陳 勉，袁丹丹，牛林林，陳 磊，邵華榮，張曉元，張艷艷，劉 飛, ，凌沛學(xué), ，陳 凱

（1. 山東省藥學(xué)科學(xué)院 山東省生物藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東省多糖類藥物工程實(shí)驗(yàn)室 多糖類藥物發(fā)酵與精制國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室 博士后科研工作站，山東 濟(jì)南 250101；2. 山東大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250101；3. 東阿生力源阿膠股份有限公司 聊城市阿膠多肽提取技術(shù)研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 聊城 252218）

侵襲性曲霉病、侵襲性念珠菌病等侵襲性真菌感染發(fā)病率近年不斷升高[1-4]，盡管檢測(cè)水平不斷提高，如某些常見致病真菌可通過(guò)分子技術(shù)平臺(tái)實(shí)現(xiàn)特異快速檢測(cè)，達(dá)到縮短診斷時(shí)間盡早用藥目的[5]，但侵襲性真菌病的致死率仍然高達(dá)40 %。病例數(shù)呈指數(shù)級(jí)上升的金假絲酵母（Candida auris）侵襲性真菌病死亡率接近60 %[6-10]，部分罕見真菌賽多孢子菌（Scedosporium）、多育孢子蟲（Lomentospora）可達(dá)80 %[11]。死亡率高的可能原因是侵襲性真菌病的病原體為條件致病菌，個(gè)體致病菌株的早期可檢出性有不確定性，可選的治療藥物品種和策略有限[12]，也與耐藥株出現(xiàn)及侵襲性真菌病患者自身免疫抑制狀態(tài)等有關(guān)。

目前臨床抗真菌的藥物主要是唑類、兩性霉素、棘白菌素等直接抑殺體內(nèi)真菌的化學(xué)藥物，不能有效防控臨床侵襲性真菌病[13]。Ademe等[14]認(rèn)為在目前的治療策略中，免疫調(diào)節(jié)和干預(yù)是近年抗侵襲性真菌病研究的重要研究方向，尤其是預(yù)防侵襲性真菌病疫苗研究[15]。隨著對(duì)真菌感染和機(jī)體應(yīng)答機(jī)制的認(rèn)識(shí)逐步深入，Boniche等[16]報(bào)道了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)有效的候選疫苗臨床前研究。但自10年前首次開展2 ～3種抗真菌疫苗（非侵襲性真菌?。┑腎期、II期臨床研究[17-18]，至今仍沒有治療或預(yù)防侵襲性真菌感染的疫苗獲批，該方向疫苗缺乏是一個(gè)日益重要的問題[19-20]。因此，為提高臨床實(shí)驗(yàn)成功率，仍需進(jìn)一步加強(qiáng)臨床前的預(yù)防侵襲性真菌病疫苗篩選和優(yōu)化研究。

用于抗真菌感染的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型有小鼠、果蠅、線蟲、鵪鶉蛋[21-22]等類型，但涉及免疫保護(hù)應(yīng)答和真菌挑戰(zhàn)測(cè)試的主要是通過(guò)小鼠進(jìn)行研究，這些哺乳動(dòng)物模型更能代表人類的情況。目前預(yù)防真菌感染的模型研究，主要采用常規(guī)體液免疫和攻毒致死率、腎臟菌載量和腎臟PAS染色切片[21,23]等指標(biāo)，還需不斷探索模擬臨床患者狀況的免疫抑制造模方法，建立和選擇具有針對(duì)性的免疫功能和信號(hào)通路分析指標(biāo)，這對(duì)加快疫苗開發(fā)具有重要指導(dǎo)意義。

1 免疫抑制造模方法

包括真菌在內(nèi)的環(huán)境微生物與人體皮膚黏膜屏障、固有免疫和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)相互影響和作用，當(dāng)人體免疫平衡被破壞后，會(huì)顯現(xiàn)疾病狀態(tài)。臨床發(fā)生侵襲性真菌病病因主要有醫(yī)源性治療和自身免疫低下，包括化療藥物、免疫抑制劑、廣譜抗生素、假體裝置和移植，中性粒細(xì)胞減少癥和人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus,HIV），導(dǎo)致在健康人群體內(nèi)共生的部分真菌侵襲發(fā)病[24]。前期的侵襲性真菌病的臨床前免疫治療實(shí)驗(yàn)若在健康小鼠上進(jìn)行，在功效分析時(shí)，小鼠正常的免疫功能可能被忽視，得到的部分治療有效結(jié)論的證據(jù)可能不充分，所以有必要首先研究建立免疫功能受到抑制的小鼠模型。

