趙思明，江連洲，王冬梅，隋曉楠，周麟依,*，范志軍,,*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.黑龍江省北大荒綠色健康食品有限責(zé)任公司，黑龍江 佳木斯 154000）

大豆分離蛋白（soy protein isolate，SPI）是一種常用的食品添加劑，其優(yōu)良的功能性可被應(yīng)用到食品中滿足人們的需求。在食品加工中大豆蛋白具有的天然功能性質(zhì)不足以滿足食品工業(yè)對(duì)其功能性的需求，因此，通過對(duì)大豆蛋白分子結(jié)構(gòu)的改良，從而使理化性能得到改變，進(jìn)而達(dá)到對(duì)蛋白質(zhì)功能性質(zhì)加強(qiáng)或改善的目的[1]。近些年，國內(nèi)外有很多學(xué)者對(duì)蛋白質(zhì)的熱聚集行為進(jìn)行研究，主要集中在中性條件下的熱處理，且處理溫度低于100 ℃。在中性條件下，蛋白質(zhì)受熱而改變結(jié)構(gòu)和功能會(huì)受到熱處理溫度、蛋白質(zhì)濃度及離子強(qiáng)度的影響[2]。王喜波等[3]研究加熱、超聲、高壓均質(zhì)、微波4 種改性方法對(duì)SPI乳化性的影響，結(jié)果表明：SPI在121 ℃下，熱處理10 min后的柔性和乳化活性最高，同時(shí)高壓均質(zhì)對(duì)SPI的乳化性影響大、柔性影響小。當(dāng)乳清蛋白溶液被加熱時(shí)，會(huì)發(fā)生幾種反應(yīng)，如聚合或共價(jià)和非共價(jià)（靜電和疏水）反應(yīng)，由于這些相互作用，乳清蛋白變性，巰基暴露，暴露的游離巰基和二硫鍵之間的反應(yīng)導(dǎo)致聚集[4]。在80 ℃以下對(duì)大豆球蛋白進(jìn)行熱處理時(shí)，隨著處理溫度升高，大豆蛋白的聚集率顯著增加且聚集體的尺寸迅速增加[5]。在熱處理溫度為75～85 ℃時(shí)，豌豆11S球蛋白的亞基發(fā)生了解離和重組同時(shí)產(chǎn)生無規(guī)則的聚集體[6]。

表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）是兒茶素中抗氧化性最強(qiáng)的一種多酚組分，是一種非酶抗氧化劑，其比VE的抗氧化活性高20 倍，在抗癌、抗炎及預(yù)防心腦血管疾病等方面表現(xiàn)出來的優(yōu)良藥理活性均與其超強(qiáng)的抗氧化活性有關(guān)，具有優(yōu)良的生物活性[7-8]。多酚作為天然的小分子活性物質(zhì)對(duì)大豆蛋白的結(jié)構(gòu)具有調(diào)控作用，二者之間可以形成重要的復(fù)合體系，進(jìn)而改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及功能性。多酚與蛋白質(zhì)的相互作用方式主要分為共價(jià)與非共價(jià)形式，包括二硫鍵、氫鍵、離子鍵、疏水鍵、共價(jià)鍵等[9]。Adrar等[10]發(fā)現(xiàn)多酚和蛋白質(zhì)之間主要是非共價(jià)疏水相互作用，可通過氫鍵穩(wěn)定。Chen Gang等[11]利用高壓處理分析蛋白質(zhì)與多酚之間的結(jié)合機(jī)理，發(fā)現(xiàn)二者之間的結(jié)合是通過疏水作用力驅(qū)動(dòng)的。Haslam等[12]發(fā)現(xiàn)多酚與蛋白之間主要是非共價(jià)作用，這些非共價(jià)作用大都是由多點(diǎn)疏水相互作用與氫鍵結(jié)合進(jìn)行。在多酚與蛋白質(zhì)的互作過程中，當(dāng)二者的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)大體相等的情況下，才能最大情況的進(jìn)行絡(luò)合，形成最多的絡(luò)合物，所以需要二者的濃度比適中[13]。Rohn等[14]對(duì)牛血清白蛋白與槲皮素結(jié)合作用進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)二者之間物質(zhì)的量比為2∶1時(shí)結(jié)合最多。綦菁華等[15]研究表明蛋白質(zhì)-多酚聚合物的濁度隨著蛋白質(zhì)或多酚濃度的增大而增大，當(dāng)濁度增大到某一峰值后開始下降。

