陳李東 ，朱日然，張學(xué)順，劉曉倩*

（1. 山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250014；2. 老河口市疾病預(yù)防控制中心，湖北 襄陽(yáng) 441800）

補(bǔ)骨脂，是豆科草本植物補(bǔ)骨脂（Psoralea corylifolia L.）的干燥成熟果實(shí)，性溫、味辛，歸腎、脾經(jīng)，有補(bǔ)腎固精、縮尿止帶、溫脾止瀉、固沖安胎之功效[1]。臨床廣泛用于陽(yáng)萎遺精、腎虛冷瀉、腰膝冷痛、遺尿尿頻、白癜風(fēng)等。近年報(bào)道補(bǔ)骨脂還有抗氧化、抗菌、抗骨質(zhì)疏松、抗腫瘤等作用[2]。

據(jù)《雷公炮炙論》記載，補(bǔ)骨脂“性本大燥，毒”[3]，其久服有毒副作用，入藥前需經(jīng)過(guò)炮制，降低其毒性。補(bǔ)骨脂炮制方法較多，主要有鹽炙法、雷公法、清炒法、鹽酒浸法、酒浸法、芝麻炒、蒸法等[4]。 其中《中國(guó)藥典》（2015年版）記錄的鹽炙法為目前常用的炮制方法[5]，但相關(guān)研究表明，該法并不是補(bǔ)骨脂的最佳炮制方法[6]。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)選用15種有代表性的炮制方法，分為3大類：含酒制法類、含鹽制法類、其它制法類。采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定各炮制品炮制前后有效成分（補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素）和有毒性成分（補(bǔ)骨脂酚，具有肝腎毒性[7-8]）的變化，分析各炮制品中主要成分及其含量，進(jìn)而選出最佳炮制方法，為臨床應(yīng)用提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

安捷倫1260分析型高效液相色譜儀；AB135-S型電子天平；超聲波提取器（昆山市超聲儀器公司）。

1.2 試藥

補(bǔ)骨脂藥材（批號(hào)：1804002，安國(guó)市任德興藥材有限公司）；異補(bǔ)骨脂素對(duì)照品（批號(hào)：R01A6F1，上海源葉公司）；補(bǔ)骨脂素對(duì)照品（批號(hào)：YJ07315A14，上海源葉公司）；補(bǔ)骨脂酚對(duì)照品（批號(hào)：YM0316SB13，上海源葉公司）；乙腈為色譜純；甲醇為分析純；紹興黃酒（浙江塔牌公司）；水（娃哈哈純凈水）；黑芝麻和面粉（購(gòu)于大潤(rùn)發(fā)超市）；食鹽（山東鹽業(yè)集團(tuán)）；麩子（山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院）。

2 方法與結(jié)果

2.1 制備樣品

2.1.1 含鹽制法類

2.1.1.1 藥典品 100 g補(bǔ)骨脂藥材，加20 ml鹽水（含鹽2 g）悶潤(rùn)4 h，濾過(guò)，藥材入炒鍋，文火炒至膨脹，崩裂，放涼即得。

2.1.1.2 鹽同炒品 50 g鹽置于炒鍋，炒至泛黃，加入100 g補(bǔ)骨脂藥材，翻炒至藥材崩裂或膨脹，除去鹽，放涼即得。

2.1.1.3 鹽水浸品 100 g補(bǔ)骨脂藥材，加20 ml鹽水（含鹽2 g）浸泡24 h，曬干，藥材入炒鍋，文火炒至膨脹，崩裂，放涼即得。

2.1.1.4 鹽水煮品 100 g補(bǔ)骨脂藥材，加100 ml鹽水（含鹽2 g）浸泡24 h，濾過(guò)，藥材置入裝有1500 ml鹽水（含鹽2 g）的容器，武火加熱煮沸，改文火煮1.5 h，晾干即得。

2.1.1.5 鹽蒸炙品 100 g補(bǔ)骨脂藥材，加100 ml鹽水（含鹽2 g）浸泡24 h，濾過(guò)，藥材置入裝有2000 ml鹽水（含鹽2 g）的蒸制容器，密閉蒸2 h，晾干即得。

2.1.2 含酒制法類

2.1.2.1 雷公制品 100 g補(bǔ)骨脂藥材，加3倍量炮制用黃酒浸泡12 h，濾過(guò)，再加3倍量水浸泡72 h，濾過(guò)，蒸6 h，晾干即得。

2.1.2.2 酒浸炒品 100 g補(bǔ)骨脂藥材，加3倍量炮制用黃酒浸泡24 h，濾過(guò)，藥材入炒鍋，文火炒至膨脹，崩裂，放涼即得。

2.1.2.3 酒焙品 100 g補(bǔ)骨脂藥材，加50 ml炮制用黃酒悶潤(rùn)12 h，置于80 ℃烘箱，烘干，放涼即得。

2.1.2.4 鹽酒浸炒品 100 g補(bǔ)骨脂藥材，加3倍量炮制用黃酒（內(nèi)溶2 g鹽），拌勻，浸泡5 h，濾過(guò)，藥材入炒鍋，文火炒至膨脹，崩裂，放涼即得。

