張秀花，劉艷平

（菏澤市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，山東 菏澤 274032）

云南白藥膠囊收載于《中華人民共和國藥典》（以下簡(jiǎn)稱：《中國藥典》）2020年版一部[1]，國家絕密配方，一類中藥保護(hù)品種，具有化瘀止血，活血止痛、解毒消腫的功效，臨床應(yīng)用非常廣泛[2-6]，目前尚無微生物限度檢查方法的報(bào)道。本試驗(yàn)在查閱近年來中和法非無菌制劑微生物限度檢查方法研究的基礎(chǔ)上[7-12]，參照企業(yè)提供的相關(guān)資料，采用3批樣品進(jìn)行微生物限度檢查方法適用性試驗(yàn)，建立了適用于云南白藥膠囊微生物限度檢查的中和法。

1 儀器與材料

1.1 樣品

云南白藥膠囊，云南白藥集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)ZLB1907，ZDA2012，ZHA1904。

1.2 培養(yǎng)基

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA），批號(hào)200709；胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB），批號(hào)200224；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA），批號(hào)200316；沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（SDB），批號(hào)200406；腸道菌增菌液體培養(yǎng)基（EE），批號(hào)180222；均由北京陸橋技術(shù)股份有限公司提供，培養(yǎng)基適用性檢查結(jié)果符合《中國藥典》2020年版四部規(guī)定。

1.3 菌種

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC(B)26 003]、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC(B)10 104]、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)[CMCC(B)63 501]、黑曲霉(Aspergillus niger)[CMCC(F)98 003]、白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)98 001]、大腸埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B)44 102]、乙型副傷寒沙門菌（Salmonella paratyphi B）[CMCC(B)50 094]，均由中國食品藥品檢定研究院提供，經(jīng)鑒定合格，試驗(yàn)所用菌種均為第三代。

1.4 儀器

電子天平（JE1201，上海浦春計(jì)量?jī)x器有限公司）、脈動(dòng)真空滅菌器（XG1.U，山東新華醫(yī)療器械股份有限公司）、生物安全柜（BSC-1300ⅡA2，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）、細(xì)菌培養(yǎng)箱（KB240，德國BINDER）、霉菌培養(yǎng)箱（MJ-250BSH-Ⅲ，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）。

1.5 試劑

中和劑：聚山梨酯80（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20190821）；稀釋液：pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（北京陸橋技術(shù)股份有限公司，批號(hào)：190206）。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液制備

將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門菌分別接種于TSB中，30～35 ℃培養(yǎng) 18～24 h；白色念珠菌接種于SDB中，20～25 ℃培養(yǎng) 2～3 d；黑曲霉接種于SDA中 20～25 ℃，培養(yǎng) 5～7 d。

取上述新鮮培養(yǎng)物用 pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液洗脫、稀釋，制成5000～10 000 cfu/ml菌懸液。取黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物加入 3～5 ml含 0.05 %（v/v）聚山梨酯 80 的 pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，將孢子洗脫。吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用 含 0.05 %（v/v）聚山梨酯 80的 pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋，制成5000～10000 cfu/ml菌懸液。

2.2 樣品前處理

取樣品3批，每批4個(gè)獨(dú)立包裝，打開外包裝，將內(nèi)包裝置于生物安全柜內(nèi)。開啟生物安全柜及高效過濾器，當(dāng)潔凈度符合要求時(shí)[13]，以無菌操作的方式，取出膠囊及保險(xiǎn)子，混勻，備用。

2.3 供試液制備

2.3.1 常規(guī)法 取“2.2”項(xiàng)下供試品10 g（至少含1粒保險(xiǎn)子），加TSB 100 ml，待囊殼、內(nèi)容物及保險(xiǎn)子全部溶解后，混勻，制成1:10供試液。取1:10供試液5 ml至5 ml TSB中，制成1:20供試液，依法制成1:50供試液。

