劉變枝， 李海潔， 郭家鴻， 郭朝輝， 馮建新， 楊雪冰， 張嬌， 李明

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河南 鄭州 450046； 2.河南省水產(chǎn)科學(xué)研究院水產(chǎn)養(yǎng)殖與遺傳育種研究室，河南 鄭州 450044； 3.河南省水產(chǎn)技術(shù)推廣站，河南 鄭州 450008)

天然免疫系統(tǒng)是生物體抵抗病原侵襲的第一道防線，其免疫穩(wěn)態(tài)的維持取決于機(jī)體免疫反應(yīng)強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間，免疫不足加重病原體的侵襲，免疫過(guò)度活化則引發(fā)自身免疫性疾病[1]。因此，機(jī)體天然免疫過(guò)程需受到精準(zhǔn)調(diào)控。泛素化修飾是真核生物中廣泛存在的一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾[2]，由E1泛素激活酶、E2泛素結(jié)合酶、E3泛素連接酶(E3s)或去泛素化酶共同作用完成，可在不同信號(hào)通路水平調(diào)控模式識(shí)別受體(Pattern recognizing receptors，PRRs)介導(dǎo)的天然免疫反應(yīng)。在這一過(guò)程中，E3連接酶起到關(guān)鍵作用，是泛素分子被精準(zhǔn)耦聯(lián)到特定蛋白的關(guān)鍵以及底物特異性的直接決定者[3]。RING E3s是一類含有RING(Really interesting new gene)結(jié)構(gòu)域的E3泛素連接酶，通過(guò)RING結(jié)構(gòu)域招募E2泛素結(jié)合酶進(jìn)而介導(dǎo)泛素分子從E2轉(zhuǎn)移至底物進(jìn)行泛素化修飾[4]。RNF(Ring finger protein)家族是RING E3中的一大類，目前越來(lái)越多的RNF家族成員被證明在宿主天然免疫中起調(diào)控作用[5-6]，故挖掘RNF家族中新的天然免疫調(diào)控分子，解析其在天然免疫中的泛素化調(diào)控功能，可有效豐富PRRs介導(dǎo)的天然免疫反應(yīng)調(diào)控機(jī)制，為抗病毒藥物及治療靶點(diǎn)的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

RNF2是RNF家族的一員，為多梳基因家族(Polycomb group，PcG)成員PCR1復(fù)合體(Polycomb repressive complex1，PCRC1)的核心組分和重要催化亞基，在發(fā)育、腫瘤發(fā)生等方面起表觀調(diào)控作用[7-8]。最新研究表明，RNF2通過(guò)泛素化負(fù)調(diào)控IFN-I(Interferon-I)通路抗病毒反應(yīng)[9]，在NF-κB免疫信號(hào)通路等方面也發(fā)揮作用[10]，提示RNF2在機(jī)體抗病毒精準(zhǔn)調(diào)控中可能發(fā)揮重要的負(fù)反饋?zhàn)饔?。?Cyprinuscarpio)是中國(guó)內(nèi)陸重要的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖魚類，近年來(lái)，細(xì)菌、病毒等疾病已成為制約中國(guó)鯉產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素[11]。深入研究PRRs介導(dǎo)的鯉天然免疫反應(yīng)調(diào)控機(jī)制，將為鯉疾病的防治提供有效理論基礎(chǔ)。因此，本研究以鯉為研究對(duì)象，克隆RNF2基因序列、檢測(cè)其在鯉各組織中的表達(dá)，為進(jìn)一步研究該基因的功能及其在鯉天然免疫防御中的作用研奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和主要試劑

試驗(yàn)魚(規(guī)格：(448.33±5.61)g，表觀健康)取自河南省水產(chǎn)研究院黃河鯉遺傳育種培育基地。試驗(yàn)魚運(yùn)回后放置河南農(nóng)業(yè)大學(xué)文化路校區(qū)動(dòng)物房?jī)?nèi)的圓形養(yǎng)殖缸內(nèi)暫養(yǎng)(直徑2 m，高0.75 m；有效水體積：1.80 m3)，暫養(yǎng)水溫29～32 ℃。暫養(yǎng)5 d后解剖魚體，分別取腎臟、鰓、皮膚、前腸、中腸、后腸、脾臟、心臟、腦、頭腎、肝臟和肌肉組織，經(jīng)冷藏的DEPC水沖洗后迅速放入無(wú)RNA酶冷凍管，液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱備用。