熱處理環(huán)節(jié)在噴霧干燥、復(fù)性等生產(chǎn)加工過程中必不可少，而不可避免地會(huì)對(duì)大豆蛋白的結(jié)構(gòu)及功能性質(zhì)造成影響。EGCG作為茶多酚提取物兒茶素中的最主要活性成分，具有很強(qiáng)的抗氧化性及抗癌等功效，卻鮮有出現(xiàn)EGCG單體對(duì)大豆蛋白結(jié)構(gòu)調(diào)控機(jī)理的探究。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)不同濃度EGCG-SPI復(fù)合物進(jìn)行熱處理，以及溫度對(duì)EGCG-大豆蛋白復(fù)合體結(jié)構(gòu)的影響，拓寬大豆蛋白食品的應(yīng)用范圍，為生產(chǎn)功能型EGCG-大豆蛋白復(fù)合產(chǎn)品提供理論依據(jù)，同時(shí)對(duì)復(fù)合物的開展與實(shí)施具有一定的現(xiàn)實(shí)意義與應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆（東農(nóng)46號(hào)） 黑龍江省農(nóng)科院；EGCG（分析純） 西安首禾生物科技有限公司；鹽酸、氫氧化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉（分析純） 北京新光化工試劑廠；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

GL-20G-II高速冷凍離心機(jī) 上海盧湘儀離心機(jī)儀器公司；FD5-3型冷凍干燥機(jī) 美國SIM公司；PHSJ-4A型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì) 中國上海雷磁公司；MSE70電子分析天平（0.000 1 g） 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；F-4500熒光分光光度計(jì) 日本Hitachi公司；TU-1800紫外-可見分光光度計(jì) 鄭州飛旭光譜儀器有限責(zé)任公司；Raman Station 400拉曼光譜儀 美國PerkinElmer公司。

1.3 方法

1.3.1 SPI的制備

參考Meinlschmidt等[16]的方法。將新鮮的大豆用粉碎機(jī)粉碎成粉過60 目篩，將大豆粉與正己烷按照1∶3（g/mL）的料液比進(jìn)行充分混合并在室溫下攪拌2 h，然后進(jìn)行3 次脫脂，將得到的大豆粉與去離子水按照1∶10（g/mL）比例混合。用2 mol/L NaOH溶液將混合液pH值調(diào)節(jié)至8.5后，在室溫下攪拌2 h，然后對(duì)混合液9 000×g離心20 min得到上清液，用2 mol/L HCl溶液將其pH值調(diào)節(jié)至4.5。將調(diào)節(jié)過pH值的上清液靜置2 h后6 000×g離心20 min，進(jìn)而除去上清液得到蛋白沉淀。最后將蛋白沉淀溶于去離子水中得到蛋白質(zhì)溶液，用2 mol/L NaOH溶液將其pH值調(diào)節(jié)至7.0。將蛋白溶液在－40 ℃條件下進(jìn)行24 h的預(yù)凍處理，后放入冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行干燥后得到粉末狀的SPI。

1.3.2 SPI-EGCG復(fù)合體系制備

用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）溶解SPI粉末制成溶液，質(zhì)量濃度為1 mg/mL，使用磁力攪拌器攪拌30 min，保證SPI的充分溶解。按0、0.05、0.1、0.15 mg/mL的質(zhì)量濃度將EGCG分別溶于SPI溶液中并在室溫下磁力攪拌2 h，使SPI與EGCG充分混合互作，制成SPI-EGCG復(fù)合體系。按照同樣的方法制備出SPI-EGCG復(fù)合體系在85 ℃下水浴加熱15 min后立即進(jìn)行冰浴冷卻至室溫。