2.3.2 中和法 取“2.2”項(xiàng)下供試品10 g（至少含1粒保險(xiǎn)子），加含5 %聚山梨酯80的TSB 100 ml，待囊殼、內(nèi)容物及保險(xiǎn)子全部溶解后，混勻，制成1:10供試液。取1:10供試液5 ml至含5 %聚山梨酯80的5 ml TSB中，制成1:20的供試液，依法制成1:50供試液。

2.4 微生物計(jì)數(shù)法

2.4.1 常規(guī)法 取“2.1”項(xiàng)下菌液0.1 ml，至9.9 ml“2.3.1”項(xiàng)下1:10供試液中，混勻，作為試驗(yàn)組；取TSB 0.1 ml，至9.9 ml“2.3.1”項(xiàng)下1:10供試液中，作為供試品對(duì)照組；取“2.1”項(xiàng)下菌液0.1 ml，至9.9 ml TSB中，作為菌液對(duì)照組；以上每組各取1 ml注入平皿中，照《中國藥典》2020年版四部通則1105[14]，加入15～20 ml對(duì)應(yīng)的TSA或SDA培養(yǎng)基，每種菌液平行制備2個(gè)平皿，測(cè)定菌液中的菌落數(shù)，計(jì)算各試驗(yàn)菌回收比值。

2.4.2 稀釋法 取“2.1”項(xiàng)下菌液0.1 ml，至9.9 ml“2.3.1”項(xiàng)下1:20供試液中，混勻，作為試驗(yàn)組；取“2.1”項(xiàng)下菌液0.1 ml，至9.9 ml“2.3.1”項(xiàng)的1:50供試液中，混勻，作為試驗(yàn)組；取“2.1”項(xiàng)下菌液0.1 ml，至9.9 ml TSB中，作為菌液對(duì)照組，依法操作，計(jì)算各試驗(yàn)菌回收比值。

2.4.3 中和法 取“2.1”項(xiàng)下菌液0.1 ml，至9.9 ml“2.3.2”項(xiàng)下1:10供試液中，混勻，作為試驗(yàn)組；取“2.1”項(xiàng)下菌液0.1 ml，至9.9 ml“2.3.2”項(xiàng)1:20供試液中，混勻，作為試驗(yàn)組；取“2.1”項(xiàng)下菌液0.1 ml，至9.9 ml“2.3.2”項(xiàng)的1:50供試液中，混勻，作為試驗(yàn)組；取“2.1”項(xiàng)下菌液0.1 ml，至9.9 ml TSB中，作為菌液對(duì)照組，依法操作，計(jì)算各試驗(yàn)菌回收比值。

2.5 回收比值計(jì)算

采用平皿法或薄膜過濾法。

試驗(yàn)組回收比值=（試驗(yàn)組菌落數(shù)-供試品對(duì)照組菌落數(shù)）/菌液對(duì)照組菌落數(shù)，中和劑回收比值=（中和劑對(duì)照組菌落數(shù)-供試品對(duì)照組菌落數(shù)）/菌液對(duì)照組菌落數(shù)[15]。

2.6 結(jié)果判斷

方法適用性試驗(yàn)中，若采用平皿法或薄膜過濾法時(shí)，方法適用性試驗(yàn)各試驗(yàn)菌回收比值應(yīng)在0.5～2范圍內(nèi)，若在稀釋液或培養(yǎng)基中加入中和劑或滅活劑，中和劑或滅活劑對(duì)照組回收比值應(yīng)在0.5～2范圍內(nèi)[16]。

2.7 微生物計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)

2.7.1 常規(guī)法 按“2.3.1”項(xiàng)下，常規(guī)法測(cè)定3批樣品5種菌株回收比值，平皿法計(jì)數(shù)結(jié)果見表1。

由表1可見，3批樣品5種菌株回收比值均未完全在0.5～2范圍內(nèi)，其中，白色念珠菌在TSA和SDA中回收比值均為0，黑曲霉在TSA中回收比值為0。

表1 云南白藥膠囊微生物限度檢查方法適用性回收比值（常規(guī)法，n=3）

2.7.2 稀釋法 選取“2.7.1”項(xiàng)下敏感菌株，按“2.4.2”項(xiàng)下，采用1:20，1:50供試液進(jìn)行檢查，平皿計(jì)數(shù)法結(jié)果見表2。