主要試劑：Trizol 試劑(TaKaRa 公司)、PrimerScriptTMRT reagent Kit(Perfect Real Time)(TaKaRa 公司)、PremixTaqTM(LATaqTMVersion 2.0 plus dye)(TaKaRa 公司)、DL5000 DNA Maker(北京擎科生物科技有限公司)、瓊脂糖凝膠 DNA 回收試劑盒(天根生化科技有限公司)、pMD-19T Vector(TaKaRa 公司)、E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞(TransGen Biotech)等。

1.2 引物設(shè)計(jì)及合成

據(jù)NCBI網(wǎng)站發(fā)布的鯉RNF2基因預(yù)測(cè)序列，以β-actin為內(nèi)參基因，利用NCBI primer-BLAST軟件設(shè)計(jì)基因克隆及qRT-PCR引物，引物信息見表1。引物由河南尚亞生物技術(shù)有限公司合成。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.3 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

Trizol法提取鯉各組織總RNA，評(píng)價(jià)其純度、濃度、完整性。利用PrimeScript試劑盒合成cDNA第一鏈，后據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒要求將cDNA稀釋成相同濃度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 鯉RNF2基因的克隆及測(cè)序

以腎臟組織cDNA為模板進(jìn)行鯉RNF2基因CDS(Coding sequence)區(qū)序列PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系如下(50 μL)：模板cDNA(300 ng·μL-1) 1 μL，RNF2-F1(10 μmol·L-1) 1 μL，RNF2-R1(10 μmol·L-1) 1 μL，2×Taq PCR Master Mix 25 μL，ddH2O補(bǔ)至50 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸 1 min，32個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，膠回收試劑盒回收目的條帶，連接pMD-19T載體，16 ℃過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂板后挑取單克隆接種LB液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃搖床180 r·min-1振蕩培養(yǎng)12～16 h后，提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR檢測(cè)鑒定正確后送至河南尚亞生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.5 鯉RNF2生物信息學(xué)分析

應(yīng)用Megalign、Mega 7.0軟件和BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)程序?qū)︴嶳NF2基因核苷酸序列做同源性比較，繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。利用ProtParm在線程序(http://www.expasy.org/tools/protparam.html)分析鯉RNF2蛋白理化參數(shù)；采用SignalP在線程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/)分析RNF2蛋白信號(hào)肽的功能；使用TMHMM在線程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)和Expasy Protscale在線程序(http://web.expasy.org/protscale /l)進(jìn)行RNF2蛋白質(zhì)跨膜區(qū)預(yù)測(cè)和疏水性分析；使用NCBI的Conserved Domain Database(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)分析RNF2蛋白結(jié)構(gòu)域；通過(guò)PSORT II Prediction在線網(wǎng)站(https://psort.hgc.jp/form2.html)預(yù)測(cè)RNF2蛋白的亞細(xì)胞定位；利用SOPMA在線程序(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)和Phyre2在線軟件(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)及SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)分析RNF2蛋白二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)；利用UbiBrowser在線程序(http://ubibrowser.ncpsb.org/ubibrowser/)進(jìn)行RNF2蛋白泛素化底物預(yù)測(cè)。

1.6 鯉RNF2基因在鯉不同組織中的表達(dá)譜分析

qRT-PCR反應(yīng)體系：TB Green?PreminExTaqRMⅡ 5 μL、上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.3 μL、cDNA(300 ng·μL-1)1 μL、ddH2O 補(bǔ)足至10 μL。在CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)，擴(kuò)增程序采用三步法：95 ℃，5 min；1個(gè)循環(huán)。95 ℃，30 s；60 ℃，30 s；72 ℃，30 s；共38個(gè)循環(huán)。95 ℃，10 s;65 ℃，60 s；97 ℃，1 s；1個(gè)循環(huán)。37 ℃,30 s。每個(gè)組織設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù)，根據(jù)熒光定量所得到的Ct值，采用2-△△Ct法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，GraphPad Prism 7.0軟件作圖。