1.1 藥物誘發(fā)的免疫抑制

Xin[25-26]研究在接種白假絲酵母菌前3天，對(duì)小鼠腹腔注射200 mg/kg環(huán)磷酰胺；在給予真菌感染后每10天（或7天）按150 mg/kg連續(xù)注射，使首次注射后3 ～4天中性粒細(xì)胞<500 個(gè)/mm3，并持續(xù)整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間。Moser等[27]研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)小鼠單次環(huán)磷酰胺200 mg/kg腹腔注射后，外周血白細(xì)胞迅速被抑制，雖然多形核白細(xì)胞和單核細(xì)胞數(shù)量迅速反彈回正常和更高水平，而淋巴細(xì)胞在4周觀察期內(nèi)能保持被抑制狀態(tài)。Zhang等[28]按 80 mg/kg劑量給小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺，注射后第3，4天體重明顯下降，第10天檢測(cè)結(jié)果顯示胸腺和脾臟指數(shù)明顯下降，巨噬細(xì)胞吞噬作用降低，干擾素-γ（interferon-γ, IFN-γ）和白介素10（interleukin-10 kt,IL-10）水平升高，免疫球蛋白G（immunoglobulin G, IgG）、IgM和IgA數(shù)量減少。Singh等[29]在最后一次增強(qiáng)免疫后的第12天，也是真菌攻毒日的倒數(shù)第2天和攻毒后第3天，小鼠腹腔注射200 mg/kg環(huán)磷酰胺和皮下注射250 mg/kg醋酸可的松，使小鼠中性粒細(xì)胞減少。還有文獻(xiàn)報(bào)道單獨(dú)使用皮質(zhì)類固醇建立小鼠免疫抑制模型[30]，及從真菌攻毒日的倒數(shù)第3天直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束，每天給小鼠125 mg/kg劑量皮下注射醋酸可的松模型[25]。Wiederhold[31]在真菌感染小鼠前1天，一次性按150 mg/kg給予氟尿嘧啶，感染后第1 ～8天小鼠血液中的中性粒細(xì)胞數(shù)量<2×109個(gè)/L（最低1×109個(gè)/L）。

1.2 骨髓移植形成的免疫抑制

小鼠在骨髓移植后約3天在外周血和肺部可觀察到嚴(yán)重的中性粒細(xì)胞減少，由此可制作小鼠免疫力低下模型[32]。首先將C3H/HeJ小鼠暴露于18 mV光子束直線加速器的9 Gy單次致死劑量下，設(shè)置焦點(diǎn)到皮膚的距離為75 cm，劑量為0.7 Gy/min，造成骨髓抑制；然后將從DBA/2小鼠股骨和脛骨取出的骨髓，去除T細(xì)胞后，制成4×106細(xì)胞/ml懸液通過(guò)C3H/HeJ小鼠尾靜脈注射0.5 ml進(jìn)行骨髓移植。

1.3 轉(zhuǎn)基因小鼠免疫抑制

Yu等[33]報(bào)道Harlan公司的Beigenu/nuXIDIII是免疫抑制裸鼠，可直接用于研究。一種具有補(bǔ)體途徑C5遺傳缺陷的近交系A(chǔ)/J小鼠，不需環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)免疫抑制，有望成為研究金耳酵母侵襲性感染發(fā)病機(jī)制的模型，用于由真菌引起的免疫反應(yīng)和篩選抗真菌疫苗研究[34]。

2 免疫功能指標(biāo)

傳統(tǒng)減毒株方法制備的疫苗可能不適用免疫抑制患者，Oliveira等[18]認(rèn)為開發(fā)亞單位等類型疫苗有望提高免疫抑制患者的應(yīng)用安全性，但這類探索性疫苗的有效性研究需對(duì)疫苗免疫應(yīng)答機(jī)制和功能有更深入認(rèn)識(shí)。

