王春波， 呂輝， 韋玲冬， 郭治友

(黔南民族師范學(xué)院生物科學(xué)與農(nóng)學(xué)院，貴州 都勻 558000)

茶樹(shù)(Camelliasinensis(L.) O. Kuntze)是山茶科山茶屬常綠植物，被世界上50多個(gè)國(guó)家作為一種重要的經(jīng)濟(jì)作物而廣泛栽培[1-2]。茶葉是世界上最受歡迎的飲料之一，擁有悠久的歷史[3]。茶葉中含有大量的可溶性物質(zhì)，如兒茶素、茶多酚、咖啡堿、茶氨酸、有機(jī)酸和維生素等[4]。因此，長(zhǎng)期飲茶對(duì)健康有很多好處，如抗氧化、抗炎、抗菌、抗癌和降低膽固醇等[5]。根據(jù)制作方法的不同，茶葉又分為紅茶、綠茶、烏龍茶、黑茶、白茶和黃茶等不同種類[6]。近年來(lái)，隨著人們健康生活水平的逐漸提高，茶葉的品質(zhì)也越來(lái)越受到關(guān)注。茶葉品質(zhì)的主要影響因素包括遺傳背景，采摘季節(jié)，樹(shù)葉的分類、處理和儲(chǔ)存等，其中與生長(zhǎng)環(huán)境的關(guān)系最為密切[7]?；诖?，區(qū)分出不同產(chǎn)地的茶葉對(duì)于其品質(zhì)的控制極其重要。

代謝組學(xué)是目前發(fā)展比較快速的一門新興學(xué)科，在小分子分析方面具有很大的優(yōu)勢(shì)[8]。代謝組學(xué)分析就是對(duì)生物樣本中所有低分子質(zhì)量代謝產(chǎn)物進(jìn)行定性和定量分析，并鑒定出具有重要生物學(xué)意義的組間顯著差異代謝物，以及闡明這些差異物的生理過(guò)程和代謝機(jī)制[9-10]。目前，研究代謝組的方法很多，其中超高效液相色譜-四級(jí)桿串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)因具有高通量和高靈敏度的特性，被廣泛用于茶葉代謝物的測(cè)定[11-13]。

都勻毛尖是中國(guó)十大名茶之一，由毛澤東親自命名[14]。其外形卷曲纖細(xì)、披毫、條索緊結(jié)，顧又名“白毛尖”“細(xì)毛尖”和“魚(yú)鉤茶“等[15]。1915年，都勻毛尖茶在巴拿馬榮獲國(guó)際食品博覽會(huì)優(yōu)質(zhì)獎(jiǎng)[16]。都勻毛尖野生茶樹(shù)主要分布于貴州省黔南州都勻市和貴定縣等地。這里的茶樹(shù)種質(zhì)資源豐富，不僅生產(chǎn)性狀優(yōu)異，而且也是優(yōu)良的茶樹(shù)育種原始材料[17]。但是，近些年來(lái)在市場(chǎng)上頻繁出現(xiàn)都勻毛尖茶品質(zhì)參差不齊的現(xiàn)象，直接影響其產(chǎn)品銷售和品牌推廣。鑒于此，本研究利用代謝組學(xué)分析不同產(chǎn)地都勻毛尖茶的代謝差異，旨在為茶葉產(chǎn)地溯源和品質(zhì)控制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

都勻毛尖新鮮茶樹(shù)葉片樣品于2020年3月份分別采自主產(chǎn)地貴定縣云霧山、都勻小圍寨團(tuán)山和都勻毛尖鎮(zhèn)螺絲殼。每個(gè)產(chǎn)地采集樣品7個(gè)，共21個(gè)茶樹(shù)葉片樣品(表1)。所有樣品經(jīng)郭治友教授鑒定為都勻毛尖茶本地種。

表1 樣品信息Table 1 The information of samples

甲醇、乙腈、乙酸銨和氨水均為色譜純，購(gòu)自德國(guó)Merck公司。

1.2 儀器與設(shè)備

D24 UV純水儀：德國(guó)Merck Millipore公司；JXFSTPRP-24型研磨儀：上海凈信科技有限公司；BSA124S-CW型天平：德國(guó)賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；TripleTOF 4600型四極桿串聯(lián)飛行時(shí)間高分辨質(zhì)譜儀：美國(guó)AB SCIEX公司；Agilent 1290超高效液相色譜儀：美國(guó)安捷倫公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備 每個(gè)茶樹(shù)稱取50 mg研磨成粉的葉片樣品，加入300 μL甲醇，勻漿破碎2 min，然后冰水浴中超聲提取5 min，-20 ℃靜置2 h，4 ℃ 13 000 r·min-1離心15 min，取200 μL上清液進(jìn)樣。取等量的各待測(cè)樣本進(jìn)行混合，作為質(zhì)控樣本。

