王寧， 姚晨， 賈瑞， 李本銀， 馬詩毓， 馬闖， 張世敏， 李烜楨

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，河南 鄭州 450002；3.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河南 鄭州 450002；4.鄭州輕工業(yè)大學(xué)材料與化學(xué)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002)

鎘(Cd)被農(nóng)作物吸收后通過食物鏈傳遞,對人和動物的生命健康構(gòu)成嚴重威脅，直接影響中國的糧食安全。據(jù)《全國土壤污染狀況調(diào)查公報》顯示，中國土壤污染總超標率達16.1%，耕地土壤重金屬點位超標率19.4%，Cd點位超標率7.0%，占無機污染物之首[1]。植物對Cd的吸收依賴于Cd在土壤中的形態(tài)，了解Cd在土壤中的轉(zhuǎn)化過程，是治理Cd污染的重要前提。土壤微生物直接或間接參與土壤中重金屬的活化和固定，同時在植株根系生長發(fā)育過程中起著十分重要的作用，對土壤有機物質(zhì)的降解轉(zhuǎn)化、土壤肥力的保持等均有較大影響[2]。土壤微生物通過引起土壤pH值降低、氧化還原電位改變及螯合劑釋放等[3]使Cd活化，而Cd有效性降低則通過微生物介導(dǎo)的生物沉淀或吸附等過程實現(xiàn)[4-5]。另外，植物根系分泌物、代謝物提供各種營養(yǎng)和能量作用于微生物，進而以植物特有的方式影響微生物種群[6]。土壤微生物群落是指多種因素作用下，一定面積土壤中的細菌、真菌等構(gòu)成的生物群體，其種群數(shù)量、區(qū)系組成和生物活性等與土壤類型、氣候和植被等密切相關(guān)，同時也受重金屬脅迫的影響[7-9]。因此，在面對耕地資源短缺及Cd污染嚴重的情況下，了解根系微生物參與Cd在土壤中轉(zhuǎn)化及植物根系吸收的機制十分重要。目前，關(guān)于Cd脅迫下水稻的根際微生物群落結(jié)構(gòu)研究較多，而對小麥的研究甚少。HOU等[10]發(fā)現(xiàn)，Cd脅迫可以減少水稻根際土壤細菌的多樣性并改變其菌落結(jié)構(gòu)，且在水稻根際高度富集了多種直接或間接活化Cd的菌種。因此，本研究采用盆栽方式種植小麥，利用16S rRNA基因擴增子測序技術(shù)，研究Cd脅迫對苗期小麥的生長和Cd吸收，以及對根際土壤細菌群落特征的影響，以期了解Cd脅迫下小麥吸收和積累Cd與根際細菌群落組成的關(guān)系，為治理土壤Cd污染提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試土壤和小麥品種

供試土壤采自河南農(nóng)業(yè)大學(xué)科教園區(qū)，自然風(fēng)干2.0 mm篩網(wǎng)過篩。土壤pH值8.5，土壤Cd含量為0.1 mg·kg-1，低于《土壤環(huán)境質(zhì)量 農(nóng)用地土壤污染風(fēng)險管控標準(試行)》(GB 15618—2018)[11]篩選值(pH值>7.5，Cd含量<0.6 mg·kg-1)。供試小麥種子品種為豫保1號，購于河南秋樂種業(yè)科技股份有限公司。

1.2 盆栽試驗

本研究模擬河南省某地受電池廠廢液污染的Cd含量2.0 mg·kg-1的土壤現(xiàn)狀，在口徑210 mm的塑料花盆中加入供試土壤和CdCl2(分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，采用干混法混勻至土壤中Cd含量2.0 mg·kg-1，總質(zhì)量1 kg。設(shè)置2個處理，對照處理CK為供試土壤，土壤Cd含量為0.1 mg·kg-1；T處理為外源Cd脅迫土壤，土壤Cd含量為2.0 mg·kg-1，每個處理進行4個平行試驗。

