付彥榮， 劉鳳欒， 李碩， 蘇燕， 董麗， 田代科

(1.北京林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院, 北京 100083； 2.中國科學(xué)院上海辰山植物科學(xué)研究中心,

蓮(Nelumbonucifera)是重要的水生園藝植物，具有觀賞、文化、經(jīng)濟(jì)和生態(tài)等多重價值[1-4]。中國的蓮種質(zhì)資源豐富，尚有野生蓮資源存在[1,5-13]。然而，受城市化、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和環(huán)境污染等人為干擾，以及洪澇等自然災(zāi)害影響，野生蓮居群逐步減少甚至消失[7]。野生蓮居群是蓮的天然基因庫，是蓮種質(zhì)資源開發(fā)利用的基礎(chǔ)和新品種選育的源泉，而翔實(shí)與深入的表型多樣性調(diào)查與分析是充分了解與利用它們的重要方式之一。表型多樣性分析已在南天竹[14]、茶樹[15]、睡蓮[16-17]、蘭花[18-19]、杜鵑[20-21]、牡丹[22]等觀賞植物上廣泛開展，在蓮的栽培品種[23-27]和野生資源中均有應(yīng)用。王其超等[6]對黑龍江東南部野生蓮的葉徑、花徑、瓣徑、瓣數(shù)、雄蕊數(shù)、心皮數(shù)等性狀進(jìn)行了觀測，認(rèn)為這些野生蓮在形態(tài)上基本一致。薛建華[7]對黑龍江全流域的野生蓮進(jìn)行了調(diào)查，對花色、花瓣數(shù)、心皮數(shù)、葉脈數(shù)和種子重量等性狀進(jìn)行了觀測，發(fā)現(xiàn)居群間沒有明顯形態(tài)差異。黑龍江流域野生蓮的心皮數(shù)高于湖北省洪湖野生蓮，但蓮種子形態(tài)未見明顯差異[8]。黑龍江月牙湖、河北白洋淀、山東微山湖、湖北洞庭湖和江西鄱陽湖5個野生蓮種群的蓮子形態(tài)差異較大[9]。詹清華等[9]比較了內(nèi)蒙古敖漢旗、遼寧普蘭店、河北白洋淀、山東微山湖、湖北東湖、湖北洪湖、湖南株洲、廣東三水8個野生種群引種栽培后的形態(tài)性狀，認(rèn)為野生蓮從北向南散布過程中，為了適應(yīng)光照時長變短的環(huán)境改變，葉片有增大的趨勢。據(jù)此，中國北方地區(qū)尤其是黑龍江省的重要野生蓮居群已有較為豐富的表型信息。本研究對更多居群(17個中國北方代表性野生蓮居群)和更全面的性狀(25個表型性狀)進(jìn)行調(diào)查和采集，通過表型多樣性和聚類分析，揭示其表型變異程度，以及表型變異與居群地理分布的關(guān)系等，為野生蓮居群資源保護(hù)和育種利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣本選取

選取中國北方黑龍江、吉林、遼寧、內(nèi)蒙古、河北和山東6省17個野生蓮居群為研究對象(表1)，GPS 測定各居群的經(jīng)度和緯度。于2016年7—8月間，從居群不同部位選取葉和花進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀測。每個居群內(nèi)葉片和花朵的樣本數(shù)分別不少于15個和5個。鑒于蓮較強(qiáng)的無性繁殖能力，地下莖延伸可達(dá)7～12 m[1]，葉片和花朵樣本距離均大于15 m。

表1 17個野生蓮居群的基本信息Table 1 Basic information of 17 wild Asian lotus populations

1.2 表型性狀的選取和觀測

參考孔德政等的方法[22]，《蓮種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》[28]和《植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測試指南 蓮屬》(NY/T2756—2015)[29]，選取反映野生蓮形態(tài)特征且適合野外觀測的25個地上部表型性狀進(jìn)行觀測和記錄。其中，每個樣本的數(shù)量性狀(1～15)均測量3次，取平均值。假質(zhì)量性狀(16～25)參考《植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測試指南 蓮屬》(NY/T2756—2015)進(jìn)行特征描述和數(shù)值化賦值(表2，表5)。

表2 表型性狀觀測方法和賦值Table 2 Observation methods and values assignment phenotypictraits

高度性狀選取最高的立葉或花觀測，長度、寬度、直徑、葉姿、葉色、葉面質(zhì)地、花態(tài)、花瓣形、花瓣色、瓣脈特征等性狀均選取最大的立葉和花(盛開狀態(tài))觀測，花瓣性狀選取最大的花瓣(從外向內(nèi)第11～13片花瓣)觀測，花蕾形、花蕾色、花瓣數(shù)、雄蕊數(shù)、心皮數(shù)、花托形均選取接近開放(所有花被片均未脫落)的花觀測。

1.3 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)

運(yùn)用 Microsoft Excel 2016 和SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