2.1 細(xì)胞免疫功能

入侵機(jī)體內(nèi)環(huán)境的真菌抗原通過(guò)抗原呈遞細(xì)胞（antigen-presenting cell, APC）主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）II類分子遞呈給CD4+T輔助細(xì)胞（Th）。CD4+Th介導(dǎo)釋放免疫細(xì)胞因子、幫助B細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞發(fā)揮作用，對(duì)于防御真菌病至關(guān)重要。CD4+Th細(xì)胞可進(jìn)一步誘導(dǎo)分化為輔助型T細(xì)胞（Th1、Th17、Th2）和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）。Th1、Th17細(xì)胞有促進(jìn)炎癥反應(yīng)作用，其中Th1細(xì)胞所釋放的IFN-γ和Th17細(xì)胞所釋放的IL-17在對(duì)抗真菌作用中起到關(guān)鍵作用；Th2細(xì)胞輔助B細(xì)胞活化發(fā)揮體液免疫的作用，也可加劇感染程度促進(jìn)過(guò)敏反應(yīng)造成宿主組織損害；Tregs是一類控制體內(nèi)自身免疫反應(yīng)性的T細(xì)胞亞群，可調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，協(xié)調(diào)對(duì)機(jī)體的保護(hù)/損害兩類免疫作用。Tregs的雙向調(diào)節(jié)功能也造成人體對(duì)真菌的耐受和長(zhǎng)期感染，并且有研究顯示人體抗真菌功能的發(fā)揮并不依賴Tregs，因此本文對(duì)Tregs的功能考察從略[35]。綜上所述目前預(yù)防侵襲性真菌感染疫苗研究的關(guān)鍵技術(shù)是如何激發(fā)強(qiáng)烈的T細(xì)胞免疫應(yīng)答。

分析具有特定表面標(biāo)志性分子T細(xì)胞及相應(yīng)細(xì)胞因子的水平及變化是監(jiān)測(cè)候選疫苗誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫應(yīng)答的重要工具，可通過(guò)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)（enzyme linked immunospot assay，ELISpot）或酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）以及流式細(xì)胞胞內(nèi)因子染色法（intracellular cytokine staining，ICS）實(shí)現(xiàn)[29,36-37]。目前在預(yù)防侵襲性真菌感染疫苗研究中，常見的T細(xì)胞亞型及所分泌的細(xì)胞因子種類見表1。

表1 考察候選疫苗對(duì)T細(xì)胞亞群作用機(jī)制的表面標(biāo)志性分子和細(xì)胞因子

2.2 固有免疫吞噬功能

Ravikumar等[24]指出在機(jī)體的抗真菌過(guò)程中，巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等固有免疫系統(tǒng)的病原體識(shí)別受體（pathogenrecognition receptor，PRR）首先識(shí)別真菌細(xì)胞壁中葡聚糖、幾丁質(zhì)、甘露聚糖等病原體相關(guān)分子模式（pathogen associated molecular pattern，PAMP），具有募集和發(fā)揮吞噬、定向殺滅真菌病原體，及分泌細(xì)胞因子介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和進(jìn)行抗原遞呈等重要作用；同時(shí)發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞的抗真菌活性可被粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）、IFN等細(xì)胞因子刺激而增強(qiáng)。Lionakis等[35]發(fā)現(xiàn)在侵襲性真菌感染過(guò)程中，巨噬細(xì)胞等吞噬細(xì)胞可通過(guò)表觀遺傳重組引起組蛋白三甲基化和乙酰化，產(chǎn)生屬于固有免疫具有記憶功能的馴化免疫。

