陳進(jìn)芳，翁育才

（海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院藥學(xué)部，海南 海口 570311）

丁細(xì)牙痛膠囊是由丁香葉和細(xì)辛2味藥材組成，具有清熱解毒，疏風(fēng)止痛的功效，臨床用于風(fēng)火牙疼，牙齦腫脹，急性牙髓炎及急性根尖周炎的治療[1]。作為國內(nèi)首創(chuàng)根治牙病的國家三類新中藥，現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)含量控制僅采用專屬性較差的紫外分光光度法測定丁香葉中原兒茶酸的含量[2]?，F(xiàn)有藥理研究發(fā)現(xiàn)，丁細(xì)牙痛膠囊發(fā)揮抗菌、抗炎、鎮(zhèn)痛和中樞抑制作用的活性成分主要是揮發(fā)性成分[3-4]。查閱文獻(xiàn)雖已有報(bào)道[5-6]采用氣相色譜法（GC）測定丁細(xì)牙痛膠囊中甲基丁香酚和丁香酚的含量，但這些研究只針對(duì)一種活性揮發(fā)性成分的質(zhì)量控制，難以全面整體評(píng)價(jià)丁細(xì)牙痛膠囊的質(zhì)量特性[7]。鑒于此，為全面監(jiān)測丁細(xì)牙痛膠囊的質(zhì)量及保障其臨床有效性，筆者選取方中揮發(fā)性成分為研究對(duì)象，同時(shí)測定丁香葉和細(xì)辛中丁香酚、甲基丁香酚、黃樟醚及異丁香酚4種揮發(fā)性成分的含量，為該品種質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升提供參考。

1 儀器和試藥

GC-2010 Plus型氣相色譜儀（日本Shimadzu公司，包括2010 Plus型氫火焰離子檢測器，WBI-2010 Plus型進(jìn)樣口，AOC-201+S型自動(dòng)進(jìn)樣器，Lab Solutions 5.87 色譜工作站）；梅特勒-托利多MS105DU/A型電子天平（d=0.01 mg，瑞士梅特勒公司）；UPT-I-10T型優(yōu)普系列超純水機(jī)（成都超純科技有限公司）；KQ-500DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山超聲波儀器有限公司，功率500 W，頻率50 kHz）。

丁香酚對(duì)照品（批號(hào)：110725-201917，含量以99.1 %計(jì)），甲基丁香酚對(duì)照品（批號(hào)：111642-200301，含量以100.0 %計(jì)）購自中國食品藥品檢定研究院；異丁香酚對(duì)照品（批號(hào)：Y-147-190426，純度：≥98.00 %），黃樟醚對(duì)照品（批號(hào)：Y-226-1806176，純度：≥98.00 %）購自成都瑞芬思生物科技有限公司；乙酸乙酯為色譜純；水為超純水；其他試劑均為分析純。

市售丁細(xì)牙痛膠囊4批，規(guī)格：0.45 g/粒，購自深圳市泰康制藥有限公司（批號(hào)：20190619，20190923，20191107，20200409）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[8-10]

色譜柱：HP-1301毛細(xì)管柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）；程序升溫：初始溫度120 ℃，以6 ℃/min升溫至180 ℃，保持1 min，以10 ℃/min升溫至 250 ℃，保持12 min；檢測器：氫火焰離子檢測器（FID）；檢測器溫度：260 ℃；進(jìn)樣口溫度：200 ℃；載氣：高純氮?dú)猓兌龋?9.999 %）；流速：2 ml/min；進(jìn)樣量：1 μl；進(jìn)樣分流比：40:1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 分別取丁香酚、甲基丁香酚、黃樟醚及異丁香酚對(duì)照品各適量，精密稱定，加正己烷制成每1 ml分別含丁香酚、甲基丁香酚、黃樟醚及異丁香酚3.857，1.794，0.8591，1.006 mg的混合對(duì)照品溶液。冰箱冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 供試品溶液 取丁細(xì)牙痛膠囊10粒，傾出內(nèi)容物，研勻，取約1.0 g，精密稱定，置入具塞錐形瓶，精密加入正己烷50 ml，密塞，稱定重量，浸漬過夜后置入冰浴中超聲處理（400 W，40 kHz）40 min，再稱重并用正己烷補(bǔ)足減失的重量，搖勻，離心，精密量取上清10 ml，減壓濃縮至約0.5 ml，用正己烷轉(zhuǎn)移至2 ml量瓶，加正己烷至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液 丁細(xì)牙痛膠囊處方分別去除丁香葉、細(xì)辛后，按處方比例及制備工藝制得陰性對(duì)照，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

分別取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，詳見圖1。由圖1可知，4種化學(xué)成分均能達(dá)到基線分離，理論板數(shù)均大于5500，分離度均大于1.5。

圖 1 氣相色譜圖

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 ml置入25 ml棕色量瓶中，加正己烷稀釋至刻度，搖勻，得系列混合對(duì)照品溶液，精密吸取上述系列混合對(duì)照品溶液按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，記錄色譜圖。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x，μg/ml），峰面積為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性回歸，繪制各組分標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù)，見表1。結(jié)果表明：丁香酚、甲基丁香酚、黃樟醚及異丁香酚在其對(duì)應(yīng)的濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系；將對(duì)照品溶液逐級(jí)稀釋后，以信噪比（S/N）約為3.0 時(shí)的濃度為各成分的檢測限（LOD）。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果（n=6）

