王 昱，白 潔，張志強，張隸濤，孫 菡*

（1. 秦皇島市藥品不良反應監(jiān)測中心，河北 秦皇島 066000；2. 河北省藥品醫(yī)療器械檢驗研究院，河北 石家莊 050000）

大黃蟄蟲片是由熟大黃、土鱉蟲、虻蟲、水蛭、白芍、黃芩、甘草等十二種藥味加工而成的中藥成方制劑，為漢代名醫(yī)張仲景所著《金匱要略血痹虛勞篇》中的經(jīng)典名方，具有活血破瘀，通經(jīng)消痞之功效，臨床上廣泛用于肝病、婦科疾病、心腦血管疾病等的治療，該品種質量標準收載于國家藥品標準 YBZ12252005-2012Z-3[1-4]，標準中僅收載了大黃中大黃素、大黃酚的含量測定方法。本次研究為了更高效地控制中藥成方制劑質量，采用高效液相法進行多指標同時測定方法研究[5-10]，以處方中白芍、黃芩、甘草的指標性成分為質控基礎，建立了同時測定3種成分含量的測定方法。該方法操作簡便，方法準確，為本品質量控制提供了更加全面有效的定量分析方法。

1 實驗材料

1.1 儀器

1260高效液相色譜儀[安捷倫科技（中國）有限公司]；Boston C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；AE240分析天平（Metler精密儀器分析公司，感量0.01 mg）；KQ -500KDE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司500W 40 kHz）。

1.2 試劑試藥

對照品：黃芩苷（批號110715-201318），甘草苷（批號111610-201106），芍藥苷（批號110736-201741）均由中國食品藥品檢定研究院提供。乙腈為色譜純，水為去離子水，其他試劑均為分析純。

樣品：大黃蟄蟲片，廣西玉林制藥集團有限責任公司提供，批號分別為：860003，860005，860007，860008，860009，860030，860032，860034，860036，860037。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Boston C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）。

流動相：以乙腈為流動相A；以 0.1 mol/L磷酸為流動相B；按表1中的規(guī)定進行梯度洗脫；柱溫：30 ℃。流速為1.0 ml/min；測定波長230 nm。理論塔板數(shù)：需按芍藥苷峰計算不得低于3000；各峰與相鄰峰的分離度均大于1.5。

表1 流動相梯度洗脫表

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液制備 分別取3種待測成分對照品約 10 mg，精密稱定，加甲醇分別制成每1 ml含芍藥苷、黃芩苷各200 μg，甘草苷100 μg溶液。各精密量取5 ml，置入20 ml量瓶，加甲醇稀釋至刻度搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液制備 取本品20片，稱定重量，研細，精密稱取1 g，精密加入70 %乙醇溶液25 ml，稱定重量，超聲處理30 min，用70 %乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 專屬性試驗

按標準中[處方]及[制法][2]項下制備白芍、黃芩、甘草陰性樣品，按上述2.2.2項下制備陰性樣品溶液。分別精密吸取芍藥苷、甘草苷、黃芩苷的混合對照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液各10 μl，按“2.1”項色譜條件測定。結果樣品色譜中，在與對照品色譜相應位置顯相同保留時間色譜峰，而陰性樣品色譜的相應位置無色譜峰，陰性不干擾測定。結果見圖1。

圖1 大黃蟄蟲片中芍藥苷、甘草苷、黃芩苷含量測定圖

2.4 精密度試驗

取混合對照品溶液，按“2.1”項色譜條件連續(xù)進樣5次，芍藥苷、甘草苷、黃芩苷峰面積RSD分別為0.5 %，0.9 %，0.6 %，結果表明，儀器精密度良好。

2.5 線性關系考察

精密量取“2.2.1”項下各對照品溶液適量，加甲醇配置成系列濃度對照品溶液，分別注入液相色譜儀，記錄所有的峰面積。以色譜峰面積為縱坐標，對進樣量（μg）為橫坐標繪制3種成分的標準曲線。結果表明，各待測成分線性關系良好，線性回歸方程見表2。

表2 線性回歸方程

2.6 重復性試驗

取大黃蟄蟲片樣品（批號：860032），精密稱取0.5，1.0，1.5 g各3份，共取9份，按 “2.2.2”項方法制備供試品溶液，按“2.1”項色譜條件測定，結果表明，芍藥苷、甘草苷、黃芩苷平均含量分別為0.815，0.123，1.212 mg/g；RSD分別為1.3 %，1.8 %，0.9 %，結果表明，本方法重復性良好。

2.7 準確度（回收率）試驗

采用高、中、低3個濃度對照品加于樣品中的回收測定法。取大黃蟄蟲片樣品（批號：860032，含量以重復性結果計）9份，每份0.5 g，精密稱定，分別精密加入高、中、低3個濃度對照品70 %乙醇溶液25 ml，每一種濃度測定3份，按照 “2.2.2”項方法制備供試品溶液，按“2.1”項色譜條件測定，結果表明，芍藥苷、甘草苷、黃芩苷平均回收率分別為99.7 %，97.6 %，97.9 %；RSD分別為1.9 %，1.4 %，1.3 %，結果表明，本方法準確度良好。

2.8 穩(wěn)定性實驗

取大黃蟄蟲片按“2.2.2”項方法制備供試品溶液，于0，3，6，15，20，24 h分別進樣10 μl，測定其芍藥苷、甘草苷、黃芩苷峰面積，芍藥苷、甘草苷及黃芩苷峰面積的RSD分別為1.1 %，1.2 %，1.7 % 。結果表明，供試品溶液24 h穩(wěn)定性良好，

2.9 樣品測定

取10批大黃蟄蟲片，按照“2.2.2”項方法制備供試品溶液，并按“2.1”項色譜條件測定，記錄峰面積結果，并根據(jù)外標法計算含量，測定結果見表3。

表3 樣品測定結果（n=3）

3 討論

3.1 流動相的選擇

由于該系統(tǒng)需要同時檢測的3種成分，無法用等度洗脫的方式，只能通過改變流動相中水相以及有機相的比例隨時間的變化規(guī)律，使3種成分達到分離。本實驗通過比較多種不同流動相及梯度洗脫程序下各成分的分離度及峰形，最終確定該流動相洗脫系統(tǒng)。

3.2 檢測波長的選擇

采用DAD 檢測器進行全波長掃描（200～500 nm），分析3種化合物的紫外光譜，并綜合考慮檢測時3個色譜峰的響應，及遇到各個影響因素，結果表明，3種化合物（芍藥苷、甘草苷及黃芩苷）在檢測波長為230 nm 時，分離成分的效果良好。最終選擇230 nm 為本實驗的檢測波長。

3.3 耐用性實驗

為使本方法在應用中能不受設備、色譜柱及其他條件變化的限制，研究中在多條件下進行了驗證試驗。驗證使用Boston C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；資生堂C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；Acclaim 120A（4.6 mm×250 mm，5 μm）C18色譜柱；安捷倫1260、島津20AT、Waters2695高效液相色譜儀及柱溫、流動相pH、流動相比例微小變化項的耐用性考察。結果表明，芍藥苷、甘草苷、黃芩苷的定性重復性與定量重復性偏差RSD均在2 %以內，各條件下色譜峰均分離效果較好，測定最終的結果基本保持了一致，表明方法耐用性較好。