1.3.3 SPI與EGCG結(jié)合機(jī)理分析

制備質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的SPI溶液，取10 mL SPI溶液置于若干試管中，按照0、0.05、0.1、0.15 mg/mL將EGCG分別溶于蛋白溶液中，利用渦旋振蕩器對(duì)SPI-EGCG溶解進(jìn)行振蕩混勻后，分別在25、33、41 ℃的恒溫水浴鍋中進(jìn)行水浴保溫5 min。利用熒光分光光度計(jì)連續(xù)掃描測(cè)定樣品測(cè)定熒光強(qiáng)度，熒光測(cè)定使用四面透光比色皿，選擇激發(fā)波長280 nm，掃描波長為300～500 nm，激發(fā)狹縫為5 nm，同樣發(fā)射狹縫寬也為5 nm，重復(fù)掃描3 次求平均值。

1.3.4 SPI-EGCG復(fù)合體系結(jié)合度的測(cè)定

根據(jù)Rodríguez等[17]的方法稍作修改，對(duì)SPI-EGCG復(fù)合體系中SPI與EGCG結(jié)合度進(jìn)行測(cè)定。首先制備EGCG的標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后將不同質(zhì)量濃度的EGCG與SPI復(fù)合體系分別經(jīng)截留3 kDa的透析袋在4 ℃條件下進(jìn)行避光透析12 h，然后使用高效液相色譜測(cè)定透析液中EGCG在波長520 nm處的吸光度并計(jì)算其含量。復(fù)合體系中SPI與EGCG的結(jié)合度按式（1）計(jì)算：

式中：REGCG為復(fù)合體系中EGCG與SPI結(jié)合率/%；m總EGCG為EGCG總質(zhì)量/mg；m透析為透析液中未結(jié)合的游離EGCG質(zhì)量/mg。

1.3.5 SPI-EGCG復(fù)合體系的紅外光譜測(cè)定

將SPI-EGCG復(fù)合體系進(jìn)行冷凍干燥得到凍干粉末，將一定質(zhì)量的溴化鉀與1 mg的凍干粉末進(jìn)行充分混合后壓片。在25 ℃條件下，采用紅外光譜儀對(duì)壓片譜帶進(jìn)行掃描，將分辨率設(shè)為4 cm－1，掃描范圍為4 000～400 cm－1，掃描次數(shù)為64。采用Peakfit Version軟件將樣品峰進(jìn)行擬合，使相似率達(dá)到99.9%，通過蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)波譜條帶指認(rèn)表對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中各組分的相對(duì)含量進(jìn)行確定[18]。

1.3.6 SPI-EGCG復(fù)合體系的拉曼光譜測(cè)定

利用拉曼光譜儀選擇條件為激發(fā)光波長785 nm，激光功率80 mW，掃描波數(shù)譜段范圍400～2 000 cm－1，每次掃描的時(shí)間為60 s，積分10 次，4 次掃描進(jìn)行累加。采用ACD Labs V12軟件對(duì)SPI-EGCG復(fù)合體系的拉曼譜圖進(jìn)行基線校正、譜峰歸屬查找。

1.3.7 SPI-EGCG復(fù)合體系熒光光譜測(cè)定

使用F-4500熒光分光光度計(jì)對(duì)SPI-EGCG復(fù)合體系的熒光光譜進(jìn)行測(cè)定。將熱處理前后的SPI-EGCG復(fù)合體系進(jìn)行適當(dāng)稀釋。設(shè)置熒光光譜的測(cè)定條件：激發(fā)波長290 nm，掃描波長300～500 nm，激發(fā)狹縫與發(fā)射狹縫寬均為5 nm。

1.3.8 SPI-EGCG復(fù)合體系紫外-可見光譜測(cè)定

采用磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L，pH 7.4）對(duì)熱處理前后的樣品進(jìn)行稀釋，使樣品中SPI質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL，取200 μL稀釋后的樣品溶液置于96 孔板中，用紫外分光光度計(jì)對(duì)稀釋后樣品的吸收光譜進(jìn)行測(cè)定，掃描波長為260～350 nm。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2.1 EGCG與SPI結(jié)合機(jī)理