1.7 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，利用SPSS 25.0軟件進(jìn)行分析處理。數(shù)據(jù)經(jīng)齊性檢驗(yàn)后(Homogeneity of variances)，進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，若數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)則進(jìn)行Duncan’ s多重比較(Duncan’ s multiple range test)。

2 結(jié)果與分析

2.1 鯉RNF2基因的克隆

以腎臟組織cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得大小約為1 011 bp的片段(圖1)。測(cè)序得到1 011 bp核苷酸序列，包含鯉RNF2基因的完整開放閱讀框(ORF)，編碼336個(gè)氨基酸(圖2)，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA，A、G、C、T分別占29.28%、27.50%、26.90%、16.32%。

圖1 鯉RNF2基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖2 鯉RNF2基因CDS區(qū)及相應(yīng)氨基酸序列

2.2 鯉RNF2基因的同源性比較

由圖3和圖4可知，鯉RNF2基因核苷酸序列與鯽(Carassiusauratus)、斑馬魚(Daniorerio)、金頭鯛(Sparusaurata)、海洋青鳉魚(Oryziasmelastigma)、鱈魚(Gadusmorhua)、非洲爪蟾(Xenopuslaevis)、尖尾嬌鹟(Chiroxiphialanceolata)、小鼠(Musmusculus)、智人(Homosapiens)的同源性分別為98.2%、93.1%、78.0%、79.2%、79.2%、73.9%、78.1%、72.7%、72.7%。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示鯉與鯽、斑馬魚的親緣關(guān)系最近，與智人、小鼠的遺傳距離較遠(yuǎn)。

圖3 鯉RNF2核苷酸序列與其他已知物種核苷酸序列的比對(duì)

圖4 鯉RNF2基因系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.3 鯉RNF2蛋白的理化性質(zhì)

由表2 和表3 可知，鯉RNF2蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為37.44 kD，理論等電點(diǎn)(pI)為6.28，屬酸性蛋白；該蛋白共有336個(gè)氨基酸，負(fù)電荷殘基(Asp+Glu)和正電荷的殘基(Arg+Lys)總數(shù)分別為44和40，分子式為C1611H2590N470O522S17，原子總數(shù)為5 210；編碼氨基酸不穩(wěn)定指數(shù)為36.75，為穩(wěn)定蛋白；脂肪系數(shù)為74.97%；親疏水性分析發(fā)現(xiàn)，RNF2蛋白第76位異亮氨酸疏水性最強(qiáng)(1 911)，第121位谷氨酸和122位丙氨酸親水性最強(qiáng)(-2 744)，平均親水性為-0.631，為親水性蛋白(圖5)。

表2 鯉RNF2蛋白的氨基酸組成Table 2 Amino acid composition of RNF2 protein in Cyprinus carpio

表3 RNF2蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)信息Table 3 Primary structure information of RNF2 protein

圖5 鯉RNF2蛋白疏水性分析Fig.5 Hydrophobicity analysis of Cyprinus carpio RNF2 protein

2.4 鯉RNF2蛋白跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽預(yù)測(cè)

圖6和圖7可知，RNF2蛋白不含跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽，不屬于跨膜蛋白和分泌蛋白。

圖6 鯉RNF2蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.6 HTransmembrane structure prediction of RNF2 protein in Cyprinus carpio

圖7 鯉RNF2蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)Fig.7 Signal peptide prediction of RNF2 protein

2.5 鯉RNF2蛋白亞細(xì)胞定位和功能結(jié)構(gòu)域分析

鯉RNF2蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示該蛋白在細(xì)胞核、線粒體、細(xì)胞質(zhì)和過(guò)氧化物酶體上的比例分別為52.2%、26.1%、17.4%和4.3%，表明該蛋白主要位于細(xì)胞核內(nèi)。由圖8可知，該蛋白含有RING-HC_RING2結(jié)構(gòu)域和RAWUL_RING2結(jié)構(gòu)域，分別位于47～93位和225～330位氨基酸處。由圖9可知，RING-HC_RING2結(jié)構(gòu)域在鯉魚、斑馬魚、小鼠和人中完全一致(圖9A)，RAWUL_RING2結(jié)構(gòu)域在鯉魚與斑馬魚中存在一個(gè)氨基酸差異，與小鼠和人則存在較多氨基酸的變異(圖9B)。

