劉 宇，直俊強(qiáng)，石 奧，張建淼，李延隆，陳宜軍

(北京市畜牧業(yè)環(huán)境監(jiān)測(cè)站，北京 102200)

引 言

近年來(lái)，隨著我國(guó)畜牧養(yǎng)殖業(yè)迅猛發(fā)展，抗生素被長(zhǎng)期大量的應(yīng)用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2013年我國(guó)抗生素使用量在16.2萬(wàn)t以上，其中有52%用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)中[1]。研究表明畜禽不能完全利用抗生素，約25%～75%的抗生素未經(jīng)代謝以母體化合物形式隨糞便或者尿液排出體外[2]。畜禽糞便通過(guò)施肥等方式進(jìn)入周邊環(huán)境，導(dǎo)致環(huán)境中抗生素逐漸增多，對(duì)環(huán)境中微生物耐藥性產(chǎn)生選擇壓力，加速誘導(dǎo)抗性細(xì)菌和抗生素抗性基因(Antibiotic Resistance Genes，ARGs) 出現(xiàn)[3]。2006年，Pruden 等首次將 ARGs 作為一種新型環(huán)境污染物提出，指出ARGs對(duì)人類(lèi)健康及生態(tài)環(huán)境存在潛在風(fēng)險(xiǎn)[4]。抗性基因可以整合到可移動(dòng)基因元件上，如質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子等，通過(guò)接合、轉(zhuǎn)座和轉(zhuǎn)導(dǎo)等作用在細(xì)菌之間進(jìn)行水平基因轉(zhuǎn)移(horizontal gene transfer ，HGT)，抗性基因可以在土壤、地下水及各個(gè)環(huán)境介質(zhì)中遷移、轉(zhuǎn)化[4～6]，并很可能隨抗性質(zhì)粒等被帶入食物鏈，最終進(jìn)入人體，增加人體的抗生素耐藥性，威脅人類(lèi)健康[7-8]。

我國(guó)獸用抗生素過(guò)量使用和違規(guī)使用情況嚴(yán)重，加劇了養(yǎng)殖密集區(qū)周邊地表地下水和土壤環(huán)境的污染程度[9]。近年來(lái)，不斷有研究者關(guān)注到這一問(wèn)題，抗生素抗性基因污染研究不斷深入。朱永官等[10]在豬場(chǎng)土壤中檢測(cè)到較高含量的四環(huán)素類(lèi)抗性基因tetW。房文燕等研究發(fā)現(xiàn)，深圳某活禽交易區(qū)空氣中四環(huán)素類(lèi)抗性基因tetG、tetW和磺胺類(lèi)抗性基因sul1、sul2檢出率達(dá)均可達(dá)70%以上。高敏等[11-12]分析養(yǎng)雞場(chǎng)空氣和糞便樣品，結(jié)果在雞場(chǎng)環(huán)境中檢出四環(huán)素類(lèi)、P-內(nèi)心胺類(lèi)、磺胺類(lèi)等抗性基因，并認(rèn)為糞便可能是空氣中抗性基因的主要源頭。但這些研究主要圍繞單一養(yǎng)殖品種，并且對(duì)于養(yǎng)殖場(chǎng)還田糞便抗性基因污染缺少監(jiān)測(cè)。因此，本研究選取26家規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)，研究畜禽糞便中典型ARGs的含量水平與堆肥糞便污染情況，為評(píng)估規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)抗性基因污染風(fēng)險(xiǎn)提供參考。

1 材料方法

1.1 采樣養(yǎng)殖場(chǎng)

共選取26個(gè)規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)，具體情況如表1。用無(wú)菌勺采集養(yǎng)殖場(chǎng)糞便樣品于無(wú)菌塑料袋中，密封，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 采樣場(chǎng)家基本情況Tab.1 Basic information of sampling sites (頭/羽)

1.2 糞便DNA提取

采用DNA提取試劑盒(購(gòu)于天根生化科技(北京)有限公司)，依照說(shuō)明方法提取糞便微生物基因組DNA，提取的DNA 使用微量核酸蛋白質(zhì)分析儀(Nanodrop) 檢測(cè)含量以及純度(A260/A280 值在1.8 ～2.0 之間)，并將提取的DNA儲(chǔ)存于-20℃冰箱備用。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

本試驗(yàn)選取典型耐藥基因四環(huán)素類(lèi)和喹諾酮類(lèi)耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)，熒光定量PCR引物如表2所示，引物序列均由生工生物工程(上海) 股份有限公司合成。

