李 航，王 萍，來琦芳，史建全，周 凱，高鵬程，祁洪芳，么宗利

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點實驗室，鹽堿水域漁業(yè)工程技術(shù)研究中心（上海），上海 200090；2.上海海洋大學(xué)，水產(chǎn)科學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心，上海 201306；3.青海湖裸鯉救護(hù)中心，西寧 810016）

青海湖裸鯉（Gymnocyprisprzewalskii）俗稱湟魚，屬鯉形目（Cypriniformes），鯉科（Cyprinidae），裂腹魚亞科（Schizothoracinae），裸鯉屬，僅分布在青海湖及其周圍水域中，是該區(qū)域重要的經(jīng)濟(jì)魚類。裸鯉具有生殖洄游的特性，能在淡水、半咸水、堿水中生活［1］，具有較強(qiáng)的鹽度變化適應(yīng)性。每年4—7月份為其繁殖季節(jié)，裸鯉溯河而上，至布哈河、沙流河和黑馬河等淡水河流中產(chǎn)卵，繁殖結(jié)束后，隨水流進(jìn)入青海湖繼續(xù)生活［2］。青海湖裸鯉在淡水和高鹽堿湖水之間的洄游過程中，由于需要適應(yīng)水環(huán)境中不同的鹽堿度，機(jī)體的免疫、呼吸排泄、能量代謝及氨排泄等生理活動以及離子轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因的表達(dá)量均會發(fā)生變化［3－7］。

腸道是魚類進(jìn)行滲透調(diào)節(jié)及酸堿平衡的主要組織之一，其滲透調(diào)節(jié)功能與體內(nèi)碳酸鹽或非碳酸鹽緩沖體系的緩沖作用關(guān)系密切［8］。研究表明，海洋硬骨魚類腸道上皮細(xì)胞是分泌碳酸氫鹽的主要場所［9］。腸道中的通過頂膜上的Cl－／交換子分泌［10］，SLC4基因家族（solute carrier family 4）和SLC26基因家族（solute carrier family 26）是生物體內(nèi)編碼轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的典型基因家族，并在海灣豹蟾魚（Opsanus beta）［11］、青海湖裸鯉［12］腸道中都有高表達(dá)。

SLC4基因家族由10個基因組成（SLC4A1～SLC4A5；SLC4A7～SLC4A11），除SLC4A11基因外，SLC4基因家族中其余基因編碼的蛋白均具有轉(zhuǎn)運(yùn)功能，但它們的轉(zhuǎn)運(yùn)方式存在差異［13－14］。由SLC4A1、SLC4A2和SLC4A3基因編碼的同源陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AE1、AE2、AE3能介導(dǎo)Cl－和的交換，其中，AE1是紅細(xì)胞的Cl－交換體，也是紅細(xì)胞中最豐富的膜蛋白。SLC4A2、SLC4A4分別編碼蛋白AE2、NBCe1，并在上皮細(xì)胞的基底外側(cè)膜表達(dá)，是Na＋／的共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可促進(jìn)的細(xì)胞凈吸收，并參與血液的輸送。其中，NBCe1（SLC4A4）為產(chǎn)電的Na＋／聯(lián)合轉(zhuǎn)運(yùn)子［15］。

SLC26基因家族編碼的陰離子交換蛋白可轉(zhuǎn)運(yùn)Cl－、、I－、OH－、和草酸根等多種陰 離 子，其 中SLC26A3、SLC26A4、SLC26A6、SLC26A7、SLC26A9和SLC26A11基因是目前被明確發(fā)現(xiàn)參與編碼Cl－和交換的重要蛋白［16］。細(xì)胞內(nèi)累積后由頂膜上SLC26A6基因編碼蛋白通過Cl－／交換排出［17］。SLC26A3基因編碼的交換子對Cl－和的轉(zhuǎn)運(yùn)比例為2∶1，而SLC26A6基因編碼的交換蛋白每轉(zhuǎn)運(yùn)1個Cl－需要2個的參與［18］。