2.1.3 其他制法類

2.1.3.1 清炒品 100 g補(bǔ)骨脂藥材入炒鍋，文火炒至膨脹，崩裂，放涼即得。

2.1.3.2 芝麻焙品 100 g補(bǔ)骨脂藥材，加3倍量炮制用黃酒（內(nèi)溶2 g鹽）浸泡24 h，過(guò)濾，加入100 g芝麻并與藥材拌勻，置于80 ℃烘箱中烘干，去除黑芝麻，放涼即得。

2.1.3.3 芝麻炒品 100 g黑芝麻于炒鍋內(nèi)，翻炒至香氣溢出，加入100 g補(bǔ)骨脂藥材，繼續(xù)翻炒至藥材表面呈黑褐色或黑色，去除黑芝麻，放涼即得。

2.1.3.4 麩炒品 15 g麩皮于炒鍋內(nèi)，翻炒至起煙，加入100 g補(bǔ)骨脂藥材，繼續(xù)翻炒至藥材表面呈黑色或黃褐色，去除麩皮，放涼即得。

2.1.3.5 面炒品 50 g面粉于炒鍋內(nèi)，翻炒至微黃色，加入100 g補(bǔ)骨脂藥材，繼續(xù)翻炒至藥材表面呈白黑色或黃白色，去除面粉，放涼即得。

2.1.3.6 酒麩炒品 100 g補(bǔ)骨脂藥材，加3倍量炮制用黃酒浸泡12 h，濾過(guò)，藥材中加入麩皮并拌勻，置入炒鍋中，翻炒至藥材鼓起，表面呈焦黑色，去除麩皮，放涼即得。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 色譜條件 Agilent C18色譜柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；以乙腈（A）-水（B）為流動(dòng)相， 梯度洗脫，程序?yàn)椋?～8 min，20 %～40 % A；8～18 min，40 %～70 % A；18～21 min，70 %～85 % A；21～30 min，85 % A；30～32 min，20 % A；流速0.8 ml/min；進(jìn)樣量5 μl；柱溫35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm。

2.2.2 制備對(duì)照品溶液 分別精密稱取3種對(duì)照品0.82，0.78，1.96 mg，甲醇溶解并定容于50 ml棕色量瓶，制得混合對(duì)照品溶液，補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂酚對(duì)照品濃度分別為16.4，15.6，39.2 μg/ml。

2.2.3 制備供試品溶液 分別取各炮制品和生品適量，粉碎后過(guò)60目篩，精密稱取各粉末1.0 g，置入索氏提取器，加適量甲醇，加熱回流法提取2 h，冷卻后轉(zhuǎn)移至250 ml量瓶，加甲醇定容，充分搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得供試品溶液。

2.2.4 線性關(guān)系考察 采用“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，精密吸取混合對(duì)照品溶液2，5，8，12，18，30 μl，注入高效液相色譜儀測(cè)定，測(cè)得峰面積，以進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)、峰面積值（Y）為縱坐標(biāo)，分別建立3種對(duì)照樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程是：補(bǔ)骨脂素Y=6569.1X-3.8357（R2=0.9999），異補(bǔ)骨脂素Y=7712X-4.3324（R2=1），補(bǔ)骨脂酚Y=18884X+3.2053（R2=1）。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出，補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素和補(bǔ)骨脂酚進(jìn)樣量范圍分別為0.033～0.492 μg，0.031～0.468 μg，0.078～1.176 μg時(shí)呈良好線性關(guān)系。

2.2.5 精密度實(shí)驗(yàn) 采用“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，精密吸取混合對(duì)照品溶液5 μl，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄混合對(duì)照品中補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂酚峰面積的RSD分別為0.80 %，0.75 %，0.31 %，表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 采用“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，取“2.2.3”項(xiàng)下各供試品溶液5 μl，分別于0，2，4，6，12，24 h進(jìn)樣檢測(cè)，記錄各共有色譜峰峰面積的RSD均小于2.12 %，表明供試品在24 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 采用“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，取“2.2.3”項(xiàng)下生品供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定5次，記錄各共有色譜峰峰面積的RSD均小于1.93 %，表明此法具有良好的重復(fù)性。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱定含有量已知的藥材粉末6份，每份約0.5 g，精密加入各對(duì)照品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)得各成分加樣回收率分別在99.34 %～102.17 %，RSD為0.66 %～0.83 %，表明此法穩(wěn)定可行。

