鄭 霞，張夢秋，劉 軍

（連云港師范高等專科學校，連云港市生物技術重點實驗室，江蘇連云港 222006）

世界海洋物種目錄數(shù)據(jù)庫（World Register of Marine Species，WoRMS）將軟體動物門（Mollusca）腹足綱（Gastropoda）物種分為10個亞綱。然而，目前學術界對這些亞綱的分類與該數(shù)據(jù)庫并不完全一致。以其中的亞綱Patellogastropoda為例，該數(shù)據(jù)庫中按“亞綱”來分，而在一些研究中仍按“目”來對待［1－2］。但較為統(tǒng)一的是，學術界將屬于Patellogastropoda的物種統(tǒng)稱為“真帽貝”（true limpets），共包含4個科，即帽貝科（Patellidae）、花帽貝科（Nacellidae）、笠貝科（Lottiidae）和無鰓笠螺科（Lepetidae）［3］。不屬于Patellogastropoda的其他類似真帽貝形態(tài)的物種則被稱為“假帽貝”［1，4］。

帽貝喜歡附著于堅硬的基底，如巖石、貝殼等。該類物種通常具有類似“帽子”或“斗笠”形狀的外殼，其作為腹足綱物種中最原始的種類，具有重要的研究價值［3］。比如，由于其分布廣泛（廣泛的生存適應性），且兼?zhèn)淙拥囊撰@得性，帽貝已成為學者們研究生物適應性進化史與生物分布變遷史的重要模型生物［5－7］。

此外，隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展，沿海地區(qū)環(huán)境污染問題日益嚴重，世界各國對此采取了一系列應對措施。其中，海洋環(huán)境污染的生物評價法是了解污染水平的有效手段之一［8］。而帽貝因其自身特點已成為重要的污染評價指示生物［9］。據(jù)記載，中國沿海分布的真帽貝有26種，其中，中國大陸沿海的真帽貝物種主要分布于山東、浙江、福建沿海［10］。連云港地處中緯度，東臨黃海，具有江蘇省唯一的基巖海岸（長約22 km）［11］，然而，目前連云港地區(qū)帽貝的分布情況尚不清楚［1，12］，因此有必要對連云港地區(qū)沿岸分布的帽貝種類進行研究。由于同一種帽貝在形態(tài)上可能存在較大差異，僅基于形態(tài)特征的識別具有一定的不確定性。因此，本研究主要利用DNA分子標記（細胞色素c氧化酶I，COⅠ）對所采集的帽貝進行鑒別［13］，以期為連云港沿海帽貝物種的分布研究補充資料，并為今后開展有關無脊椎動物進化研究及環(huán)境污染評價等工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣本采集與統(tǒng)計

由于江蘇省連云港市的連島東側為旅游景區(qū)（連島景區(qū)），人為開發(fā)程度較高，而連島西側基巖岸較為原始，受人為干擾較少，因此本研究以連島西側基巖岸作為采樣點（圖1）。2016年3月—2019年5月，課題組按4個季節(jié)（春季：3—5月，夏季：6—8月，秋季：9—11月，冬季：12—2月）分別在連島西側的基巖岸進行了帽貝樣本的采集，每個季節(jié)采集1～2次。采集過程中，主要采用樣線法，以潮上帶外緣某點為起點，向大海方向呈放射狀樣線采樣。每次采樣均從高潮退潮開始采。用游標卡尺測量帽貝貝殼的長、寬、高。利用python 3.8.3的scipy包進行組間形態(tài)特征的差異顯著性檢驗（獨立樣本t檢驗）。

圖1 樣本采集的地理位置Fig.1 Geographical coordinates of sampling site

1.2 DNA提取及聚合酶鏈式反應（PCR）

帽貝肌肉組織DNA的提取參照經(jīng)典的酚氯仿抽提法［8］。物種識別中用到的無脊椎動物線粒體COⅠ基因的通用引物為：上游引物，5′-TAAA CTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′；下游引物，5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′［14］。擴增體系設定為50μL，見表1。

表1 PCR體系配置情況Tab.1 Materials used in PCR

程序設置為：94℃，30 min；94℃，40 s，72℃，1 min（5個循環(huán)）；94℃，40 s，46℃，40 s，72℃，1 min（30個循環(huán)）；72℃，10 min；4℃下儲存。將PCR產(chǎn)物送至南京擎科生物科技有限公司進行測序。

1.3 物種識別

利用世界海洋物種目錄數(shù)據(jù)庫（WoRMS）比對本實驗采集的全部樣本，并基于帽貝外殼的形狀、顏色、大小，挑取形態(tài)差異較大的樣本進行基于DNA條形碼的識別。利用NCBI數(shù)據(jù)庫對COⅠ序列進行比對分析（Blast）。在所有比對到的序列中將相似度≥99%的序列作為目標序列，并采集這些序列進行系統(tǒng)發(fā)生分析。系統(tǒng)發(fā)生分析采用NJ法，參數(shù)選擇MEGA軟件的默認值［15］。