SPI是一種熒光物質(zhì)，這是由于其結(jié)構(gòu)中含有色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）及苯丙氨酸（Phe）等發(fā)色基團(tuán)[19]。溶液中的溶質(zhì)與熒光物質(zhì)的相互作用的現(xiàn)象叫作熒光猝滅作用[19]。熒光猝滅作用機(jī)制有2 種，分別是動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅。通過Stern-Volmer方程（2）的計(jì)算可以判斷出物質(zhì)之間的猝滅類型[20]：

式中：F0為加入猝滅劑前SPI溶液的熒光強(qiáng)度；F為加入猝滅劑（EGCG）后SPI溶液的熒光強(qiáng)度；[Q]為EGCG濃度/（mol/L）；Kq為雙分子猝滅速率常數(shù)/（L/（mol?s））；Ksv為動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)/（L/mol）；τ0為猝滅劑（EGCG）不存在時(shí)熒光體的壽命，生物大分子的平均壽命約為10－8s[21]。

根據(jù)Stern-Volmer方程作圖，以[Q]為自變量，F(xiàn)0/F為因變量，得到EGCG對(duì)SPI的內(nèi)源光猝滅曲線圖，由直線的斜率可以計(jì)算SPI-EGCG復(fù)合體系的動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)及雙分子猝滅速率常數(shù)（圖1A），結(jié)果見表1。如果Stern-Volmer曲線斜率隨著溫度的升高而增，即猝滅常數(shù)增大，EGCG對(duì)SPI的猝滅方式為動(dòng)態(tài)猝滅，反之則為靜態(tài)猝滅。由圖1A可以看出，SPI的Stern-Volmer曲線斜率隨著溫度的升高而減小，說明EGCG對(duì)SPI的猝滅方式為靜態(tài)猝滅。正常條件下猝滅劑對(duì)于生物大分子的最大猝滅常數(shù)為2×1010L/（mol?s）[22]，由圖1B可知，EGCG對(duì)SPI的熒光猝滅速率數(shù)量級(jí)均為1012，高于2×1010L/（mol?s），此結(jié)果進(jìn)一步說明EGCG對(duì)SPI猝滅方式為靜態(tài)猝滅。

圖1 不同溫度條件下EGCG猝滅SPI的Stern-Volmer（A）和雙對(duì)數(shù)圖（B）Fig.1 Stern-Volmer (A) and double logarithmic plots of EGCG quenching SPI under different temperature conditions

通過式（3）可以求得靜態(tài)猝滅過程中EGCG與SPI之間的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n：

式中：Ks為表觀結(jié)合常數(shù)；n為結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。

按式（3）計(jì)算，以lg[（F0－F）/F]對(duì)lg[Q]作雙對(duì)數(shù)曲線圖，根據(jù)圖1中的曲線斜率和截距可以得到EGCG與SPI間的表觀結(jié)合常數(shù)Ks和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n，結(jié)果見表1。從表1可以看出，EGCG與SPI間的表觀結(jié)合常數(shù)Ks數(shù)量級(jí)為104，這說明EGCG與SPI間存在著較強(qiáng)的互作關(guān)系，發(fā)生了緊密的結(jié)合，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)平均大于1，也就是說明二者形成了結(jié)合位點(diǎn)數(shù)為1的復(fù)合物。

表1 SPI-EGCG復(fù)合體系的熒光猝滅常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)及表觀結(jié)合常數(shù)Table 1Fluorescence quenching constant, number of binding sites and apparent binding constant of SPI-EGCG complexes

蛋白與小分子物質(zhì)之間主要通過疏水相互作用、靜電作用、氫鍵及范德華力4 種作用相結(jié)合[23]。通過Van’t Hoff方程（式（4）～（6））的計(jì)算，可以求得3 個(gè)熱力學(xué)參數(shù)值，分別為焓變?chǔ)、熵變?chǔ)和Gibbs自由能變?chǔ)。蛋白質(zhì)與小分子之間的作用力可以通過ΔH與ΔS的正負(fù)判斷。通常情況下，如果溫度相差不大，ΔH可視作常數(shù)[24]。

