是PPO較理想的抑制劑。因此，可以根據(jù)芋頭加工過(guò)程的實(shí)際條件選擇合適的抑制劑。

3 結(jié) 論

新鮮芋頭在加工和貯藏時(shí)，切片白度下降，表觀顏色褐變明顯。大量報(bào)道證實(shí)，果蔬褐變必須具備多酚物質(zhì)、氧氣及PPO共3 種物質(zhì)，其中控制PPO活性相對(duì)比較容易，所以通過(guò)研究芋頭PPO的酶學(xué)特性抑制褐變可行。本實(shí)驗(yàn)研究表明，采用提取液勻漿提取、硫酸銨沉淀、透析和超濾濃縮得到PPO粗酶液，再將粗酶液經(jīng)過(guò)DEAESFF色譜柱的離子交換層析和Superdex G-75凝膠柱的層析處理是提取和純化芋頭PPO的有效方法。純化后芋頭的PPO分子質(zhì)量約為24 kDa，能夠達(dá)到電泳純。PPO的比活力為27 471.26 U/mg，純化倍數(shù)達(dá)到6.37 倍。芋頭PPO對(duì)鄰苯二酚的親和力最高，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為60 s時(shí)，PPO活性最大。以鄰苯二酚為底物時(shí)，PPO的最適檢測(cè)波長(zhǎng)、最佳pH值和溫度分別為420 nm、pH 6.8和30 ℃。另外，在所檢測(cè)的抑制劑中，抗壞血酸對(duì)芋頭PPO的抑制效果最好，其抑制類型為反競(jìng)爭(zhēng)性抑制。綜上可知，為控制芋頭加工和貯藏過(guò)程中的褐變，應(yīng)從抑制其PPO活性的方面采取措施，如低溫貯藏、在低溫貯藏前進(jìn)行短時(shí)間高溫處理、調(diào)節(jié)pH值、利用效果較好的抑制劑對(duì)其切片進(jìn)行護(hù)色處理等。本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步提升芋頭加工和貯藏過(guò)程的品質(zhì)提供了理論參考。