2.3 樣品測(cè)定

采用“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，測(cè)定“2.2.3”項(xiàng)下各供試品溶液，記錄各供試品的HPLC色譜圖，見(jiàn)圖1。

圖1 各樣品的色譜圖

2.3.1 含鹽制法類炮制品與生品HPLC色譜圖比較結(jié)果 根據(jù)特征峰峰面積變化情況，對(duì)不同含鹽制法類炮制品中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素升高幅度之和變化情況進(jìn)行排名：鹽蒸品>鹽水浸品>藥典品>鹽同炒品，鹽水煮品中二者含量降低。按照補(bǔ)骨脂酚下降幅度進(jìn)行排名：鹽水煮品>鹽蒸品>鹽同炒品>藥典品>鹽水浸品。結(jié)合中藥炮制增效減毒的目的，選擇鹽蒸法作為含鹽制法類的最佳炮制方法。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 鹽制法類炮制品共有特征峰峰面積及變化情況/%

2.3.2 含酒制法類炮制品與生品HPLC色譜圖比較結(jié)果 根據(jù)特征峰峰面積變化情況，對(duì)不同含酒制法類炮制品中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素升高幅度之和變化情況進(jìn)行排名：酒焙品>雷公品>酒浸品>鹽酒浸品；有效成分含量均提高。按照補(bǔ)骨脂酚下降幅度進(jìn)行排名：酒焙品>雷公品>酒浸品>鹽酒浸品。選擇酒焙法作為含酒制法類的最佳炮制方法。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 酒制類炮制品共有特征峰峰面積及變化情況/%

2.3.3 生品與其他制法類炮制品HPLC色譜圖譜比較結(jié)果 將生品與炮制品HPLC色譜圖對(duì)比，觀察特征峰峰面積變化情況，對(duì)其他制法類炮制品中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素升高幅度之和變化情況進(jìn)行排名：芝麻烘品>面炒品>清炒品>芝麻炒品，麩炒品和酒麩炒品中二者含量降低。按照補(bǔ)骨脂酚下降幅度進(jìn)行排名：芝麻烘品>麩炒品>芝麻炒品>酒麩炒品>面炒品>清炒品。選擇芝麻烘法為其他制法類的最佳炮制方法。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 其他制法類炮制品共有特征峰峰面積及變化情況/%

2.4 指標(biāo)性成分含量測(cè)定

選取鹽蒸法、酒焙法、芝麻焙法供試品溶液測(cè)定指標(biāo)性成分含量，平行試驗(yàn)3次，計(jì)算平均值，計(jì)算指標(biāo)性成分的總含量Y值，總含量（Y）=有效成分含量值（A）+有效成分含量值（B）-毒性成分含量值（C）。結(jié)果測(cè)得酒焙品的Y值最高，確定為最佳炮制方法。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 指標(biāo)性成分含量測(cè)定

3 討論

補(bǔ)骨脂為傳統(tǒng)中藥，臨床多以炮制品入藥以降低其毒副作用，2015年版《中國(guó)藥典》收載鹽炙為其主要的炮制方法。近年，有關(guān)補(bǔ)骨脂臨床不良反應(yīng)報(bào)道越來(lái)越多[9-12]，補(bǔ)骨脂的用藥安全問(wèn)題亟待解決，其炮制方法成為安全用藥的一個(gè)突破點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)選取15種具有代表性的補(bǔ)骨脂炮制方法，分成3類進(jìn)行炮制。對(duì)比生品和各炮制品的HPLC色譜圖發(fā)現(xiàn)：（1）補(bǔ)骨脂炮制品未見(jiàn)已有成分的消失或新成分生成，炮制后化學(xué)成分只是含量的變化，而未發(fā)生質(zhì)變；（2）其他制法類各炮制品的HPLC色譜圖存在明顯差異，未呈現(xiàn)出規(guī)律性，升降不一，推測(cè)不同輔料可能對(duì)補(bǔ)骨脂的化學(xué)成分含量變化影響較復(fù)雜；（3）含鹽制法類各色譜峰的變化趨勢(shì)基本一致。（4）含酒制法類中，各色譜峰的變化趨勢(shì)基本一致；（5）各炮制品中補(bǔ)骨脂酚的含量均降低了，因補(bǔ)骨脂酚具有揮發(fā)性[13]，推測(cè)其在炒、蒸等加熱的過(guò)程中揮發(fā)了[14]。因補(bǔ)骨脂酚具有肝、腎毒性[7-8]，其含有量下降說(shuō)明炮制具有減毒的功效。

今后，本實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步研究酒焙法的炮制工藝，優(yōu)化酒制炮制工藝，考察補(bǔ)骨脂炮制前后的藥效學(xué)變化，進(jìn)一步為臨床合理安全的應(yīng)用補(bǔ)骨脂提供依據(jù)。