表2 抗生素抗性基因引物序列Tab.2 Antibiotic resistance gene primer sequences

1.4 熒光定量PCR

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

質(zhì)粒用試劑盒 Mini BEST Plasmid Purification Kit Ver (Ta Ka Ra)依照生產(chǎn)商說(shuō)明的方法提取。提取的質(zhì)粒用微量核酸蛋白質(zhì)分析儀(Nanodrop)檢測(cè)含量以及純度，按10倍濃度梯度稀釋?zhuān)蚩截悢?shù)計(jì)算參照文獻(xiàn)[13]，以DNA 濃度(拷貝數(shù)c) 的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，Ct(由熒光定量PCR儀直接測(cè)得) 為縱坐標(biāo)，根據(jù)下式 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

式中n為合成后質(zhì)粒質(zhì)量濃度，ng /μL; m為質(zhì)粒和插入的目的基因片段的總堿基數(shù)，bp; c 為拷貝數(shù)，copies /μL。

1.4.2 熒光定量PCR 反應(yīng)體系及程序

定量 PCR 反應(yīng)在 BIORAD CFX 96 Touch 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀器中進(jìn)行。反應(yīng)體系為20μL，其中模板DNA2μL，上、下游引物(10μmol/L)各1μL，2×SYBR Premix Ex TaqTMII 10μL，RNAase-free水6μL 。實(shí)時(shí)定量采用兩步PCR擴(kuò)增法，程序?yàn)?95℃ 10，95℃ 5s，60℃ 30s，40個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后對(duì)獲得的信號(hào)和數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

1.4.3 ARGs相對(duì)豐度分析

由于不同養(yǎng)殖場(chǎng)糞便中微生物總量不同，為減少偏差，將ARGs的濃度與其內(nèi)參基因 16SrRNA的濃度做歸一化處理，得到各ARGs的相對(duì)豐度。

ARGs相對(duì)豐度=ARGs拷貝數(shù)/16srRNA拷貝數(shù)

1.5 數(shù)據(jù)分析

所有的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)均來(lái)自至少三次以上的獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，使用軟件Graphpad Prism 8.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和t檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性比較，其中P>0.5為差異不顯著，P<0.05為差異顯著。數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”(mean ±S.E.M)的形式進(jìn)行表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR定量檢測(cè)結(jié)果

對(duì)畜禽糞便中典型耐藥基因及其內(nèi)參基因 16SrRNA進(jìn)行QPCR定量檢測(cè)。圖1和圖2是應(yīng)用Bio-Rad CFX實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀擴(kuò)增后，利用Bio-Rad Manager軟件得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶解曲線，以16srRNA為例。

圖1 16srRNA的擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The amplification curve and the standard curve of reference genes 16srRNA

圖2 16srRNA的溶解曲線Fig.2 The melting curve of 16srRNA

2.2 養(yǎng)殖場(chǎng)糞便中耐藥基因絕對(duì)豐度分析

目的基因絕對(duì)拷貝數(shù)可以反映微生物生物量的基因表達(dá)豐度，因此對(duì)26家規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)糞便樣品中5種抗性基因拷貝數(shù)進(jìn)行檢測(cè)，以反映養(yǎng)殖場(chǎng)糞便中耐藥基因絕對(duì)豐度，結(jié)果如表3所示。

表3 養(yǎng)殖場(chǎng)糞便中不同抗性基因拷貝數(shù)情況Tab.3 Copy numbers of different resistance genes in the manure of the farm

檢測(cè)結(jié)果表明，26家養(yǎng)殖場(chǎng)糞便四環(huán)素類(lèi)抗生素抗性基因檢出率較高，tetA檢出率為96.2%(25/26)，tetO檢出率為50%(13/26)，tetM檢出率為88.5%(23/26)。而喹諾酮類(lèi)抗生素抗性基因qnrA和qnrS檢出率分別為61.5%(16/26)和46.2%(12/26)，低于四環(huán)素類(lèi)耐藥基因檢出率。四環(huán)素類(lèi)抗性基因tetA的絕對(duì)含量最高，其拷貝數(shù)高達(dá)6.03×107，顯著高于tetO、tetM、qnrA和qnrS(P<0.05)。與tetA和tetO相比，tetM絕對(duì)含量最低，其拷貝數(shù)為3.43×105。喹諾酮類(lèi)抗性基因qnrA絕對(duì)含量最低，其拷貝數(shù)為1.28×104，各耐藥基因平均拷貝數(shù)由高到低依次為tetA>tetO>tetM>qnrS>qnrA 。