式中：K為結(jié)合常數(shù)；T為溫度/K；R為氣體常數(shù)，取值為0.008 314 kJ/（mol·K）。

物質(zhì)之間的作用力類型可以通過熱力學(xué)參數(shù)的正負(fù)和大小判斷：當(dāng)ΔS＞0時(shí)，可能為疏水及靜電作用力；當(dāng)ΔS＜0時(shí)，可能為氫鍵和范德華力；當(dāng)ΔH＞0且ΔS＞0時(shí)，即為典型疏水作用力；ΔH＜0且ΔS＜0時(shí)，為氫鍵和范德華力；ΔH≈0或很小且ΔS＞0時(shí)，為靜電作用力；ΔH＜0時(shí)，靜電作用為主要作用力[25]。

由表2可知，EGCG與SPI復(fù)合體系ΔG值均小于0，這說明EGCG與SPI之間屬于一個(gè)自由能降低的自發(fā)過程，?H＞0與?S＞0表明EGCG與SPI之間的作用力類型為疏水作用力。

表2 熱力學(xué)參數(shù)值Table 2Thermodynamic parameters

2.2 SPI-EGCG復(fù)合體系結(jié)合度分析

SPI與EGCG復(fù)合后通過透析可以得到?jīng)]有與SPI發(fā)生相互作用的游離EGCG，通過對(duì)游離EGCG含量測(cè)定，計(jì)算SPI與EGCG的結(jié)合率。由圖2可知，室溫下SPI與EGCG的復(fù)合物（pH 7.4、2 h、EGCG質(zhì)量濃度為0、0.05、0.1、0.15 mg/mL）的結(jié)合率分別為（63.74±0.50）%、（69.58±0.55）%、（75.86±0.60）%，說明SPI與EGCG的結(jié)合率隨EGCG質(zhì)量濃度的增大而升高。復(fù)合體系熱處理后結(jié)合率增加，且隨著EGCG質(zhì)量濃度的增大而升高。這是由于熱處理使SPI的空間結(jié)構(gòu)展開，更多的疏水基團(tuán)暴露出來，使SPI與更多EGCG通過疏水相互作用結(jié)合，提高結(jié)合率。該趨勢(shì)與Rodríguez等[17]研究乳清蛋白與多酚相互作用的結(jié)果吻合。

圖2 EGCG與SPI結(jié)合度Fig.2 Analysis of the binding degree between EGCG and SPI

2.3 SPI-EGCG復(fù)合體系的紅外光譜分析

傅里葉變換紅外光譜與拉曼光譜是2 種探究蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)技術(shù)，二者之間具有互補(bǔ)性（圖3）。對(duì)復(fù)合體系中SPI的酰胺I帶做二階導(dǎo)數(shù)，通過計(jì)算得到復(fù)合體系SPI二級(jí)結(jié)構(gòu)的定量信息。

圖3 熱處理前后EGCG-SPI復(fù)合體系的傅里葉變換紅外光譜圖Fig.3 Fourier transform infrared spectra of EGCG-SPI complexes before and after heat treatment

由圖4、表3可知，SPI-EGCG復(fù)合體系的酰胺I帶的吸收峰強(qiáng)度低于純SPI，同時(shí)復(fù)合物中SPI的酰胺I帶從純SPI的1 635.48 cm－1紅移至1 645.82 cm－1左右。SPI-EGCG復(fù)合物中SPI的酰胺I帶在1 600～1 700 cm－1處發(fā)生了峰位的改變，說明EGCG與SPI的復(fù)合會(huì)使SPI的二級(jí)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不同程度的改變[26]。室溫下，隨EGCG質(zhì)量濃度的增大，β-折疊相對(duì)含量隨之減小，α-螺旋相對(duì)含量隨之增大。Kanakis等[27]認(rèn)為多酚對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)的影響主要是由于α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)卷曲4 種結(jié)構(gòu)含量之間轉(zhuǎn)換導(dǎo)致的。EGCG的加入使SPI結(jié)構(gòu)中的β-折疊結(jié)構(gòu)向α-螺旋結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換，增加蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。復(fù)合體系熱處理后，β-折疊相對(duì)含量較熱處理前降低，而α-螺旋相對(duì)含量增加，β-轉(zhuǎn)角與無規(guī)卷曲的相對(duì)含量變化較小，這與李楊等[28]的研究結(jié)果一致。EGCG與SPI復(fù)合時(shí)，主要作用于β-折疊中的氫鍵，從而使β-折疊結(jié)構(gòu)的含量降低，進(jìn)而轉(zhuǎn)換成在穩(wěn)定性高的α-螺旋結(jié)構(gòu)。

