孟慶山，馬芳芳，鞏騰飛，李琳琳

（威海市食品藥品檢驗檢測中心，山東 威海 264200）

雙黃消炎片是由三顆針、黃芩兩味中藥組成，收載于《衛(wèi)生部藥品標準》第二冊（WS3-B-0235-90）[1]，具有消炎功效，用于咽喉疼、腹瀉、痢疾、慢性痢疾，是應用于臨床的常用消炎藥物之一。在《中國藥典》2020年版一部中將鹽酸小檗堿做為三顆針含量測定的指標成分，將黃芩苷做為黃芩含量測定的指標成分[2]，而現(xiàn)行的藥品標準相對簡單，沒有含量測定項目，不能有效控制藥品質(zhì)量。目前，對雙黃消炎膠囊中單一成分的含量測定方法已有報道[3-6]，但這些方法不利于快速全面檢驗，尚未見用高校液相色譜法（HPLC）同時測定鹽酸小檗堿、黃芩苷2種指標成分的報道。因此，本文建立了HPLC同時測定雙黃消炎片中鹽酸小檗堿和黃芩苷的含量測定方法，該方法操作間簡單、準確，專屬性、重現(xiàn)性好，能為該產(chǎn)品質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-20AT高效液相色譜儀（LC Solution工作站）；MS105DU型電子天平（梅特勒-托利多公司）；KQ-250DA型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

鹽酸小檗堿對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110713-201814，含量86.7 %）；黃芩苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110715-201821，含量95.4 %）；雙黃消炎片（廠家A，批號：08171006；廠家B，批號：18120161；廠家C，批號：190701，規(guī)格：0.4 g/片），乙腈為色譜純，水為娃哈哈純化水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：InertSustain C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A），0.05 mol/ L磷酸二氫鉀溶液（B），梯度洗脫（程序見表1）；流速為1.0 ml/min；檢測波長265 nm；柱溫30 ℃；進樣量10 μl。

表1 梯度洗脫程序

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 精密稱取鹽酸小檗堿、黃芩苷對照品適量，加甲醇超聲溶解，制成鹽酸小檗堿0.2150 mg/ml，黃芩苷0.5128 mg/ml的混合對照品溶液Ⅰ，精密量取10 ml置入50 ml量瓶，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為混合對照品溶液Ⅱ。

2.2.2 供試品溶液制備 取樣品20片，研細，取約0.15 g，精密稱定，置100 ml量瓶中，加甲醇適量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）40 min，放冷，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.2.3 陰性對照溶液制備 按雙黃消炎片處方工藝分別制備不含三顆針的陰性對照和不含黃芩的陰性對照，按“2.2.2”項下方法分別制成陰性對照溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 系統(tǒng)適用性試驗 分別取混合對照品溶液Ⅱ、供試品溶液以及陰性對照溶液各10 μl，按“2.1”項下色譜條件測定，記錄色譜圖。結(jié)果表明，在本實驗條件下，供試品色譜圖中主峰保留時間與對照品色譜圖主峰保留時間一致；對照品溶液和供試品溶液中鹽酸小檗堿、黃芩苷的理論塔板數(shù)均大于8000，與相鄰峰的分離度均大于1.5；陰性對照表明，其他組分對鹽酸小檗堿、黃芩苷的測定無干擾，滿足定量要求，見圖1。

圖1 各成分HPLC色譜圖

2.3.2 線性關系考察 分別精密吸取對照品溶液Ⅰ 1，2，5，10，15，20 ml，置50 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，按“2.1”項下色譜條件分別精密吸取10 μl，注入液相色譜儀測定，以質(zhì)量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），進行線性回歸，結(jié)果見表2，表明各成分在各自范圍內(nèi)呈良好的線性關系。

表2 線性關系考察結(jié)果

2.3.3 精密度試驗 精密吸取“2.2.1”項下混合對照品溶液Ⅱ 10 μl，按“2.1”項下色譜條件，連續(xù)進樣6次，測得鹽酸小檗堿、黃芩苷峰面積的RSD分別0.30 %，0.34 %，結(jié)果表明精密度良好。