變異系數(shù)CV=(均值/標(biāo)準(zhǔn)差)×100%；

性狀多樣性采用Shannon多樣性信息指數(shù)(Shannon-Weaver diversity indxe，I)

I=-∑PilnPi

式中：Pi為第i種變異類型出現(xiàn)頻率;

居群表型聚類分析采用組間平均連接法，種質(zhì)間距離為歐氏距離[14-16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 北方野生蓮居群數(shù)量性狀多樣性和變異特征

17個野生蓮居群數(shù)量性狀間差異明顯(表3)。15 個數(shù)量性狀的方差(F)值為 2.804～57.706，由大到小依次為花徑>立葉高>花柄高>心皮數(shù)>立葉長>立葉寬>葉柄徑>雄蕊數(shù)>葉脈數(shù)>花柄徑>花瓣長>花柄孔數(shù)>花瓣寬>花瓣數(shù)>葉柄孔數(shù)。

表3 北方野生蓮居群15個數(shù)量性狀的方差分析Table 3 Variance analysis based on 15 quantitative traits of wild Asian lotus populations from northern China

15個數(shù)量性狀在居群間的平均變異系數(shù)為4.97%～26.51%(表4)。葉脈數(shù)、花瓣數(shù)和葉柄孔數(shù)的平均變異系數(shù)均小于10%，分別為4.97%、9.08%和9.55%。立葉長、立葉寬、葉柄徑等9個性狀的平均變異系數(shù)為10%～19%。立葉高、花瓣長和心皮數(shù)的平均變異系數(shù)均大于 20%，分別達(dá)20.16%、20.55%和26.51%。

單個居群內(nèi)的所有數(shù)量性狀的平均變異系數(shù)為5.09%～10.33%(表4)。

表4 北方野生蓮居群15個數(shù)量性狀的變異分析Table 4 Variation analysis for 15 quantitative traits of wild Asian lotus populations from northern China

2.2 北方野生蓮居群假質(zhì)量性狀的變異特征

17個野生蓮居群假質(zhì)量性狀的多樣性較低，居群間表現(xiàn)不一。10個假質(zhì)量性狀的Shannon-Weaver 多樣性指數(shù)I值為0.00～0.81(表5)?；ɡ偕桶昝}特征兩個性狀的I值均為0，分別只有一種性狀表現(xiàn)?；ɡ偕繛榉圩仙昝}特征全部為明顯，且所有居群的表現(xiàn)均相同。葉姿、葉色、葉面質(zhì)地、花態(tài)、花瓣色和花托形6個性狀的I值為0.36～0.68，均有兩種性狀表現(xiàn)且在居群間的分布頻率不同(表5)。多數(shù)居群的葉姿為凹形(70.59%)，少數(shù)為平展(29.41%)；多數(shù)居群的葉色為綠色(58.82%)，少數(shù)為深綠(41.18%)；多數(shù)居群的葉面質(zhì)地為粗糙(68.00%)，少數(shù)為光滑(32%)。多數(shù)居群的花態(tài)為碗狀(70.59%)，少數(shù)為杯狀(29.41%)；多數(shù)居群的花瓣色為粉色(88.24%)，少數(shù)為粉紫色(11.76%)。多數(shù)居群的花托形為倒圓錐形(82.35%)，少數(shù)為喇叭形(17.65%)(表5)?；ɡ傩魏突ò晷蝺蓚€性狀的I值最大，均為0.81，有3種表現(xiàn)。多數(shù)居群的花蕾形為卵形(64.71%)，其次為窄卵形(29.41%)和圓錐形(5.88%)；多數(shù)居群的花瓣形為卵圓形(70.59%)，其次為闊卵圓形(17.65%)和窄卵形(11.76%)(表5)。

表5 北方野生蓮居群假質(zhì)量性狀的分布頻率及多樣性Table 5 Frequency distribution and diversity of pseudo-qualitative traits of wild Asian lotus populations from northern China

2.3 北方野生蓮居群聚類分析

17個野生蓮居群的歐氏距離為1～25?；跉W氏距離的聚類結(jié)果(圖1)顯示，在歐氏距離約25 處，17 個居群大致分為3組，A組包含黑肇源、蒙庫倫、黑撫遠(yuǎn)、黑方正、蒙科爾沁、蒙翁響水、蒙翁寶泉、蒙翁大興、蒙翁白音、黑牡丹江、吉琿春、黑雞西、黑密山、魯濟(jì)寧14個居群，B組包含遼新民和冀安新2個居群，C組僅包含黑虎林居群。A組中，黑密山和魯濟(jì)寧兩個居群各為一支，其他的12個居群在歐氏距離約8處，又分為3個亞組，A1亞組包含黑肇源、蒙庫倫、黑撫遠(yuǎn)、黑方正4個居群，A2亞組包含蒙科爾沁、蒙翁響水、蒙翁寶泉、蒙翁大興、蒙翁白音5個居群。A3亞組包含黑牡丹江、吉琿春和黑雞西3個居群。