1.3.2 色譜條件 色譜柱為UPLC HSS T3 (1.7 μm, 100 mm×2.1 mm)，流動(dòng)相A：0.1%甲酸水溶液；流動(dòng)相B：乙腈溶液。流速：0.35 mL·min-1；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：2 μL。優(yōu)化的色譜梯度為：0～2 min，5% B；2～10 min，5%～95% B；10～15 min，95% B；15～18 min，95%～5% B。

1.3.3 質(zhì)譜條件 質(zhì)譜以正、負(fù)離子兩種模式運(yùn)行。優(yōu)化的參數(shù)條件如下：ESI離子源噴霧電壓：3 800 V(正離子模式)或-3 100 V(負(fù)離子模式)；毛細(xì)管溫度：320 ℃；鞘氣流速：45 PSI；輔助氣流速：15 PSI；掃描范圍：70～1 000 m/z；一級(jí)分辨率：70 000 FWHM；二級(jí)分辨率：17 500 FWHM；分步碰撞能量的強(qiáng)度取值：3；分步碰撞能量：20 eV, 40 eV, 60 eV；掃描速率：7 Hz。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理與分析 代謝物定性分析采用METLIN數(shù)據(jù)庫(kù)和XCMS軟件，首先利用agilent masshunter qualitative analysis B.08.00軟件(agilent technologies, USA)將原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成通用(mz.data)格式[18]。在R軟件平臺(tái)下，使用XCMS程序包進(jìn)行峰的識(shí)別，保留時(shí)間校正，自動(dòng)積分等預(yù)處理。接著進(jìn)行內(nèi)標(biāo)歸一化和質(zhì)量歸一化，得到一個(gè)包含樣品名，m/z-RT對(duì)，峰面積的可視化矩陣[19]。然后將編輯后的數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入Simca-P 14.0軟件,對(duì)代謝物進(jìn)行定量分析，完成中心化和Pareto標(biāo)度化后，進(jìn)行主成分分析(principal component analysis，PCA)和正交偏最小二乘判別分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA)來(lái)篩選顯著差異代謝物[20]。同時(shí)，利用MeV 4.9軟件對(duì)差異代謝物進(jìn)行熱圖分析[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同產(chǎn)地都勻毛尖茶代謝產(chǎn)物的鑒定結(jié)果

采用UPLC-QTOF-MS技術(shù)分析了不同產(chǎn)地都勻毛尖茶的代謝產(chǎn)物，結(jié)果在正離子和負(fù)離子模式下同時(shí)與一級(jí)m/z和碎片離子(二級(jí))m/z數(shù)據(jù)庫(kù)匹配到的代謝物分別為237和164個(gè)。圖1中的A和B是在質(zhì)譜ESI+和ESI-條件模式下掃描的基峰圖。從圖1中可以看出,正離子模式下在0.4～1和2.5～4 min時(shí)物質(zhì)相對(duì)豐度最高，負(fù)離子模式在0.2～1,2.7～4和8～11 min時(shí)物質(zhì)相對(duì)豐度最高。這表明不同離子模式下的出峰數(shù)量和相對(duì)豐度存在一定的差異。

2.2 多元統(tǒng)計(jì)分析

A：正離子模式；B：負(fù)離子模式。A: Positive ion mode; B: Negative ion mode.圖1 樣品基峰圖

另外，主成分分析也可以反映物質(zhì)豐度的分布情況，物質(zhì)含量差異越大的樣品距離越遠(yuǎn)，反之則越近。在正離子模式下，小圍寨團(tuán)山樣品主要分布在主成分1的負(fù)軸和主成分2的正軸位置，而貴定云霧山樣品主要分布在主成分1的正軸和主成分2的負(fù)軸位置，毛尖鎮(zhèn)螺絲殼樣品分布在二者之間(圖2A)。負(fù)離子模式下，小圍寨團(tuán)山樣品主要分布在主成分1的正軸和主成分2的正軸位置，而貴定云霧山樣品主要分布在主成分1的負(fù)軸和主成分2的負(fù)軸位置，毛尖鎮(zhèn)螺絲殼樣品同樣分布在二者之間(圖2B)。在2種模型下,小圍寨團(tuán)山樣品和貴定云霧山樣品之間的距離都是最遠(yuǎn)。這表明這2個(gè)地區(qū)間的樣品含有的代謝物差異性最大，而毛尖鎮(zhèn)螺絲殼樣品與二者之間的代謝差異相對(duì)較小。