研究表明，SLC26A2、SLC26A3、SLC26A6、SLC26A8等基因編碼的陰離子交換子的轉(zhuǎn)運(yùn)活性均可以被4，4′-二異硫氫基芪-2，2′-二磺酸（4，4′-diisothiocyanatostilbene-2，2′-disulfonic acid disodium salt hydrate，DIDS）抑制［18－20］。多數(shù)由SLC4基因家族編碼的蛋白也均能被DIDS抑制［19］。基于裸鯉具備在鹽堿水與淡水環(huán)境之間自主調(diào)節(jié)酸堿平衡的能力，本實驗設(shè)置淡水組及青海湖鹽堿水組（以下簡稱湖水組），通過注射DIDS抑制離子交換的主要編碼蛋白表達(dá)，檢測鹽堿脅迫下裸鯉血液生理指標(biāo)的變化以及參與排泄的相關(guān)蛋白對應(yīng)基因SLC4A1、SLC4A2、SLC4A4、SLC26A6在腸道中的相對表達(dá)變化，以期為揭示鹽堿環(huán)境中裸鯉腸道滲透調(diào)節(jié)和酸堿調(diào)節(jié)的作用機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用青海湖裸鯉由青海湖裸鯉救助中心提供，實驗開始前于室內(nèi)暫養(yǎng)2個月以上，暫養(yǎng)用水為凈水機(jī)（型號：開能／AC／KDF150-1）處理后自來水，每天早晚各飽食投喂人工配合商品飼料（粗蛋白32%）1次，選取體長（12.81±0.35）cm、體質(zhì)量（19.21±2.74）g、大小一致的健康個體開展實驗，實驗前48 h停止喂食。

1.2 實驗設(shè)計和樣品采集

根據(jù)青海湖裸鯉洄游水域水文特征以及青海湖湖水的離子組成和鹽堿度特征，設(shè)置淡水對照組（FW control）、淡水抑制組（FW DIDS，淡水并注射DIDS）、湖水對照組（LW control）和湖水抑制組（LW DIDS，湖水并注射DIDS），實驗用水參數(shù)設(shè)置見表1。淡水組用水為過濾自來水：鹽度0.04±0.02，堿度（1.73±0.03）mmol·L－1；湖水組用水根據(jù)青海湖湖水組成特征［3］等比例配制：鹽度14.83±0.04，堿度（29.54±0.11）mmol·L－1。裸鯉放入淡水和湖水40 h后，分別向淡水抑制組和湖水抑制組的裸鯉腹腔注射0.1 mL 10 mmol·L－1DIDS，同時，給淡水對照組和湖水對照組的裸鯉注射等體積的0.7%生理鹽水。實驗用水體積為50 L。每組設(shè)置3個重復(fù)，每個重復(fù)放置9尾裸鯉。為確保實驗用水的穩(wěn)定性，配方試劑全部溶解后曝氣24 h使用，實驗過程中每天換水50%。實驗期間全程監(jiān)測水體的鹽度、碳酸鹽堿度、pH及水溫。鹽度和水溫使用YSI 6600多功能水質(zhì)分析儀（YSI，美國）檢測，pH值用DELTA 320型精密pH計（METTLER TOLEDO，瑞士）檢測，碳酸鹽堿度采用酸堿滴定法測定［21］。

表1 實驗用水參數(shù)設(shè)置Tab.1 Parameters of experimental water

注射8 h后開始收集腸道排泄物。腸道排泄物收集參照GENZ等［22］的方法：用0.2 g·L－1MS-222麻醉裸鯉，將綁有乳膠收集袋的10μL吸頭開口端插入裸鯉泄殖腔（適當(dāng)剪去吸頭的頂端部分，以增大開口端口徑），用手術(shù)縫合線將其固定后，轉(zhuǎn)入實驗用水溶液中，實驗結(jié)束后將收集袋中的液體置于4℃下保存。而后用經(jīng)抗凝血劑（肝素鋰）潤洗的1 mL注射器通過尾靜脈穿刺采血。隨即解剖采完血的裸鯉，取出腸道，分離出具有滲透和酸堿調(diào)節(jié)功能的中腸，置于液氮中速凍后，于－80℃條件下保存。

1.3 實驗方法

用雷度ABL 80血?dú)夥治鰞x（Radiometer，丹麥）測定采集到的裸鯉靜脈血血?dú)馍碇笜?biāo)。

1.3.2 中腸SLC4A1、SLC4A2、SLC4A4、SLC26A6基因相對表達(dá)