小麥種子在25 ℃下避光育種，3 d后移栽至花盆中，水分含量為土壤田間最大持水量的60%，苗期50 d后收獲小麥和根際土壤。將小麥樣品用高通量組織研磨儀(TL2020，北京鼎昊源科技有限公司)粉碎，采用四分法取樣,測小麥地上部、地下部Cd含量[12]。土壤樣品一部分于-80 ℃保存，用于細菌16S rRNA基因高通量測序分析；另一部分自然風(fēng)干保存，用于理化性質(zhì)分析。

1.3 分析方法

1.3.1 土壤及小麥理化指標測定 小麥干質(zhì)量測定：將種植50 d的小麥烘干至恒質(zhì)量放置電子天秤(JEA502，上海浦春計量儀器有限公司)稱質(zhì)量；土壤pH值測定：參照李強[13]的方法對土壤進行處理，用pH計(雷磁PHS-25，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)進行測定；土壤有效態(tài)Cd含量測定：采用DTPA浸提法[14]，用E-Max熒光重金屬分析儀測定(E-max500，美國XOS公司)；小麥Cd含量測定：將種植50 d的小麥烘干經(jīng)研磨儀粉碎后，用E-Max熒光重金屬分析儀測定。

小麥地上部Cd吸收總量=小麥地上部Cd含量×地上部生物量

(1)

小麥地下部Cd吸收總量=小麥地下部Cd含量×地下部生物量

(2)

重金屬富集系數(shù)(bioaccumulation factor,BCF)=植物中重金屬含量/土壤中重金屬含量

(3)

重金屬轉(zhuǎn)移系數(shù)(transfer factor,TF)=地上部重金屬含量/地下部重金屬含量

(4)

1.3.2 土壤總DNA的提取、PCR擴增及Illumina測序 將種植50 d的小麥根際土壤DNA采用土壤DNA提取試劑盒(PowerSoil?DNA Isolation kit，德國MO BIO公司)提取。PCR 擴增采用16S rRNA基因 V3-V4 可變區(qū)的細菌通用引物341F/806R進行目的基因擴增。將PCR 擴增后的目的條帶回收，送至北京諾禾致源科技股份有限公司利用 Illumina NovaSeq 測序平臺進行16S rRNA基因序列測定。

1.3.3 高通量測序分析 根據(jù)各樣本所擴增的16S區(qū)域特點，構(gòu)建小片段文庫，基于Illumina NovaSeq測序平臺對該文庫進行雙末端測序。測序得到的原始數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制，再將得到的有效數(shù)據(jù)以序列97%的相似度劃分為多個操作分類單元(operational taxonomic units，OTUs)，基于OTUs水平繪制稀疏曲線并進行物種注釋及分析物種豐度指數(shù)(ACE和Chao1指數(shù))、多樣性指數(shù)(Shannon指數(shù))和非度量多維尺度(non-metric multidimensional scaling, NMDS)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 8、Microsoft Excel 2007和SPSS 19.0進行統(tǒng)計分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cd脅迫對苗期小麥干質(zhì)量的影響

Cd脅迫對苗期小麥干質(zhì)量的影響如圖1所示。經(jīng)過50 d的培養(yǎng)，T處理顯著降低了小麥地上部和地下部干質(zhì)量(P<0.05)，分別由1.5、0.7 g降低至1.4、0.5 g，分別降低了7.46%和28.73%，表明Cd脅迫可抑制小麥的生長。

注：小寫字母標注的統(tǒng)計分析是針對相同取樣部位不同處理之間，不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

2.2 Cd脅迫對苗期小麥Cd吸收的影響

Cd脅迫對種植50 d的苗期小麥Cd吸收的影響如圖2和圖3所示。Cd脅迫下小麥地下部、地上部Cd含量和吸收總量較對照均顯著增大(P<0.05)。T處理中小麥地上部和地下部Cd含量分別達到3.7、6.3 mg·kg-1，為CK的16.3倍和10.5倍；地上部和地下部Cd吸收總量分別達到5.1、3.0 μg，為CK的15.2倍和7.6倍。此外，CK和T處理中地下部Cd含量分別是地上部的2.7倍和1.7倍，表明地下部較地上部積累Cd含量更高。T處理中地下部和地上部BCF較CK顯著降低(P<0.05)，分別由5.2和2.0降至3.0和1.8，降低了41.4%和9.0%，而TF較對照由0.4提高至0.6，升高了48.61%。這表明外源Cd的脅迫會減弱小麥的BCF，但增強小麥的TF。