圖4 SPI紅外酰胺I帶的擬合圖譜Fig.4 Fitting curves of infrared amide I band in SPI

表3 熱處理前后SPI-EGCG復(fù)合體系中SPI的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量Table 3Secondary structure content of SPI in SPI-EGCG complexes before and after heat treatment

2.4 SPI-EGCG復(fù)合體系的拉曼光譜分析

2.4.1 SPI主鏈結(jié)構(gòu)特征拉曼光譜分析

SPI的構(gòu)象主要由酰胺I帶的拉曼特征峰確定，本實(shí)驗(yàn)中運(yùn)用Raman Spectral Analysis Package Version 2.1軟件對(duì)SPI的拉曼圖譜二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行定量計(jì)算。

蛋白質(zhì)的主鏈結(jié)構(gòu)常用酰胺I帶及酰胺III表征，如圖5所示，1 660～1 670 cm－1處的譜帶表明SPI二級(jí)結(jié)構(gòu)中主要的組分為α-螺旋和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)。

圖5 熱處理前后SPI-EGCG復(fù)合體系拉曼光譜圖Fig.5 Raman spectra of SPI-EGCG complexes before andafter heat treatment

由圖6、表4可知，不同質(zhì)量濃度的EGCG與SPI相互作用后，SPI的二級(jí)結(jié)構(gòu)均發(fā)生了改變。室溫下，隨著EGCG質(zhì)量濃度的增大，SPI結(jié)構(gòu)中β-折疊與β-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量的隨之減小，α-螺旋與無規(guī)卷曲的相對(duì)含量隨之增大，但β-折疊與無規(guī)卷曲相對(duì)含量的變化較小。說明更多的β-折疊轉(zhuǎn)化成了較穩(wěn)定的α-螺旋結(jié)構(gòu)。這與紅外光譜所得結(jié)論一致。而Bhattacharjee等[29]的研究表明β-乳球蛋白在90 ℃熱處理后大量的二級(jí)結(jié)構(gòu)保持完整。從表4比較得知，熱處理對(duì)于SPI-EGCG復(fù)合物中SPI的二級(jí)結(jié)構(gòu)改變顯著，β-折疊相對(duì)含量大幅度降低，同時(shí)α-螺旋相對(duì)含量大幅升高。這可能是由于β-折疊中用于穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的C=O與H棲合成的氫鍵被EGCG破壞，所以β-折疊相對(duì)含量降低。通過對(duì)拉曼光譜的分析，發(fā)現(xiàn)所得結(jié)論與紅外光譜分析結(jié)果基本一致，EGCG的添加改變SPI的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)的變化主要體現(xiàn)在β-折疊向α-螺旋的轉(zhuǎn)變。

圖6 SPI拉曼酰胺I帶的擬合圖譜Fig.6 Fitting curves of Raman amide I band in soybean protein

表4 拉曼光譜測(cè)定熱處理前后SPI-EGCG復(fù)合體系中SPI的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量Table 4Secondary structure content of SPI in SPI-EGCG complexes before and after heat treatment determined by Raman spectroscopy

2.4.2 SPI側(cè)鏈結(jié)構(gòu)特征拉曼光譜分析

色氨酸在拉曼譜圖上表現(xiàn)出的拉曼譜用于表示蛋白質(zhì)微環(huán)境極性變化規(guī)律。Lichan等[30]的研究表明色氨酸殘基從原本“包埋式”轉(zhuǎn)變?yōu)椤氨┞妒健睍?huì)導(dǎo)致在760 cm－1附近區(qū)域的拉曼峰強(qiáng)降低。如表5所示，隨著EGCG質(zhì)量濃度的增加，色氨酸譜帶強(qiáng)度的降低，表明EGCG使色氨酸殘基向“暴露式”方向轉(zhuǎn)變，導(dǎo)致EGCG與更多疏水性殘基發(fā)生疏水相互作用而結(jié)合。復(fù)合體系熱處理后，拉曼圖譜中色氨酸譜帶強(qiáng)度的降低，說明蛋白質(zhì)受熱后更多的色氨酸暴露出來。已有研究表明：蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)受熱會(huì)發(fā)生改變，使色氨酸殘基的暴露出來，所以色氨酸譜帶強(qiáng)度在拉曼譜圖中呈先降低的趨勢(shì)[31]。