將取出的裸鯉中腸組織快速置于1.5 mL RNasefree管中，加入1 mL Trizol（Invitrogen，美國），依據(jù)Trizol說明書提取RNA，并用超微量紫外分光光度計（BioTake）測定RNA濃度及純度，通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性。使用ReverTra Ace-α（TOYOBO，日本大阪）試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈，總反應(yīng)體系50μL，42℃延伸20 min，99℃5 min，4℃5 min后，瞬間離心，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置于－20℃保存。

將裸鯉β-actin基因（內(nèi)參基因）、SLC4A1基因、SLC4A2基因、SLC4A4基因、SLC26A6基因的已知序列（由轉(zhuǎn)錄組測序獲得）分別與GenBank中斑馬魚（Daniorerio）的對應(yīng)基因進(jìn)行比對：βactin（AY222742.1）、SLC4A1（NM＿198338.1）、SLC4A2（AY876015.1）、SLC4A4（NM＿001034984.1）、SLC26A6（FJ170818.1），選擇高度保守區(qū)域用于引物設(shè)計。引物設(shè)計使用Primer 3.0軟件［26］，引物序列見表2，由上海英駿生物技術(shù)公司合成。所有引物經(jīng)驗證均具有良好特異性，反轉(zhuǎn)錄cDNA產(chǎn)物使用SYBR Premix ExTaqTM（TaKaRa，日本）試劑盒在Light Cycler 1.2（Roche）上進(jìn)行real-time PCR反應(yīng)?？偡磻?yīng)體系為10μL，擴(kuò)增程序如下：①預(yù)變性：95℃30 s；②擴(kuò)增反應(yīng)：95℃變性5 s，60℃退火20 s，72℃延伸20 s，40個循環(huán)；③溶解曲線形成：95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s，延伸階段收集熒光信號，每個樣本設(shè)置3個重復(fù)。反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行溶解曲線分析。以β-actin作為內(nèi)參基因，基因的相對表達(dá)量使用2-△△Ct法［27］計算。

表2 定量PCR引物序列Tab.2 Primer sequences for real-time PCR assays

1.4 數(shù)據(jù)分析

文中數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SE）表示。使用SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，用單因素方差分析（one-way ANOVA）進(jìn)行顯著性分析，如果方差分析具有顯著性，再用LSD法多重比較，顯著水平P＜0.05，使用Origin 8.6軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 血?dú)庵笜?biāo)

相對于淡水對照組，湖水對照組的裸鯉血液pH及離子（包括Na＋、Ca2＋、Cl－）濃度均顯著升高（P＜0.05）（圖1-A，C，D）；二氧化碳分壓（PCO2）顯著降低（P＜0.05），氧分壓（PO2）無顯著變化（P＞0.05）（圖1-B）。在注射DIDS后，淡水抑制組裸鯉血液pH及濃度較淡水對照組顯著升高（P＜0.05），PCO2顯著降低（P＜0.05），PO2、K＋及Ca2＋濃度無顯著變化（P＞0.05）（圖1）。湖水抑制組與湖水對照組裸鯉相比，血液pH及濃度顯著升高（P＜0.05），而PCO2、PO2、K＋及Ca2＋濃度無顯著變化（P＞0.05）（圖1）。相對于淡水抑制組，湖水抑制組中裸鯉pH顯著提高（P＜0.05），PCO2和PO2無顯著變化（P＞0.05）（圖1），累積有增加趨勢，但兩者無顯著差異（P＞0.05）（圖1）。

圖1 SLC蛋白抑制劑對淡水及湖水環(huán)境中青海湖裸鯉血液生理指標(biāo)變化的影響Fig.1 Effects of SLC inhibitor on blood physiological indices of Gymnocypris przewalskii exposed to fresh water or lake water

2.2 腸道排泄?jié)舛?/h3>

圖2 不同組青海湖裸鯉腸道排泄HCO－3濃度比較Fig.2 Comparison of intestinal HCO－3 excretion concentration between different groups

2.3 中腸相關(guān)基因表達(dá)

由圖3可知，湖水組裸鯉中腸SLC4A1、SLC4A4、SLC26A6基因表達(dá)量較淡水對照組均顯著上調(diào)（P＜0.05）。其中，SLC26A6基因上調(diào)較其他基因更為明顯，湖水對照組和湖水抑制組分別上調(diào)達(dá)到淡水對照組的3.6倍和5.1倍。湖水組SLC4A2基因表達(dá)量與淡水對照組無顯著差異（P＞0.05）。注射DIDS后，湖水抑制組SLC4A1基因相對于湖水對照組表達(dá)量降低；淡水抑制組SLC26A6基因表達(dá)量較淡水對照組降低。