圖2 Cd脅迫下小麥Cd含量(A)及吸收總量(B)

注：小寫字母標注的統(tǒng)計分析是針對不同處理間，不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

2.3 Cd脅迫對苗期小麥根際pH值和有效Cd含量的影響

Cd脅迫對種植50 d的苗期小麥根際土壤pH值和有效Cd含量的影響如圖4所示。外源Cd明顯使得土壤有效Cd的含量增加，且使土壤pH值有下降趨勢。T處理中pH值較CK由8.6降至8.5，但有效Cd含量較CK顯著增加(P<0.05)，由0.06 mg·kg-1增加至1.7 mg·kg-1，增加了29.7倍。

圖4 Cd脅迫下小麥根際土壤pH值(A)及有效Cd含量(B)

2.4 Cd脅迫對苗期小麥根際細菌群落多樣性及結(jié)構(gòu)的影響

基于Illumina Nova 測序平臺，經(jīng)PCR-free文庫構(gòu)建后，進行雙末端測序和片段拼接。平均每樣品測得80 564條序列，經(jīng)過質(zhì)控平均得到74 580條有效數(shù)據(jù)，質(zhì)控有效數(shù)據(jù)量達49 016，質(zhì)控有效率達61.9%。以序列97%的相似度劃分，共得到3 332個OTUs。稀疏曲線是比較測序數(shù)量不同的樣本物種的豐富度并評估樣本的取樣大小是否合理，如圖5所示，該曲線趨于平緩，說明測序深度已經(jīng)基本覆蓋到樣品的所有物種，測序數(shù)據(jù)量足以反映樣品中的物種多樣性。

圖5 OTU稀疏曲線

對土壤細菌群落的Alpha多樣性指數(shù)進行分析結(jié)果如圖6所示。T處理菌群豐度指數(shù)(Ace和 Chao1指數(shù))較CK分別由2 624和2 568增至2 789和2 732，分別增大了5.9%和6.0%，這表明Cd脅迫可以使根際土壤細菌物種數(shù)量增多。此外，T處理菌群Shannon指數(shù)較CK增大了0.6%，這表明Cd脅迫下，根際土壤細菌物種有更大的均勻度，提高了土壤細菌群落的多樣性。

圖6 Cd脅迫下小麥根際土壤細菌豐度指數(shù)和多樣性指數(shù)

NMDS是基于Bray-Curtis距離來進行分析的非線性模型，根據(jù)樣本中包含的物種信息，以點的形式反映在二維平面上。如果樣本的群落組成越相似，則在NMDS圖中的距離越接近，其中Stress值代表細菌菌落相似性分離程度，判斷該圖是否可以準確反映數(shù)據(jù)排序的真實分布，Stress值要求小于0.1。為了能夠直觀地看出Cd脅迫下土壤細菌群落組成結(jié)構(gòu)的差異，繪制基于OTU水平的NMDS分析圖，其Stress值為0.011。如圖7所示，T處理分布在第一、二象限，而CK分布在第三、四象限，各個處理有較好的聚集性，因此，Cd脅迫可以改變土壤細菌群落結(jié)構(gòu)。

圖7 不同Cd處理下小麥根際土壤細菌群落NMDS分析

通過與數(shù)據(jù)庫Silva132比對，進行物種注釋，結(jié)果如圖8所示。選取門水平相對豐度排名前10的物種生成物種相對豐度柱形堆疊圖，觀察CK和T處理在門水平相對豐度較高的物種及比例。不同處理間各物種相對豐度無明顯變化，相對豐度最大的3個門依次為變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)。與CK相比，T處理中變形菌門(Proteobacteria)相對豐度有所增加，而放線菌門(Actinobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)的相對豐度有所減少。