表5 熱處理前后EGCG-SPI復(fù)合體系中SPI的側(cè)鏈基團(tuán)譜帶強(qiáng)度Table 5Side chain group intensity of SPI in EGCG-SPI complexes before and after heat treatment

850 cm－1與 830 cm－1兩條譜線是酪氨酸殘基苯環(huán)的呼吸振動(dòng)和面外彎曲倍頻之間的費(fèi)米共振[32]，通過對(duì)比2 條譜線的強(qiáng)度，可以推測(cè)出酪氨酸是氫鍵的供體或是受體。當(dāng)850 cm－1的光譜強(qiáng)度比830 cm－1附近高時(shí)，酪氨酸殘基趨向于暴露；另一方面，當(dāng)850 cm－1強(qiáng)度小于830 cm－1時(shí)，這說明酪氨酸包埋在蛋白質(zhì)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中[33]。通過比較可知，SPI與EGCG的復(fù)合，以及熱處理對(duì)于SPI的處理，都使酪氨酸殘基趨向于“暴露態(tài)”，同時(shí)SPI與EGCG的復(fù)合導(dǎo)致酪氨酸拉曼歸屬峰強(qiáng)度降低，這也在一定程度上說明SPI與EGCG的互作位點(diǎn)是蛋白質(zhì)的疏水側(cè)鏈基團(tuán)。

脂肪族氨基酸的拉曼歸屬譜線為1 450 cm－1，Mcclements等[34]發(fā)現(xiàn)脂肪族氨基酸暴露會(huì)導(dǎo)致其拉曼歸屬峰強(qiáng)度降低。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，熱處理與EGCG的添加均會(huì)導(dǎo)致大豆蛋白在1 450 cm－1處的拉曼歸屬峰顯著降低，說明脂肪族氨基酸向“暴露態(tài)”方向轉(zhuǎn)變，這與大豆蛋白結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變有關(guān)。

2.4.3 SPI二硫鍵構(gòu)型的拉曼光譜分析

維持蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的主要作用力是二硫鍵，其特征譜帶的范圍為500～550 cm－1。二硫鍵在不同振動(dòng)模式下反映出的拉曼位移有所不同，如500～510 cm－1處為gauche-gauche-gauche模式，515～525 cm－1為gauchegauche-trans模式，535～545 cm－1為trans-gauche-trans模式[35]。結(jié)合表6可以看出，SPI二硫鍵的主要構(gòu)型為g-g-g模式。隨著EGCG的加入，大豆蛋白二硫鍵構(gòu)型發(fā)生顯著變化，由g-g-g模式轉(zhuǎn)化為g-g-t和t-g-t模式。而熱處理后大豆蛋白的二硫鍵構(gòu)型主要向t-g-t振動(dòng)模式轉(zhuǎn)換。這主要因?yàn)閠-g-t代表分子間的二硫鍵的振動(dòng)模式，熱處理加強(qiáng)了分子間的交互作用，而EGCG的加入導(dǎo)致分子內(nèi)的振動(dòng)模式g-g-g增加，分子內(nèi)二硫鍵含量增多，分子間的二硫鍵減少，說明EGCG與SPI形成穩(wěn)定的復(fù)合物。

表6 熱處理前后EGCG-SPI復(fù)合體系中S PI的二硫鍵構(gòu)型Table 6Disulfide bond configuration composition of SPI in EGCG-SPI complexes before and after heat treatment