2.2.1 巨噬細(xì)胞活性 巨噬細(xì)胞通過(guò)PAMP識(shí)別入侵真菌，主要發(fā)揮吞噬和胞內(nèi)殺滅真菌作用。Singh等[29]采用調(diào)理吞噬細(xì)胞殺滅試驗(yàn)法（opsonophagocytic killing assay，OPK），培養(yǎng)小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞，添加1 ng/ml 脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）處理24 h激活巨噬細(xì)胞；將活化的巨噬細(xì)胞與金耳酵母細(xì)胞以1:1比例添加至微量滴度孔，溫和搖動(dòng)培養(yǎng)2 h定量接種于酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基（yeast extract peptone dextrose medium，YPD）瓊脂平板，通過(guò)平均菌落數(shù)計(jì)算巨噬細(xì)胞對(duì)金耳酵母細(xì)胞的殺滅率。Wüthrich等[37]從小鼠肺泡灌洗液收集巨噬細(xì)胞，以105個(gè)細(xì)胞/孔的濃度于37 °C，5 % CO2培養(yǎng)3 h，洗去未貼壁的細(xì)胞，在完全培養(yǎng)基或添加IFN-γ、IL-17A/A和IL-17 A/F的培養(yǎng)基中過(guò)夜；添加感染指數(shù)達(dá)到0.01的皮炎桿菌酵母，于37 °C，5 % CO2共培養(yǎng)24 h，收集上清，并用無(wú)菌水溶解細(xì)胞。將裂解液涂布于腦心浸液瓊脂上，1周后計(jì)數(shù)菌落數(shù)。

2.2.2 中性粒細(xì)胞活性 中性粒細(xì)胞是固有免疫的主要效應(yīng)細(xì)胞，可通過(guò)Toll樣受體2（Toll like receptor 2, TLR2）、TLR4、C型凝集素受體（C-type lectin receptor, CLR）、dectin-1、穿透素3（pentraxin3,PTX3）和補(bǔ)體受體識(shí)別真菌，釋放中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)（neutrophil Extracellular Traps, NET ）、細(xì)胞因子或作為調(diào)理素，高效、快速殺滅真菌。在真菌感染中，炎癥部位的中性粒細(xì)胞募集、活化和存活受Th17通路的影響[24]。收集小鼠腹膜中的中性粒細(xì)胞，按4×105個(gè)細(xì)胞/孔的濃度培養(yǎng)2 h后收集非黏附細(xì)胞；在完全培養(yǎng)基或添加刺激液的培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜；添加測(cè)試用真菌，于37 °C，5 % CO2共培養(yǎng)4 h，收集上清并溶解細(xì)胞，涂布于腦心浸液瓊脂上培養(yǎng)計(jì)算真菌菌落數(shù)[37]。中性粒細(xì)胞對(duì)體內(nèi)不同真菌的殺傷能力有差異，如與白色念珠菌相比，人類中性粒細(xì)胞不能有效地殺死金耳酵母[40]。有發(fā)現(xiàn)脾臟酪氨酸激酶是中性粒細(xì)胞對(duì)念珠菌不同種反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子[41]。

2.2.3 樹突狀細(xì)胞活性 樹突狀細(xì)胞通過(guò)dectin-1、TLR2和TLR4等受體識(shí)別真菌，釋放細(xì)胞因子激活固有免疫，通過(guò)抗原遞呈促進(jìn)原始T細(xì)胞向CD4+T細(xì)胞的分化[24]。

樹突狀細(xì)胞吞噬作用試驗(yàn)，是將樹突狀細(xì)胞接種于96孔板，然后將熒光標(biāo)記的白色念珠菌以樹突狀細(xì)胞:酵母 = 1:1的比例與樹突狀細(xì)胞混合；培養(yǎng)一段時(shí)間后加入臺(tái)盼藍(lán)猝滅未被樹突狀細(xì)胞吞噬的白色念珠菌熒光。收集細(xì)胞并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)和熒光顯微鏡分析被吞噬的白色念珠菌[42]。樹突狀細(xì)胞殺傷試驗(yàn)，是將樹突狀細(xì)胞接種后，加入50 μl 2×106ml/L白色念珠菌至第一個(gè)樹突狀細(xì)胞孔中混合，然后以1:4比例連續(xù)稀釋白色念珠菌6次分別與其余樹突狀細(xì)胞混合；同時(shí)將不與樹突狀細(xì)胞混合培養(yǎng)的白色念珠菌以平行方式稀釋作為對(duì)照組；培養(yǎng)24 h后通過(guò)顯微鏡計(jì)算每個(gè)孔中的白色念珠菌菌落數(shù)，白色念珠菌菌株的存活率=含樹突狀的菌落數(shù)/無(wú)樹突狀細(xì)胞的菌落數(shù)×100%[42]。