2.3 養(yǎng)殖場(chǎng)糞便中耐藥基因相對(duì)豐度分析

2.3.1 各養(yǎng)殖場(chǎng)糞便中耐藥基因相對(duì)豐度

將ARGs拷貝數(shù)與16srRNA基因拷貝數(shù)做歸一化處理，得到不同養(yǎng)殖場(chǎng)ARGs相對(duì)豐度，并對(duì)其取對(duì)數(shù)，其結(jié)果如圖3所示，抗性基因相對(duì)豐度從高到低依次是tetA、tetO、tetM、qnrS、qnrA，與糞便中抗生素抗性基因絕對(duì)含量趨勢(shì)一致。將各基因相對(duì)含量?jī)蓛杀容^，結(jié)果發(fā)現(xiàn)tetA與tetO之間無(wú)顯著性差異，與tetA相比，tetM含量顯著降低(P<0.001)，喹諾酮類(lèi)抗性基因qnrS和qnrA差異極顯著(P<0.001)。tetA與qnrA相比，qnrA相對(duì)含量顯著降低(P<0.001)，其他均無(wú)顯著性差異?？傮w而言，養(yǎng)殖場(chǎng)糞便中四環(huán)素類(lèi)抗性基因相對(duì)豐度高于喹諾酮類(lèi)抗性基因，這與糞便中抗生素抗性基因絕對(duì)含量結(jié)果一致。

圖3 抗性基因相對(duì)豐度對(duì)數(shù)值Fig.3 Log value of relative abundance of resistance genes

2.3.2 不同品種畜禽糞便中抗生素抗性基因相對(duì)豐度情況

為進(jìn)一步分析不同養(yǎng)殖品種畜禽糞便抗性基因相對(duì)豐度情況，將牛(羊)、生豬、雞(鴨)養(yǎng)殖場(chǎng)分類(lèi)分析，結(jié)果如圖4發(fā)現(xiàn)抗性基因tetA在豬糞中相對(duì)豐度最高，約為牛(羊)糞便抗性基因相對(duì)豐度5.6倍(P>0.05)，約為雞(鴨)糞便的9.2倍(P>0.05)。tetM抗性基因相對(duì)豐度整體趨勢(shì)也為豬糞相對(duì)豐度最高，雞(鴨)糞便次之，牛(羊)糞便最低。tetO抗性基因不同畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)間差異較大，整體趨勢(shì)為豬糞相對(duì)豐度最高，牛(羊)糞便次之，雞(鴨)糞便相對(duì)豐度最低。喹諾酮類(lèi)抗性基因與四環(huán)素類(lèi)抗性基因類(lèi)似，均為生豬養(yǎng)殖場(chǎng)抗性基因相對(duì)豐度最高，牛羊雞鴨養(yǎng)殖場(chǎng)次之。

圖4 不同養(yǎng)殖品種抗性基因相對(duì)豐度對(duì)數(shù)值Fig.4 Log value of relative abundance of resistant genes in different breeds

2.3.3 糞便處理后抗生素抗性基因相對(duì)豐度情況

為進(jìn)一步了解糞便堆積發(fā)酵對(duì)抗生素抗性基因的影響，隨機(jī)選取六家養(yǎng)殖場(chǎng)采集簡(jiǎn)單堆肥處理后的糞便。結(jié)果如圖5所示，采集新鮮糞便的養(yǎng)殖場(chǎng)tetA和tetO抗性基因相對(duì)豐度有下降趨勢(shì)，而tetM堆肥抗性基因相對(duì)豐度反而有所上升。qnrA抗性基因兩種糞便處理方式相對(duì)豐度基本持平，qnrS抗性基因堆肥糞便抗性基因也有下降趨勢(shì)，總體而言，糞便進(jìn)行簡(jiǎn)單堆肥處理并未影響抗性基因表達(dá)豐度。

圖5 不同糞便處理方式抗性基因相對(duì)豐度對(duì)數(shù)值Fig.5 Log value of relative abundance of resistance genes in different fecal treatments