圖3 SLC蛋白抑制劑對青海湖裸鯉中腸SLC4A1、SLC4A2、SLC4A4、SLC26A6基因相對表達(dá)量的影響Fig.3 Effects of SLC inhibitor on relative expression of SLC4A1，SLC4A2，SLC4A4，SLC26A6 genes in the mid-intestine of Gymnocypris przewalskii

3 討論

裸鯉體內(nèi)血液生理指標(biāo)的變化是反映其對高鹽堿環(huán)境適應(yīng)性的重要指標(biāo)。在本實驗中，湖水對照組裸鯉與淡水對照組相比，血液pH升高，濃度及PCO2降低。研究表明，硬骨魚類進(jìn)入高鹽堿環(huán)境后，由于水體中PCO2水平較低，會促使血液中CO2向水中擴(kuò)散，導(dǎo)致血液中的PCO2水平下降［28－29］。當(dāng)魚類機(jī)體發(fā)生持續(xù)性的堿呼吸中毒時，為了緩解這種癥狀，機(jī)體會啟動酸堿調(diào)節(jié)機(jī)制，體內(nèi)迅速釋放出乳酸鹽以及H＋等酸性物質(zhì)，會導(dǎo)致短期內(nèi)血液中濃度降低［30－31］。另外，高鹽堿環(huán)境中，一部分碳酸鹽可能以CO2的形式排出體外，使血液中含量隨著PCO2降低而明顯下降［32］。在本實驗中，鹽堿脅迫48 h后，裸鯉血液pH升高，PCO2降低，表明在高堿度脅迫初期，機(jī)體出現(xiàn)呼吸性堿中毒癥狀，這是裸鯉應(yīng)對鹽堿脅迫時的生理反應(yīng)。裸鯉血液中的Na＋、Ca2＋和Cl－濃度顯著升高，則是高鹽度環(huán)境下機(jī)體滲透失水，血液滲透壓升高的表現(xiàn)［33］。SLC家族蛋白通過調(diào)控腸道分泌，幫助裸鯉適應(yīng)高鹽堿環(huán)境。裸鯉在高鹽堿環(huán)境下血液中會累積大量的，SLC家族蛋白有助于裸鯉腸道在高鹽堿環(huán)境下排泄。由于鹽堿水會引起類似海水的高滲透環(huán)境，與海水魚類似，裸鯉啟動滲透調(diào)節(jié)反應(yīng)［34］，腸道分泌較多。這種現(xiàn)象在莫桑比克羅非魚（Oreochromismossambicus）中也有發(fā)現(xiàn)。羅非魚在海水環(huán)境下腸道分泌含量是淡水中的幾倍，這與參與分泌的SLC家族蛋白在羅非魚適應(yīng)海水時的表達(dá)量有關(guān)［35］。還有研究也證實，海水硬骨魚的排泄與SLC蛋白相關(guān)［36－37］。在本實驗中，淡水抑制組與淡水對照組相比，雖然腸道排泄無差異，但淡水抑制組在血液中累積了更多的，這進(jìn)一步驗證了DIDS會抑制SLC蛋白的活性，導(dǎo)致血液中的無法排出，造成在裸鯉血液中的累積。裸鯉在高鹽堿環(huán)境下會啟動SLC家族基因的高表達(dá)來提高蛋白表達(dá)，以促進(jìn)腸道的排泄。鹽堿處理48 h后，裸鯉腸道SLC4A1、SLC4A2、SLC4A4、SLC26A6基因表達(dá)量均上升，且除SLC4A2基因外，湖水對照組裸鯉其余基因表達(dá)均與淡水對照組有顯著差異（P＜0.05）。腸上皮基底膜上的Na＋交換子（SLC4A2、SLC4A4）傳遞至上皮細(xì)胞，頂膜Cl－／交換子（SLC4A1、SLC26A6）分泌至腸道。裸鯉這種在鹽堿環(huán)境下通過上調(diào)SLC家族基因表達(dá)來促進(jìn)多余排泄的響應(yīng)方式，與海水魚應(yīng)對高鹽脅迫類似，是一種滲透調(diào)節(jié)的重要方式［38－40］。