A：RING-HC_RING2結(jié)構(gòu)域；B：RAWUL_RING2結(jié)構(gòu)域。

2.6 鯉RNF2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)

經(jīng)SOPMA在線程序預(yù)測(cè)可知鯉RNF2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)含有α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲，分別占35.12%、8.63%、0.89%和55.36%(圖10)。利用Pymol軟件基于模板“c2h0dB”進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示鯉RNF2蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)以無(wú)規(guī)則卷曲為主(置信度：99.9%，%i.d.為99%)，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果一致(圖11A)。利用SWISS-MODEL基于模板“2ckl.1.B”對(duì)鯉RNF2蛋白進(jìn)行3D建模，結(jié)果與Pymol軟件預(yù)測(cè)結(jié)果一致(Seq identity為96.23%，圖11B)。

注：h，α-螺旋；e，延伸鏈；t，β-轉(zhuǎn)角；c，無(wú)規(guī)則卷曲

A：由Pymol預(yù)測(cè)所得RNF2蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)；B：由SWISS-MODEL預(yù)測(cè)所得RNF2蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)。

2.7 鯉RNF2底物作用蛋白預(yù)測(cè)

由表4可知，鯉RNF2蛋白與底物IRF4(Interferon regulatory factor 4)、TP53(Tumor protein p53)、HIST2H2AC(組蛋白H2A型2-C型)、H3F3B(組蛋白H3.3)、HIST3H3(組蛋白H3.1t)存在相互作用的置信度較高，分別為0.799、0.797、0.775、0.771、0.771(表4)。

表4 鯉RNF2蛋白泛素化底物預(yù)測(cè)結(jié)果Table 4 Ubiquitination substrate of carp RNF2 protein

2.8 鯉RNF2基因的組織表達(dá)分析

由圖12可知，鯉RNF2基因在鯉各組織中均有表達(dá)，以肌肉組織中顯著最高(P<0.05)；其次是頭腎和肝臟，隨后是腦、心臟、前腸、脾臟、中腸、后腸、皮膚、鰓、腎臟(圖12)。

1.肌肉;2.頭腎;3.肝臟;4.腦;5.心臟;6.前腸;7.脾臟;8.中腸;9.后腸;10皮膚;11.鰓;12.腎臟。不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

3 討論

哺乳動(dòng)物中的研究表明，RNF2具有典型的RING 結(jié)構(gòu)域，可單泛素化組蛋白H2A119位賴氨酸殘基或經(jīng)多聚泛素化介導(dǎo)TP53降解調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、腫瘤遷移等[12-14]。研究還發(fā)現(xiàn)RNF2可通過(guò)STAT1(Signal transducer and activator of transcription1，STAT1)進(jìn)行K33位連接的多聚泛素化來(lái)修飾STAT1的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域K379位點(diǎn)進(jìn)而促進(jìn)STAT1與ISRE(Interferon stimulate response element)的解離，負(fù)向調(diào)控STAT1介導(dǎo)的ISGs轉(zhuǎn)錄表達(dá)[9]。現(xiàn)有研究表明，魚類中同樣存在由STAT1、STAT2和IRF9共同組成的ISGR3(IFN-stimulated gene factor 3，ISGR3)轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體[15-18]。斜帶石斑魚(Orange-spotted grouper,epinepheluscoioides)中過(guò)表達(dá)STAT1a顯著上調(diào)ISGs的表達(dá)[15]。鯽魚(Gibel carp，Carassiusauratus)中STAT1被證明參與IFNa引發(fā)的ISG誘導(dǎo)[16]。大西洋鮭(Atlantic salmon,Salmosalar)中重組蛋白IFNa1刺激下STAT1a磷酸化進(jìn)行核位移[17]。上述研究表明，魚類STAT1在IFN-I信號(hào)通路抗病毒反應(yīng)中同樣重要，研究RNF2泛素化修飾調(diào)控STAT1功能的機(jī)制對(duì)魚類抗病毒反應(yīng)具有重要意義。