3 討 論

研究表明，畜禽糞便是耐藥微生物和耐藥基因的重要來(lái)源之一[14～16]。為了解養(yǎng)殖場(chǎng)糞便中抗性基因含量水平，本試驗(yàn)對(duì)26家養(yǎng)殖場(chǎng)畜禽糞便進(jìn)行調(diào)查研究，測(cè)定四環(huán)素類(lèi)抗生素抗性基因tetA、tetO、tetM以及喹諾酮類(lèi)抗生素抗性基因qnrA和qnrS 的含量。結(jié)果表明四環(huán)素類(lèi)抗性基因tetA和tetM檢出率分別達(dá)到96.2%(25/26)和88.5%(23/26)，喹諾酮類(lèi)抗性基因平均檢出率也達(dá)到53.8%(28/52)，表明畜牧養(yǎng)殖場(chǎng)存在四環(huán)素類(lèi)和喹諾酮類(lèi)抗性基因污染問(wèn)題。因ARGs 在環(huán)境中的存在又具有“持久性”和“可復(fù)制性”[17]，可能會(huì)通過(guò)基因水平轉(zhuǎn)移在施肥過(guò)程中向土壤中的細(xì)菌傳遞，威脅人類(lèi)健康。已有研究發(fā)現(xiàn)畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)周邊蔬菜地存在磺胺類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)ARGs污染[18-19]。程建華等[20]也在畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)土壤中共檢出79種抗生素抗性基因和5種可移動(dòng)基因元件,并且多重耐藥類(lèi)基因是養(yǎng)殖場(chǎng)土壤中豐度最高的抗性基因。糞便還田施用可能是造成養(yǎng)殖場(chǎng)周邊土壤耐藥基因殘留污染的重要原因。并且，畜禽糞污還能進(jìn)一步進(jìn)入環(huán)境水體，造成ARGs污染擴(kuò)散。趙曉祥[21]等采集上海市17個(gè)不同地段的水樣,進(jìn)行了耐藥菌和ARGs豐度的檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖場(chǎng)周?chē)恿骺偰退幘科毡楦哂诜丘B(yǎng)殖場(chǎng)周?chē)恿?。金明蘭[22]等發(fā)現(xiàn)養(yǎng)禽場(chǎng)周?chē)h(huán)境中存在磺胺類(lèi)抗性菌株,且具有多重抗性。因此，抗性基因污染問(wèn)題以及如何消除抗性基因需要研究者的進(jìn)一步關(guān)注。

另外，我們針對(duì)養(yǎng)殖品種進(jìn)行分類(lèi)，以期對(duì)不同種類(lèi)養(yǎng)殖品種污染特征進(jìn)行進(jìn)一步了解，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與牛(羊)以及雞(鴨)養(yǎng)殖場(chǎng)耐藥基因相對(duì)含量相比，豬場(chǎng)糞便耐藥基因相對(duì)含量較高。目前抗性基因污染研究集中于單一養(yǎng)殖品種，很少有研究將不同養(yǎng)殖品種進(jìn)行分類(lèi)研究，這不利于掌握不同養(yǎng)殖品種的ARGs污染特征。多位研究者通過(guò)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，豬場(chǎng)存在一定程度的抗性基因污染[23～25]，并且朱永官等人分析中國(guó)三個(gè)大規(guī)模的商業(yè)養(yǎng)豬場(chǎng)中的豬糞，共檢測(cè)到149 種不同的 ARGs，并發(fā)現(xiàn) ARGs的種類(lèi)是不使用抗生素牧場(chǎng)中豬糞的3倍[26]。生豬養(yǎng)殖場(chǎng)抗性基因污染較嚴(yán)重，這可能與豬場(chǎng)抗生素使用量較大，以及生豬養(yǎng)殖模式等多種因素相關(guān)，應(yīng)對(duì)養(yǎng)豬場(chǎng)抗生素使用進(jìn)一步規(guī)范，重視其帶來(lái)的ARGs污染。最后，我們選取6家養(yǎng)殖場(chǎng)新鮮糞便和堆肥糞便進(jìn)行耐藥基因相對(duì)含量對(duì)比。結(jié)果表明，堆肥糞便抗性基因并沒(méi)有顯著性變化，說(shuō)明養(yǎng)殖場(chǎng)普通堆肥糞便處理方式并不能消除抗生素耐藥基因污染，并未達(dá)到厭氧發(fā)酵去除抗性基因污染的效果。養(yǎng)殖場(chǎng)糞便大部分只經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單發(fā)酵處理或未經(jīng)處理就直接用作肥料，進(jìn)入到環(huán)境中，存在耐藥性擴(kuò)散風(fēng)險(xiǎn)。因此，未來(lái)對(duì)于糞便處理方式需要考慮耐藥基因污染因素，優(yōu)化現(xiàn)有糞污處理工藝，以期減少堆肥糞便中耐藥基因帶來(lái)的環(huán)境污染與健康威脅，實(shí)現(xiàn)畜禽糞便無(wú)害化和資源化。

4 結(jié) 論

4.1 規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)畜禽糞便中普遍存在ARGs污染，其中四環(huán)素類(lèi)抗生素抗性基因檢出率較高，喹諾酮類(lèi)抗生素抗性基因檢出率次之。

4.2 生豬養(yǎng)殖場(chǎng)的ARGs污染程度高于牛(羊)以及雞(鴨)養(yǎng)殖場(chǎng)。

4.3 新鮮糞便與堆肥糞便ARGs相對(duì)豐度并無(wú)顯著性差異，表明普通糞便處理方式不能減少ARGs含量，畜禽糞便還田易造成ARGs污染。