2.3.4 重復性試驗 取同一批樣品（批號：08171006），按“2.2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”所述色譜條件進行測定。測得鹽酸小檗堿、黃芩苷平均含量分別為12.50，60.70 mg/g，其RSD分別為0.28 %，0.26 %，表明方法重復性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件，分別于配制后0，3，6，9，12，15，18，21 h進樣，測得鹽酸小檗堿、黃芩苷峰面積的RSD分別為0.72 %，0.45 %。結(jié)果表明，供試品溶液室溫放置21 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6 加樣回收試驗 取已知含量的同一批樣品（批號：08171006）細粉約0.075 g，精密稱定，共9份，平均分為3組，按低、中、高濃度分別加入混合對照品溶液（鹽酸小檗堿、黃芩苷濃度分別為0.1066，0.5304 mg/ml）各8，10，12 ml，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，照“2.1”項下色譜條件測定，計算加樣回收率，結(jié)果見表3。

表3 加樣回收試驗結(jié)果

2.3.7 樣品測定 取樣品3批，按“2.2.2”項方法制備供試品溶液，照“2.1”項色譜條件測定，每個批號平行測3次，結(jié)果見表4。

表4 樣品中各成分含量測定結(jié)果（/mg·g-1，n=3）

3 討論與結(jié)論

3.1 指標成分的確定

參照《中國藥典》2020年版一部及相關文獻報道[2-6]，結(jié)合雙黃消炎片處方中2味藥材主要成分及各成分性質(zhì)，最終選擇鹽酸小檗堿、黃芩苷作為含量測定的指標成分。

3.2 色譜條件選擇

3.2.1 流動相 本實驗考察了乙腈-0.1 %磷酸、乙腈-0.2 %磷酸、乙腈-0.4 %磷酸、乙腈-甲醇-0.2 %磷酸、乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液為流動相等度和梯度洗脫[7-11]，發(fā)現(xiàn)乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液為流動相梯度洗脫，指標成分達到基線分離，色譜峰峰形和分離度較好。

3.2.2 檢測波長 本實驗兩個指標成分最大吸收波長各不相同，黃芩苷最大吸收波長是276 nm和315 nm附近，鹽酸小檗堿最大吸收波長是264 nm和346 nm附近[12]，考慮到樣品種鹽酸小檗堿含量相對較低，參考相關文獻[2,13]，采取鹽酸小檗堿優(yōu)先的原則，選擇265 nm作為檢測波長，在此波長下黃芩苷也有良好的紫外吸收，故選擇普適性較好的265 nm作為檢測波長。

3.3 供試品溶液制備方法

本實驗考察了不同濃度的甲醇、乙醇作為提取溶劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇提取效果較好；同時考察了回流、冷浸、超聲等提取方法，發(fā)現(xiàn)無明顯差異，因此選擇相對快捷簡單的超聲提取；考察超聲時間30，40，50，60，70 min進行，超聲40 min時以上提取結(jié)果無明顯差異，最終確定超聲時間為40 min。

3.4 含量分析

不同廠家雙黃消炎片指標成分含量存在較大差異，不同的生產(chǎn)工藝、藥材來源、儲存環(huán)境等均可能導致以上情況發(fā)生，提示生產(chǎn)企業(yè)應注意藥材的質(zhì)量控制；生產(chǎn)過程穩(wěn)定、儲存環(huán)境受控，提示監(jiān)管部門加強該品種的質(zhì)量監(jiān)管。

3.5 結(jié)論

本文建立了HPLC法同時檢測雙黃消炎片中鹽酸小檗堿和黃芩苷的含量，該方法基線穩(wěn)定，分離度理想，線性關系和重現(xiàn)性較好，能滿足檢測要求，為雙黃消炎片的質(zhì)量控制研究打下了基礎。