表2 云南白藥膠囊微生物限度檢查敏感菌回收比值（稀釋法，n=3）

由表2可見，稀釋倍數(shù)為1:50時(shí)，白色念珠菌在TSA和SDA中的回收比值均為0。稀釋倍數(shù)為1:20時(shí)，黑曲霉在TSA中回收比值小于0.5；稀釋倍數(shù)為1:50時(shí)，黑曲霉在TSA中回收比值在0.5～2范圍內(nèi)。

2.7.3 中和法初篩試驗(yàn) 選取“2.7.1”項(xiàng)下敏感菌株，“2.3.2”項(xiàng)下供試液，按“2.4.3”項(xiàng)下中和法進(jìn)行試驗(yàn)，平皿計(jì)數(shù)法結(jié)果見表3。

表3 云南白藥膠囊微生物限度檢查初篩試驗(yàn)回收比值（中和法，n=3）

由表3可見，稀釋倍數(shù)為1:10，1:20時(shí)，黑曲霉在TSA中的回收比值均在0.5～2范圍內(nèi)；稀釋倍數(shù)為1:20時(shí)，白色念珠菌在TSA和SDA中的回收比值均在0.5～2范圍內(nèi)。

2.7.4 中和法 取“2.3.2”項(xiàng)下1:20供試液，按“2.4.3”項(xiàng)下中和法進(jìn)行試驗(yàn)，平皿計(jì)數(shù)法結(jié)果見表4。

由表4可見，稀釋倍數(shù)為1:20時(shí)，各試驗(yàn)菌回收比值均在0.5 ～2范圍內(nèi)；中和劑各試驗(yàn)菌回收比值均在0.5 ～2范圍內(nèi)。

表4 云南白藥膠囊微生物限度檢查方法適用性回收比值（中和法，n=3）

2.8 控制菌檢查

2.8.1 試驗(yàn)分組

2.8.1.1 耐膽鹽革蘭陰性菌 取“2.3.2”項(xiàng)下1:10供試液3組，每組1 ml，分別接種至10 ml EE中，一組作為供試品組，另兩組分別加入不大于100 cfu的大腸埃希菌和銅綠假單胞菌，作為陽性對(duì)照組。

2.8.1.2 大腸埃希菌 取“2.3.2”項(xiàng)下1:10供試液兩組，每組10 ml，一組接種至100 ml TSB中，作為供試品組，另一組加入不大于100 cfu的大腸埃希菌，作為陽性對(duì)照組。

2.8.1.3 沙門菌 取“2.2”項(xiàng)下供試品兩組,每組10 g（至少含1粒保險(xiǎn)子），分別接種至100 ml含5 %聚山梨酯80的TSB中，一組作為供試品組，另一組加入不大于100 cfu的乙型副傷寒沙門菌，作為陽性對(duì)照組。

2.8.1.4 金黃色葡萄球菌 取“2.3.2”項(xiàng)下1:10供試液兩組，每組10 ml，分別接種至100 ml TSB中，一組作為供試品組，另一組加入不大于100 cfu的金黃色葡萄球菌，作為陽性對(duì)照組。

2.8.1.5 銅綠假單胞菌 取“2.3.2”項(xiàng)下1:10供試液兩組，每組10 ml，分別接種至100 ml TSB中，一組作為供試品組，另一組加入不大于100 cfu的銅綠假單胞菌，作為陽性對(duì)照組。

2.8.2 控制菌檢查結(jié)果 取“2.8.1”項(xiàng)下各組控制菌，照《中國藥典》2020年版四部通則1106[17]依法檢查，同時(shí)以稀釋液代替供試液，其他同供試品組，作為陰性對(duì)照組，控制菌檢查結(jié)果見表5。

由表5可見，中和法3批樣品5種控制菌檢查，陽性對(duì)照組均檢出陽性菌，陰性對(duì)照組均無菌落生長，試驗(yàn)結(jié)果成立。結(jié)果表明，聚山梨酯80可消除藥物抑菌性，中和法可用于云南白藥膠囊控制菌檢查。