圖1 基于歐氏距離的北方野生蓮居群表型性狀聚類分析

17個野生蓮居群的聚類分組結(jié)果與居群的地理分布呈現(xiàn)一定相關(guān)性。A組中，A1、A3亞組多數(shù)為黑龍江和吉林的居群，A2亞組全部為內(nèi)蒙古的居群。冀安新居群歸為B組，與A組居群呈現(xiàn)明顯分化。魯濟(jì)寧雖歸為A組，但單列為一支，表明與同組居群的相似度較低。遼新民和黑虎林兩個居群情況例外，雖然與A組居群地理上相對接近，但未聚為一組。

3 討論與結(jié)論

植物資源的多樣性研究不僅有利于種質(zhì)資源的科學(xué)評價和保存，更有助于挖掘有益種質(zhì)資源，實(shí)現(xiàn)資源創(chuàng)新和科學(xué)利用。植物形態(tài)變異在某種程度上能夠反映遺傳變異的大小。通過形態(tài)學(xué)或表型性狀來檢測植物遺傳變異和分析遺傳多樣性，具有直觀且簡便的優(yōu)點(diǎn)[30-31]。

變異系數(shù)(CV)在某種程度上反映出群體數(shù)量性狀的差異性和多樣性，變異系數(shù)大則分化程度高、多樣性顯著，相反則群體相對穩(wěn)定、變異小、一致性較高。本研究表明，中國北方野生蓮居群數(shù)量性狀的分化程度較低。葉脈數(shù)、花瓣數(shù)、葉柄孔數(shù)的平均變異系數(shù)均小于10%，表明這些性狀分化程度較低，在進(jìn)化過程中比較穩(wěn)定。立葉高、花瓣長和心皮數(shù)的平均變異系數(shù)均大于 20%，表明這些性狀分化程度較高，變異較為明顯。

多樣性指數(shù)反映了假質(zhì)量性狀的多樣性水平。本研究表明，中國北方野生蓮居群的假質(zhì)量性狀多樣性水平總體較低。其中，花蕾色和瓣脈特征2個性狀的多樣性指數(shù)均為0，多樣性極低?；ɡ傩魏突ò晷味鄻有灾笖?shù)值達(dá)0.81，多樣性較高。

相比睡蓮屬[17]、蘭屬[18]、帶葉兜蘭[19]、杜鵑花屬[20]、大白花杜鵑[21]等其他物種而言，北方野生蓮居群的表型多樣性水平總體偏低，且明顯低于蓮品種的多樣性[26-27]，可能與野生種質(zhì)特性有關(guān)，在其繁衍過程中較少受到外來基因的影響，導(dǎo)致性狀分化較小。立葉高、花瓣長、心皮數(shù)、花蕾形、花瓣形等性狀在野生蓮居群間的變異程度較大，且與觀賞性有較強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性，應(yīng)在野生蓮引種和育種利用時重點(diǎn)關(guān)注。

基于歐氏距離，17個北方野生蓮居群被分為3組。聚類結(jié)果與地理距離呈現(xiàn)出一定的相關(guān)性。地理分布接近的居群在聚類圖上也較接近，彼此分化較小，該結(jié)果與董振發(fā)等[5]、王其超等[6]、薛建華[7]的結(jié)論基本一致。黑龍江、吉林，甚至內(nèi)蒙古的野生蓮資源在遺傳上可能無明顯分化。冀安新和魯濟(jì)寧居群與東北地區(qū)居群遺傳上存在分化，可能與遠(yuǎn)距離的地理隔離有關(guān)。黑虎林居群與黑龍江省其他居群發(fā)生分離，可能與其位于黑龍江所有居群最東端且相對孤立的地理區(qū)位特點(diǎn)有關(guān)。王其超等[6]的調(diào)研也發(fā)現(xiàn)，黑虎林居群的葉徑略大于黑龍江東南部其他居群，瓣數(shù)和心皮數(shù)等也略多。冀安新與遼新民聚為一組，聚類結(jié)果與他們的地理分布不一致，可能因?yàn)檫@些居群材料間存在遺傳混雜所致，也可能其中某個居群是很久以前人工引種后，又在當(dāng)?shù)亻L期自然繁衍而成。

表型性狀是基因和外部環(huán)境綜合作用的結(jié)果，特別是數(shù)量性狀，容易受到環(huán)境差異的影響，導(dǎo)致分析結(jié)果發(fā)生偏差。本研究基于表型性狀獲得了對北方野生蓮居群遺傳多樣性的初步認(rèn)識，為野生蓮資源的保護(hù)和育種應(yīng)用提供了參考。以形態(tài)學(xué)分析為基礎(chǔ)，輔助分子標(biāo)記和基因測序等方法，對野生蓮資源的遺傳多樣性開展深入研究，有助于獲得更全面的信息。