2 結果與分析

2.1 帽貝的獲得情況

本研究在3年內(nèi)共采集205份帽貝樣本?；诿必惖男螒B(tài)及貝殼顏色將其分為5種類型，分別是X-W-1、X-W-6、X-W-7、X-W-18、X-W-20（圖2）。其中，類型X-W-6的帽貝形態(tài)與其他帽貝差異較大，表現(xiàn)為其貝殼近乎圓形，而其他帽貝都為卵圓形。類型X-W-1的樣本，其貝殼內(nèi)有一圈白色的環(huán)，貝殼邊緣分布有很粗的黑白相間的條紋。X-W-7的樣本僅發(fā)現(xiàn)了2個，明顯比其他樣本要?。ū?）。X-W-20的樣本貝殼內(nèi)部有明顯的黑色光澤。從采樣情況來看，X-W-20及X-W-1類帽貝較為常見，分別占樣本總數(shù)的52.68%和28.30%；其次是X-W-18類帽貝，占比為16.59%（表2）。由于X-W-6類型與X-W-7類型的帽貝數(shù)量未達到統(tǒng)計學分析的基本要求，因此僅利用獨立樣本t檢驗對其他3種類型帽貝進行了兩兩間的形態(tài)差異顯著性分析，結果顯示，各類型間均不存在顯著性差異（P＞0.05）。

2.2 DNA提取與PCR擴增

從上述5類帽貝中各選擇1～3個個體，均成功提取總DNA。利用通用引物對其進行PCR擴增，成功率均為100%，測序峰圖單一，擴增獲得了650 bp左右的序列（圖3）。

圖3 COⅠ基因PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.3 Prolife of agarose gel electrophoresis for PCR products of COⅠ

2.3 物種識別及系統(tǒng)發(fā)生分析

利用COⅠ序列通過數(shù)據(jù)庫進行比對分析（Blast），初步識別出這些帽貝隸屬于4個屬，共5個種，其中4種為“真帽貝”，分別是圓錐擬帽貝（Patelloidaconulus）、史氏背尖貝（Nipponacmeaschrenckii）、齒舌新笠貝（Nipponacmearadula）、笠貝（Lottiagoshimai），1種是“假帽貝”，為日本菊花螺（Siphonariajaponica）（表3）。與以往研究相比，除日本菊花螺與笠貝在連云港海岸未見報道外，其余3種均已有報道（表3）［1，12］。本研究結果為江蘇連云港沿海海域帽貝的物種多樣性提供了新的記錄。

表3 帽貝的COⅠ序列識別結果Tab.3 Results of species identification by COⅠbarcoding

基于Blast結果，利用這5個種的代表序列（樣品編號為X-W-1、X-W-6、X-W-7、X-W-18，XW-20），結合NCBI中25條COⅠ基因序列（每個種各5條序列），構成一個系統(tǒng)發(fā)生分析數(shù)據(jù)集（圖4），以此進一步佐證物種識別的結果。從系統(tǒng)發(fā)生關系來看，本次識別的所有“真帽貝”均來自笠貝科，“假帽貝”來自松螺科（Siphonariidae）。Bootstrap計算結果顯示，齒舌新笠貝（X-W-6）、笠貝（X-W-1）、日本菊花螺（X-W-20）的識別有著較高的可信度（圖4）。同時，本研究基于世界海洋物種目錄數(shù)據(jù)庫還進行了圖片檢索，結果發(fā)現(xiàn)，X-W-20的外部形態(tài)與該數(shù)據(jù)庫中的日本菊花螺有著較高的相似性（圖1，圖5）。此外，X-W-1的外部形態(tài)與NAKAYAMA等［16］報道的笠貝具有較高的相似性（圖1，圖5），該物種于2017年首次被日本學者命名。研究還發(fā)現(xiàn)，X-W-6的外部形態(tài)與SASAKI和OKUTANI［17］報道的齒舌新笠貝有著較高的相似性（圖1，圖5）。

圖4 基于COⅠ基因的系統(tǒng)發(fā)生分析Fig.4 Phylogenic analysis by COⅠgenes

然而，系統(tǒng)發(fā)生結果顯示，X-W-7和X-W-18混雜于包含圓錐擬帽貝與史氏背尖貝的支系中（圖4）。對于此種現(xiàn)象，本研究比較了X-W-7、XW-18與數(shù)據(jù)庫中的史氏背尖貝。通過圖片比較發(fā)現(xiàn)，這二者在形態(tài)上與數(shù)據(jù)庫中的史氏背尖貝差異都較大（圖1，圖5），基本上可排除樣本XW-7和X-W-18為史氏背尖貝的可能性。結果支持這兩種類型的帽貝樣本更可能是圓錐擬帽貝。