除此之外，有抗真菌作用的固有免疫細(xì)胞還有分泌GM-CSF的自然殺傷細(xì)胞（natural killer cell，NK）細(xì)胞、介導(dǎo)IFN-γ依賴性殺傷的 γδT細(xì)胞、上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞[35,43]。

2.3 體液免疫功能

在Th2細(xì)胞IL-4、IL-10和IL-13等細(xì)胞因子作用下，B細(xì)胞可被活化形成漿細(xì)胞，生成和分泌大量特異性抗體，通過(guò)ELISA反應(yīng)檢測(cè)抗體滴度進(jìn)行研究[29]。但是真菌受宿主抗體介導(dǎo)的消除效果通常不及細(xì)菌，例如通過(guò)識(shí)別抗原抗體復(fù)合體Fc端信號(hào)補(bǔ)體可裂解消殺細(xì)菌，而真菌能抵抗這種裂解作用[44]。

3 免疫信號(hào)通路指標(biāo)

抗真菌的免疫應(yīng)答過(guò)程，通過(guò)宿主的模式識(shí)別受體PRRs介導(dǎo)激發(fā)下游信號(hào)通路，促進(jìn)響應(yīng)細(xì)胞因子釋放，激活吞噬、殺滅真菌等固有免疫反應(yīng)，及通過(guò)抗原遞呈形成適應(yīng)性免疫直接或間接調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞的功能[45-49]。已知能識(shí)別真菌的PRR數(shù)量遠(yuǎn)多于其他微生物的[50]。識(shí)別真菌的PRR的指標(biāo)性受體按重要性主要有CLR、TLR和其他型。真菌表面不同多糖的疫苗相關(guān)PRR包括識(shí)別β-葡聚糖的CLR如dectin-1，TLR如TLR-2；識(shí)別甘露糖的Dectin-2/dectin-3、甘露糖受體（mannose receptor，MR）、巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的C型凝集素受體（macrophage-inducible C-type lectin，Mincle）、galectin-3、樹突狀細(xì)胞特異性細(xì)胞間黏附分子-3-結(jié)合非整合素分子（DC-specific intercellular adhension molecular-3 grabbing nonintigrin，DCSIGN）和TLR的TLR-2/TLR-4；識(shí)別幾丁質(zhì)的MR，TLR-9和其他類的NOD樣受體（nucleotide binding oligomerization domain like receptors 2，NOD-2）[50]。

近年新發(fā)現(xiàn)的潛在靶標(biāo)，如c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase 1, JNK1）通過(guò)抑制CD23表達(dá)下調(diào)宿主抗真菌的固有免疫反應(yīng)，有望作為抗真菌感染的治療性靶標(biāo)[51]。shCD5受真菌β-葡聚糖激活，可提高攻毒小鼠存活率，減少真菌負(fù)荷和增加靶器官白細(xì)胞浸潤(rùn)[52]。E3泛素連接酶CBL-B有重要調(diào)節(jié)作用，通過(guò)CBL-B可調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的CLR信號(hào)通路，抑制CBL-B通路可增加殺傷真菌作用[53]。B細(xì)胞表面信號(hào)CD23（CLEC4）是真菌的CLR，可識(shí)別白念和曲霉細(xì)胞壁的α-甘露糖和β-葡聚糖，但不能識(shí)別隱球菌，可與FcRr形成復(fù)合物誘導(dǎo)NF-κB活化，產(chǎn)生抗真菌的免疫作用[54]。

總之，隨著預(yù)防侵襲性真菌感染的疫苗研究深入，更多的影響因素和隱藏的機(jī)制正在被發(fā)現(xiàn)，與防治效果關(guān)聯(lián)性更明顯的指標(biāo)逐步明朗，可用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型和攻毒真菌種類[55]也不斷得到豐富，這些將有助于盡早快速準(zhǔn)確篩選出適合人類預(yù)防侵襲性真菌感染的疫苗。