與哺乳動(dòng)物相比，魚類因體外受精、胚胎發(fā)育過(guò)程透明可視、RNF2缺失下胚胎可正常形成原腸等而被視為研究RNF2功能的理想對(duì)象。但目前魚類中有關(guān)RNF2功能的研究?jī)H限于突變RNF2后對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育的影響[19-20]，尚無(wú)RNF2對(duì)魚類天然免疫反應(yīng)調(diào)控的報(bào)道。本研究克隆得到全長(zhǎng)1 011 bp、編碼336個(gè)氨基酸的鯉RNF2基因完整CDS區(qū)。核苷酸序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)該基因與鯽RNF2基因具有較高的同源性。生物信息學(xué)分析表明，鯉RNF2蛋白屬穩(wěn)定的、親水性蛋白，不含跨膜結(jié)構(gòu)域和信號(hào)肽，不屬于跨膜蛋白和分泌蛋白。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示鯉RNF2基因在細(xì)胞核中的占比高達(dá)52.2%，推測(cè)鯉該基因主要分布在細(xì)胞核中，這與SIMON等[21]的研究結(jié)果相一致。

結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，RNF2蛋白含有RING-HC_RING2結(jié)構(gòu)域，屬典型的C3HC4型RING結(jié)構(gòu)蛋白，符合動(dòng)物中RNF2蛋白的典型特征[22-23]。結(jié)構(gòu)域相似性分析發(fā)現(xiàn)鯉、斑馬魚、小鼠、智人RNF2蛋白的RING結(jié)構(gòu)域蛋白序列完全一致，該結(jié)構(gòu)域從魚到人演化中的高度保守性說(shuō)明該結(jié)構(gòu)域有重要的生理功能。泛素化底物預(yù)測(cè)結(jié)果表明鯉RNF2蛋白與TP53、組蛋白H2A亞型HIST2H2AC、組蛋白H3亞型H3F3B及HIST3H的相互作用置信度高，這與哺乳動(dòng)物及斑馬魚中報(bào)道的RNF2蛋白的功能作用相一致[19-20]。

底物預(yù)測(cè)結(jié)果還顯示鯉RNF2蛋白與IRF4存在高相互作用置信度。IRF4屬IRF家族成員，既是調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞分化和成熟的關(guān)鍵因子[24-26]，也是介導(dǎo)免疫反應(yīng)的負(fù)調(diào)控因子，可直接結(jié)合ISRE元件上調(diào)ISG60的表達(dá)[27]，與IRF5競(jìng)爭(zhēng)并協(xié)同MyD88負(fù)調(diào)控TLR介導(dǎo)的炎性反應(yīng)[28]或通過(guò)抑制TRAF6(Tumornecrosisfactorreceptorassociatedfactor6)和RICK(Receptorinteractingserine-threoninekinase)Lys63位的多聚泛素化下調(diào)NOD介導(dǎo)的結(jié)腸炎癥反應(yīng)[29]。魚類中，除LI等[30]報(bào)道STAT6和c-Rel(amemberoftheNF-κBtranscriptionfactorfamily)調(diào)控IRF4表達(dá)外，鮮有其他基因?qū)RF4調(diào)控的報(bào)道。本研究預(yù)測(cè)到IRF4為RNF2作用底物，但RNF2與IRF4是否存在作用及其相互作用關(guān)系在魚類抗病毒反應(yīng)中的功能尚需由實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

本研究發(fā)現(xiàn)RNF2基因在鯉不同組織中均有表達(dá)，肌肉、頭腎和肝臟中表達(dá)量最高。鯉魚頭腎是重要的免疫器官，RNF2在頭腎中的高表達(dá)進(jìn)一步提示其可能在魚類免疫反應(yīng)中起到重要作用。

4 結(jié)論

本研究成功克隆得到鯉RNF2基因CDS編碼區(qū)序列1 011 bp，編碼336個(gè)氨基酸。該基因具有高度保守性，與鯽親緣關(guān)系最為接近。鯉RNF2蛋白屬于酸性、穩(wěn)定、親水性蛋白，含有RING-HC_RING2保守結(jié)構(gòu)域，具E3泛素連接酶RING finger家族一般結(jié)構(gòu)域特征；不含跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽，不屬于跨膜蛋白和分泌蛋白，主要分布在細(xì)胞核中。三級(jí)結(jié)構(gòu)以無(wú)規(guī)則卷曲為主，與底物TP53、IRF4、HIST2H2AC、H3F3B、HIST3H3相互作用的置信度較高；鯉RNF2基因在鯉肌肉、頭腎、肝臟中表達(dá)最高。