2.5 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液1 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定5次，記錄峰面積。結(jié)果丁香酚、甲基丁香酚、黃樟醚及異丁香酚峰面積的RSD分別為 0.59 %，0.82 %，0.65 %，0.47 %（n=5），表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液（批號(hào)：20191107），分別于制備后在室溫下放置0，4，8，12，18，24 h，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果丁香酚、甲基丁香酚、黃樟醚及異丁香酚峰面積的RSD分別為0.74 %，0.82 %，0.69 %，0.91 %（n=6），表明供試品溶液在室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取丁細(xì)牙痛膠囊（批號(hào)：20191107）6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果丁香酚、甲基丁香酚、黃樟醚及異丁香酚的平均含量分別為5.362，2.817，1.533，0.9406 mg/g，RSD分別0.77 %，0.95 %，0.89 %，1.01 %（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的丁細(xì)牙痛膠囊（批號(hào)：20191107）6份，每份約0.5 g，精密稱定，分別置入具塞錐形瓶中，精密加入丁香酚、甲基丁香酚、黃樟醚及異丁香酚混合對(duì)照品溶液（濃度分別為3.857，1.794，0.8591，1.006 mg/ml）0.75 ml，按“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液方法制備，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，計(jì)算丁香酚、甲基丁香酚、黃樟醚及異丁香酚的平均加樣回收率分別為99.87 %，99.12 %，98.84 %，98.80 %，RSD分別為0.61 %，0.65 %，0.35 %，0.96 %（n=6），表明該方法準(zhǔn)確可靠（見表2）。

表2 四個(gè)成分的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.9 耐用性試驗(yàn)

取丁細(xì)牙痛膠囊（批號(hào)：20191107）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液方法制備，分別設(shè)置不同品牌毛細(xì)管柱、進(jìn)樣口溫度、檢測器溫度、流速參數(shù)，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品含量，結(jié)果見表3。由表3可見，不同品牌、不同柱內(nèi)徑、不同膜厚度的色譜柱，不同進(jìn)樣口溫度，不同檢測器溫度，不同流速對(duì)含量測定結(jié)果影響較小，表示本方法耐用性良好。

表3 耐用性試驗(yàn)結(jié)果

2.10 樣品測定

分別取不同批次丁細(xì)牙痛膠囊，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄丁香酚、甲基丁香酚、黃樟醚及異丁香酚的峰面積，代入“2.4”項(xiàng)下回歸方程計(jì)算丁細(xì)牙痛膠囊中上述4種成分含量。結(jié)果見表4。

表4 各成分含有量測定結(jié)果/mg·g-1（n=3）

3 討論

3.1 測定成分的選擇

丁細(xì)牙痛膠囊中的丁香葉和細(xì)辛均含有揮發(fā)性成分，首載于《新華本草綱要》的丁香葉，作為該方的君藥，未載入藥典，主要來源于木犀科丁香屬植物紫丁香、朝鮮丁香或洋丁香的干燥葉，含有大量的揮發(fā)油、黃酮類、環(huán)烯醚萜類及苷類等成分，有較強(qiáng)的抗菌消炎及清除自由基功效，主要用于治療消化系統(tǒng)疾病及口腔護(hù)理[11-12]，其中揮發(fā)油類成分包括主要有抗菌、解熱、促進(jìn)透皮吸收等多種藥理活性的丁香酚，有鎮(zhèn)痛抗炎、抗氧化損傷等藥理活性的甲基丁香酚和異丁香酚[13-14]。臨床常用于治療風(fēng)寒頭痛、牙痛等癥的細(xì)辛，主要活性部位為揮發(fā)油，黃樟醚和甲基丁香酚是細(xì)辛中含量最高的成分, 具有顯著的鎮(zhèn)痛、抗炎等作用[15-16]。故筆者選擇對(duì)丁香酚、甲基丁香酚、黃樟醚及異丁香酚4種揮發(fā)性成分進(jìn)行含量測定。

3.2 提取工藝的選擇

在制備供試品溶液時(shí)，本實(shí)驗(yàn)考察了提取方法（超聲、振搖、揮發(fā)油提?。?、提取溶劑種類（乙酸乙酯、正己烷、甲醇）、提取時(shí)間（30，40，50 min）、超聲功率（300，400，500 W）及超聲溫度（冰浴、室溫），結(jié)果表明，在以正己烷浸漬過夜后置入冰浴中超聲處理的方法，操作簡便，4種揮發(fā)法性成分化學(xué)結(jié)構(gòu)不會(huì)被破壞，提取率最高，雜質(zhì)峰干擾較少；超聲功率400 W或 500 W、提取時(shí)間40 min 或 50 min 時(shí)，丁香酚、甲基丁香酚、黃樟醚及異丁香酚各揮發(fā)性成分含有量均無明顯差異。為簡化操作，最終確定為“2.2.2”項(xiàng)下方法。

3.3 含量測定結(jié)果分析

本研究中4批丁細(xì)牙痛膠囊中均檢測丁香酚、甲基丁香酚、黃樟醚及異丁香酚4個(gè)揮發(fā)性成分，且丁香酚、黃樟醚及異丁香酚的含量測定結(jié)果互相接近，但甲基丁香酚的含量測定結(jié)果有差異；由于方中丁香葉和細(xì)辛2味藥材中均含有甲基丁香酚成分，批間差異可能與廠家每次投料時(shí)藥材質(zhì)量有關(guān)。

綜上，本研究建立了同時(shí)測定丁細(xì)牙痛膠囊中丁香酚、甲基丁香酚、黃樟醚及異丁香酚4種揮發(fā)性成分含量的方法，通過線性范圍、精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、回收率、耐用性的系統(tǒng)性試驗(yàn)考察，證明該方法快速、重復(fù)性好、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可更全面地保證藥品的內(nèi)在質(zhì)量，為進(jìn)一步提高丁細(xì)牙痛膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)奠定基礎(chǔ)。