2.5 SPI-EGCG復(fù)合體系熒光光譜分析

由圖7可知，室溫下EGCG與SPI的相互作用對(duì)SPI的熒光有猝滅作用，并且猝滅效果隨著EGCG質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng)。同時(shí)SPI的最大熒光發(fā)射波長發(fā)生了一定的紅移，從純蛋白的335 nm紅移到355 nm，這說明EGCG與SPI發(fā)生相互作用，從而使SPI的結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，使色氨酸與酪氨酸所處環(huán)境由疏水變成了親水，進(jìn)而使肽鏈的結(jié)構(gòu)變得舒展[36-37]。復(fù)合體系經(jīng)熱處理后，SPI的最大熒光強(qiáng)度較未處理下的SPI增加，同時(shí)最大發(fā)射波長發(fā)生了輕微的紅移，表明熱處理使更多的色氨酸暴露出來同時(shí)所處環(huán)境轉(zhuǎn)移到了更親水或極性微環(huán)境中，這是由于SPI在熱處理下空間結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變[38-39]。同時(shí)EGCG對(duì)SPI的猝滅作用大于熱處理前，且SPI的最大熒光發(fā)射波長發(fā)生了一定的紅移。這是由于熱處理使SPI發(fā)生了變性結(jié)構(gòu)展開，使更多的色氨酸殘基被EGCG猝滅[40]。熱處理前后不同濃度EGCG對(duì)SPI結(jié)構(gòu)的調(diào)控具有相同的效果，且熱處理后效果更明顯，說明熱處理及多酚濃度是影響小分子對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)調(diào)控的2 個(gè)主要因素。

圖7 熱處理前后EGCG-SPI復(fù)合體系的熒光光譜分析圖Fig.7 Fluorescence spectra of EGCG-SPI complexes before and after heat treatment

2.6 SPI-EGCG復(fù)合體系紫外-可見光譜分析

由圖8可知，室溫下隨著EGCG質(zhì)量濃度的增加，復(fù)合體系的紫外-可見光吸收光譜的最大吸收峰發(fā)生了不同程度的紅移，說明EGCG與SPI的相互作用導(dǎo)致SPI的空間構(gòu)象發(fā)生了改變。薛春霞等[20]的研究表明多酚類物質(zhì)進(jìn)入蛋白質(zhì)分子的疏水氨基酸殘基中并通過疏水相互作用結(jié)合在一起形成了疏水腔，從而導(dǎo)致吸收峰紅移動(dòng)現(xiàn)象的發(fā)生。復(fù)合體系熱處理后，SPI的紫外吸收峰發(fā)生紅移，同時(shí)不同質(zhì)量濃度EGCG均導(dǎo)致復(fù)合體系的吸收峰發(fā)生了紅移，且紅移程度高于室溫下的樣品。這是由于加熱使蛋白的疏水基團(tuán)暴露出來同時(shí)使具有紫外吸收能力的酪氨酸殘基暴露至SPI分子表面，所以SPI的吸收峰發(fā)生了紅移，這與Natasa等[41]的結(jié)果一致。

圖8 熱處理前后EGCG-SPI復(fù)合體系的紫外光譜圖Fig.8 Ultraviolet spectra of EGCG-SPI complexes before and after heat treatment

3 結(jié) 論

以實(shí)驗(yàn)室自制的SPI與EGCG作為研究的原料，制備SPI-EGCG復(fù)合體系，二者的猝滅方式為靜態(tài)猝滅，且作用力為疏水相互作用。通過紅外光譜和拉曼光譜的分析，EGCG對(duì)SPI的調(diào)控使SPI二級(jí)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不同程度的改變。熱處理前后，SPI二級(jí)結(jié)構(gòu)均出現(xiàn)隨EGCG質(zhì)量濃度的增大β-折疊相對(duì)含量隨之減小，α-螺旋相對(duì)含量與隨之增大的現(xiàn)象。并且拉曼光譜側(cè)鏈顯示EGCG與SPI的疏水側(cè)鏈基團(tuán)通過疏水相互作用結(jié)合，且熱處理使二者之間的相互作用增強(qiáng)。熒光光譜和紫外-可見光光譜表明：熱處理前后EGCG對(duì)SPI結(jié)構(gòu)的調(diào)控均對(duì)SPI的熒光有猝滅作用，且熱處理后的猝滅效果更強(qiáng)。