3 討論

微生物限度檢查是藥品安全性的重要指標(biāo)，微生物實(shí)驗(yàn)的各項(xiàng)工作應(yīng)在專屬的區(qū)域進(jìn)行，以降低交叉污染、假陽性結(jié)果和假陰性結(jié)果出現(xiàn)的風(fēng)險(xiǎn)。微生物限度檢查應(yīng)在不低于D級(jí)背景下的生物安全柜或B級(jí)潔凈區(qū)域內(nèi)進(jìn)行[13]。本試驗(yàn)在D級(jí)背景下的生物安全柜內(nèi)進(jìn)行，避免了二次污染的風(fēng)險(xiǎn)，確保了檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性、可靠性。

方法適用性試驗(yàn)的本質(zhì)是建立對(duì)樣品影響更小、操作率更高的方法[18]，但其本身工作量大，且存在不同實(shí)驗(yàn)室方法欠佳、重復(fù)勞動(dòng)過多的問題[19]，去除藥物抑菌性是其中的重點(diǎn)和難點(diǎn)[20]，因此同一品種建立統(tǒng)一合理有效的方法適用性試驗(yàn)尤其重要。

由表1、表2可見，云南白藥膠囊對(duì)白色念珠菌的抑菌性非常強(qiáng)，稀釋倍數(shù)為1:50時(shí)回收比值仍為0，不適于繼續(xù)采用稀釋法。薄膜過濾法一般適用于抑菌性較強(qiáng)的樣品，對(duì)于抑菌性非常強(qiáng)的樣品，沖洗量太大，微生物易受損傷。為避免濾膜上微生物受損傷，降低微生物二次污染風(fēng)險(xiǎn)，建議采用中和法。

中和法由于稀釋液和培養(yǎng)基中分別加入適宜濃度的中和劑[21-23]，使樣品在稀釋或培養(yǎng)過程中抑菌性能得以徹底消除，適用于抑菌性強(qiáng)，稀釋法、薄膜過濾法無法滿足試驗(yàn)要求的樣品的微生物限度檢查。

中和法為《中國藥典》2020年版四部通則收載的消除供試品抑菌活性的方法之一。聚山梨酯80為常用的中和劑，可用于鈍化、中和供試品的抑菌活性，最好在稀釋液或培養(yǎng)基滅菌前加入[24]?！吨袊幍洹?020年版四部通則9202非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查指導(dǎo)原則中要求，如使用表面活性劑、滅活劑及中和劑，在確定其能否用于所檢樣品用量時(shí)，除應(yīng)證明該試劑對(duì)所檢樣品的處理有效外，還需證明該試劑不影響樣品中可能污染的微生物的檢出（即無毒性）[25]。本試驗(yàn)在稀釋液和培養(yǎng)基中分別加入了中和劑，中和劑各試驗(yàn)菌回收比值均在0.5 ～2范圍內(nèi)，確認(rèn)中和劑有效和對(duì)微生物無毒性。該中和劑的加入，不影響微生物限度污染指示菌的檢出。

云南白藥膠囊為非無菌含藥材原粉的中藥制劑，按照《中國藥典》四部通則1107的要求，耐膽鹽革蘭陰性菌應(yīng)小于102cfu/g。本試驗(yàn)直接采用1:10供試液進(jìn)行定性試驗(yàn)，當(dāng)1:10供試液陽性對(duì)照組檢出陽性菌時(shí)，表明該中和法可徹底消除該供試液中樣品的抑菌性，隨著稀釋倍數(shù)的增加，樣品的抑菌活性越來越弱，完全可以保障定量試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。該方法操作簡(jiǎn)單，工作效率高，適用于控制菌檢查方法適用性試驗(yàn)初篩。

研究表明，云南白藥膠囊為抑菌性較強(qiáng)的中藥制劑，5 %聚山梨酯80可徹底消除藥物的抑菌性，適用于云南白藥膠囊微生物限度檢查。