圖5 WoRMS及文獻中的帽貝參考圖Fig.5 Limpet photos from WoRMSand references

3 討論

以往基于帽貝貝殼形態(tài)的物種識別，存在的主要問題是貝殼形態(tài)易受到不同生境及年齡差異的影響，從而增加了識別工作的難度［3］。本研究比較了不同種帽貝間貝殼的長、寬、高指標，結果顯示，利用帽貝的此類形態(tài)指標進行物種識別具有較大的局限性（組間無顯著性差異，P＞0.05）。近期，類似研究也提示了相似的現(xiàn)象，比如，中國沿海的同一種的13個矮擬帽貝（Patelloidapygmaea）地理群體間的長、寬、高指標已具有一定程度的差異（部分地理群體的這些指標均值間甚至有2～3倍的差異）［18］。因此，僅利用這些形態(tài)指標區(qū)別不同物種，得到的結果并不一定準確。

本研究統(tǒng)計樣本數(shù)時發(fā)現(xiàn)，日本菊花螺為優(yōu)勢種，而齒舌新笠貝的數(shù)量較少（僅3個），其原因除了與影響其種群變動的因素有關以外［19］，還可能與其生境的特征有關。據(jù)觀察，本次研究中齒舌新笠貝附著在潮濕、陰暗的石縫中，增加了樣本獲取的難度。ITSUKUSHIMA等［20］也曾報道過齒舌新笠貝的生境喜好，認為該物種偏向于沙質的生境。這種生境特征可能是導致該物種在本次實驗中獲得量較少的主要原因之一。當然，這還需要在后期的研究中進一步驗證。此外，雖然潮間帶環(huán)境特殊，但帽貝物種已表現(xiàn)出了很好的適應性。溫度常被認為是影響物種地理分布范圍邊界的重要環(huán)境變量，而海洋潮間帶物種由于有著近乎線性的地理分布模式，已成為生物地理學研究的模式生物［21］。本次實驗的主要目的為識別帽貝物種，今后還可進一步開展帽貝分布情況受溫度因素影響的研究，并設計更具有針對性的實驗方案。

目前，DNA條形碼已被越來越多地用于獲取未經(jīng)種類鑒定生物的分類學信息［22］。該技術涉及到對線粒體細胞色素c氧化酶Ⅰ（COⅠ）基因的一個短片段進行測序，即從分類學上尚未鑒定種類的標本中提取DNA條形碼，并與已知分類的DNA條形碼庫進行比對。形態(tài)鑒定結合分子生物學手段能增加物種識別的準確性。如今，已被用于物種識別的線粒體基因技術還有12／16S rRNA和Cytb基因等［23］。線粒體16SrRNA序列在帽貝物種識別及種間關系的研究中都有廣泛的應用［15］。為了進一步驗證X-W-7和X-W-18并非史氏背尖貝，本研究通過擴增這兩個樣本的線粒體16S rRNA序列后發(fā)現(xiàn)，序列相似度最高的前3條序列均為圓錐擬帽貝，且相似度均為96%①源自本實驗室未發(fā)表數(shù)據(jù)。由于擬帽貝屬內(nèi)同一物種的形態(tài)和生態(tài)類型本身差異較大，因此完全基于形態(tài)來識別該屬內(nèi)的近源種具有一定的難度［15］。圓錐擬帽貝為矮擬帽貝的近源種，其殼高相對其他的擬帽貝屬物種要高，形狀近錐形［15］。圓錐擬帽貝和P.heroldi都曾被看作矮擬帽貝的同種異名［15，17］，NAKANO和OZAWA［15］利用COⅠ與16SrRNA分子工具成功將這3個種分離。因此，本研究利用16SrRNA得到的補充識別結果具有一定的可靠性。綜合來看，基本可以斷定X-W-7和X-W-18都應為圓錐擬帽貝。

4 小結

本研究借助DNA條形碼以及帽貝物種形態(tài)特征的對比，成功識別出了4種帽貝（日本菊花螺、笠貝、齒舌新笠貝、圓錐擬帽貝）。其中，物種日本菊花螺與笠貝為江蘇連云港沿海首次報道種。研究結果為了解連云港地區(qū)帽貝多樣性提供了必要的資料。由于樣本采集具有一定的難度（天氣、潮汐、生境等因素都會影響采樣結果），導致本次研究存在一定的不足之處。比如本應該采集到的矮擬帽貝卻未被采到［18］。連云港基巖海岸帽貝物種的多樣性及分布情況仍有必要進行進一步調查。

致謝：感謝參與實驗調查的蘇麗、魏媛媛、李凡、王井之等同學。