在屬水平上，選取相對豐度排列前30位的菌屬進行分析，發(fā)現(xiàn)各處理共有相對豐度>1%的菌屬分別是鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、unidentified_Acidobacteria、溶桿菌屬(Lysobacter)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、脫硫微菌屬(Desulfomicrobium)、Gaiella、單胞菌屬(Arenimonas)、Dongia、unidentified_Gammaproteobacteria。與對照相比，鞘氨醇單胞菌屬、unidentified_Acidobacteria、溶桿菌屬、芽孢桿菌屬、Gaiella、單胞菌屬、unidentified_Gammaproteobacteria等相對豐度有所減少，脫硫微菌屬、Dongia等有所提高。在相對豐度排列前30且<1%的菌屬分別是斯科曼氏球菌屬(Skermanella)、脫硫葉菌屬(Desulfobulbus)、Haliangium、芽孢菌屬(Blastococcus)、節(jié)細菌屬(Arthrobacter)、Acidibacter、Candidatus_Alysiosphaera、類諾卡氏菌屬(Nocardioides)、索利魯布羅菌屬(Solirubrobacter)、交替赤桿菌屬(Altererythrobacter)、Iamia、壤霉菌屬(Agromyces)、鏈球菌屬(Streptococcus)、氣微菌屬(Aeromicrobium)、Steroidobacter、微小桿菌屬(Microvirga)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、Stenotrophobacter、水沉積物桿菌屬(Ilumatobacter)、羅氏菌屬(Rothia)、馬賽菌屬(Massilia)。與對照相比，斯科曼氏球菌屬(Skermanella)、芽孢菌屬、節(jié)細菌屬、Candidatus_Alysiosphaera、類諾卡氏菌屬、索利魯布羅菌屬、交替赤桿菌屬、壤霉菌屬、微小桿菌屬、Stenotrophobacter、水沉積物桿菌屬、馬賽菌屬等有所減少。脫硫葉菌屬、Haliangium、Acidibacter、Iamia、鏈球菌屬、氣微菌屬、Steroidobacter、鏈霉菌屬、羅氏菌屬等有所增加。

圖8 Cd脅迫對小麥根際土壤細菌門水平(A)和屬水平(B)的影響

如圖9所示，在相對豐度排列前30的菌屬中，顯著差異的分別是脫硫微菌屬、Stenotrophobacter、Acidibacter以及鏈球菌屬。脫硫微菌屬、Acidibacter、鏈球菌屬等較CK顯著增加(P<0.05),而Stenotrophobacter等較CK顯著降低(P<0.05)，這表明外源Cd的脅迫影響了小麥土壤根際細菌群落。