GD：貴定云霧山樣品；XWZ：小圍寨團(tuán)山樣品；MJ：毛尖鎮(zhèn)螺絲殼樣品。

2.3 差異代謝物分析

OPLS-DA載荷圖見(jiàn)圖3。它可以比較直觀地呈現(xiàn)出樣品間的顯著差異代謝物，其中的每個(gè)點(diǎn)分別代表相應(yīng)的代謝物，距離原點(diǎn)越近的點(diǎn)即為每個(gè)樣品都含有的通用代謝物。與此相反，離原點(diǎn)越遠(yuǎn)比較分散的點(diǎn)為篩選出的顯著差異代謝物。本研究分別對(duì)正離子和負(fù)離子模式下鑒定到的代謝物進(jìn)行差異性篩選，標(biāo)準(zhǔn)為VIP≥1，P<0.05和FC≥2或FC≤-2。結(jié)果共篩選到6種顯著差異代謝物，其中正離子模式下篩選到3種，分別為咖啡堿(caffeine)、茶沒(méi)食子素(theogallin)和表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(epigallocatechin 3-O-gallate)。負(fù)離子模式下篩選到3種，分別為檸檬酸鹽(citrate)、兒茶素(epicatechin)和奎尼酸(quinic acid)(表2，圖3)。

表2 不同產(chǎn)地茶樹(shù)樣品間的差異代謝物

圖3 正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)載荷圖Fig.3 Loading plot of orthogonal least squares discriminant analysis (OPLS-DA)

此外，根據(jù)6種差異代謝物的相對(duì)豐度進(jìn)行了熱圖分析(圖4)。紅色表明代謝物相對(duì)豐度高于平均水平，藍(lán)色表明代謝物相對(duì)豐度低于平均水平。結(jié)果顯示，咖啡堿、茶沒(méi)食子素和表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯在小圍寨團(tuán)山產(chǎn)地的茶葉中含量較高，檸檬酸鹽在毛尖鎮(zhèn)螺絲殼產(chǎn)地茶葉中含量顯著，而兒茶素和奎尼酸在貴定云霧山產(chǎn)地的茶葉中含量較高(圖5)。

注：GD：貴定云霧山樣品；XWZ：小圍寨團(tuán)山樣品；MJ：毛尖鎮(zhèn)螺絲殼樣品。

GD：貴定云霧山樣品；XWZ：小圍寨團(tuán)山樣品；MJ：毛尖鎮(zhèn)螺絲殼樣品。

3 結(jié)論與討論

采用代謝組學(xué)技術(shù)分析了不同產(chǎn)地都勻毛尖茶的代謝差異，結(jié)果表明,小圍寨團(tuán)山樣品和貴定云霧山樣品之間的差異最大，而毛尖鎮(zhèn)螺絲殼茶樹(shù)樣品與二者之間的差異相對(duì)較小。此外，利用多元統(tǒng)計(jì)方法成功篩選出6種差異顯著的產(chǎn)地標(biāo)志物。其中，兒茶素和奎尼酸在貴定云霧山產(chǎn)地的茶樹(shù)樣品中含量較高，咖啡堿、茶沒(méi)食子素和表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯在小圍寨團(tuán)山產(chǎn)地的樣品中含量顯著，而檸檬酸鹽在毛尖鎮(zhèn)螺絲殼產(chǎn)地茶樹(shù)樣品中含量較高。這些顯著差異代謝物可以為都勻毛尖茶的產(chǎn)地區(qū)分提供理論依據(jù)。

表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯，表兒茶素和茶沒(méi)食子素屬于茶多酚類物質(zhì)，是茶葉的主要成分，其含量多少影響了茶葉的色、香、味，也就直接決定了茶葉的品質(zhì)。一般茶多酚含量越高，茶品質(zhì)越好[22]。但是，過(guò)多的茶多酚會(huì)使得茶葉苦澀味較重，這就需要氨基酸的酸味和糖的甜味等來(lái)協(xié)調(diào)這種苦澀味。本研究中篩選到的奎尼酸參與苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸代謝途徑，檸檬酸鹽參與到丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝途徑中，這2種物質(zhì)含量的多少會(huì)影響到氨基酸的生物合成，間接影響到茶葉的味道和品質(zhì)[23]。

另外，檸檬酸鹽也是三羧酸循環(huán)(TCA循環(huán))中的關(guān)鍵產(chǎn)物。TCA循環(huán)是能量代謝的主要途徑，其代謝通路包含許多影響茶葉品質(zhì)和滋味的物質(zhì)，如琥珀酸、琥珀酰輔酶、酮戊二酸和谷氨酸等。這些物質(zhì)也是茶葉鮮味和酸味的主要來(lái)源，檸檬酸含量的多少直接決定著這些酸類物質(zhì)的積累，進(jìn)一步影響茶葉的鮮味和酸味[24]?？Х葔A是形成茶湯爽口感的重要物質(zhì)，約占茶葉干質(zhì)量的2%～5%，較少含量的咖啡堿可以進(jìn)一步減少茶多酚的苦澀味，并且咖啡堿本身可以與茶湯中的兒茶素和茶黃素等物質(zhì)絡(luò)合成大分子析出，從而影響茶湯的味道[25]。