圖9 Cd脅迫對小麥根際土壤典型菌屬相對豐度的影響

3 結(jié)論與討論

通過對Cd脅迫下小麥對Cd的吸收和積累的研究發(fā)現(xiàn)，Cd脅迫會降低小麥的生物量。聶勝委等[15]在研究重金屬脅迫對小麥生長的影響及閾值的過程中發(fā)現(xiàn)，當Cd脅迫超過1.3和1.8 mg·kg-1時，則會抑制鄭麥9023和小偃22的小麥生物量。本研究結(jié)果顯示，Cd含量在2.0 mg·kg-1時造成小麥生物量的減少，推測是因為Cd脅迫使根系細胞分裂紊亂，細胞結(jié)構(gòu)遭到破壞，進而影響到小麥的正常生長[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，添加外源Cd可以促進小麥對Cd的吸收和積累，推測是由于在Cd脅迫下，小麥的根際微生物分泌大量有機酸，溶解難溶性Cd，并與Cd結(jié)合形成易于小麥吸收的形態(tài)，這與張丙春等[17]研究結(jié)果相似。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)CK和T處理中地下部較地上部積累的Cd含量更高，推測是由于根部皮層細胞吸收的Cd與根內(nèi)多糖、蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)形成絡(luò)合物或有機大分子沉淀物，使其不易向上運輸[18]。與CK相比，T處理中小麥地上部和地下部BCF都有所降低而TF有所升高，表明在外源Cd的添加下會降低小麥各部位對Cd富集的能力，但會提高Cd從地下部向地上部的轉(zhuǎn)運能力，這與孫聰?shù)萚19]研究結(jié)果相似。本研究還發(fā)現(xiàn)，外源Cd的添加明顯使得小麥根際土壤有效Cd的含量增加，且使土壤pH值有下降的趨勢，推測是因為Cd脅迫下小麥根際微生物分泌大量有機酸使土壤pH值下降，進而使土壤有效Cd含量顯著增大。土壤有效Cd含量的增加和pH值降低可能是造成小麥Cd積累的重要原因。范洪黎等[20]研究表明，Cd脅迫誘導(dǎo)2個品種莧菜根系分泌的各種有機酸數(shù)量隨供Cd量的增加而增加。王玉云等[21]在研究中發(fā)現(xiàn)，在一定閾值內(nèi)水稻根系有機酸的分泌量與Cd積累量呈正相關(guān)。另外，HOU等[10]在研究Cd脅迫下不同水稻品種根際細菌群落特異性反應(yīng)中發(fā)現(xiàn)高積累品種根際硫桿菌屬(Thiobacillus)豐度增加，且其具有活化Cd和產(chǎn)酸能力。

微生物的生長易受外界環(huán)境干擾，不適應(yīng)的微生物數(shù)量下降,適應(yīng)生長的微生物數(shù)量增大并積累，從而使微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，Cd脅迫下增加了小麥根際土壤的細菌多樣性并明顯改變了細菌群落結(jié)構(gòu)。一方面是在Cd脅迫下，小麥通過根系分泌有機酸等物質(zhì)來提高土壤中Cd的有效性，而有機酸對根際土壤微生物的多樣性和豐富度有顯著影響，能夠改變菌群的種類和數(shù)量。另一方面，Cd有效性的提高也會使耐受性低的微生物數(shù)量下降，同時土壤中有效態(tài)Cd含量增大改變了小麥土壤酶活和小麥根際代謝產(chǎn)物。BAATH等[23]研究發(fā)現(xiàn)，少量的Cd和Zn可以促進土壤呼吸，推測是土壤微生物在重金屬脅迫下做出的應(yīng)激反應(yīng)。在屬水平相對豐度前30的菌屬中，鏈球菌屬、Acidibacter、脫硫微菌屬等在T處理中相對豐度較CK顯著增大。Stenotrophobacter等在CK中相對豐度較T處理顯著增大，且鞘氨醇單胞菌屬等在CK中相對豐度較T處理也有所增加。鏈球菌可以利用根系分泌的簡單糖類進行產(chǎn)酸[24]，推測這是造成Cd脅迫小麥根際土壤pH值下降，并造成有效Cd含量增大的重要原因。Acidibacter是可以分解蛋白和攝取周圍環(huán)境酸性物質(zhì)的菌屬[25]。丁翠等[26]在研究中發(fā)現(xiàn)，在重度酸性礦山廢水污染下可以顯著改變土壤pH,且可以極大地豐富Acidibacter。因此，本研究推測小麥根際土壤有效Cd含量的增大和酸化是使Acidibacter含量增大的重要原因。另外，脫硫微菌屬在T處理中的豐度顯著大于CK。脫硫微菌是硫酸鹽還原菌，具有還原硫酸根為硫離子進而鈍化Cd的功能，而本研究中該菌在Cd脅迫下大量增殖，其機理尚需進一步探討。鞘氨醇單胞菌可以在植物根際分泌糖類和吲哚乙酸等生長激素，促進植物吸收和生長[27-28]。本研究中，鞘氨醇單胞菌在CK中的相對豐度有所提高，可能是造成CK較Cd脅迫下生物量增加的重要原因。Stenotrophobacter是革蘭氏陰性菌，目前鮮有對此菌功能的研究。綜上所述，在外源Cd脅迫下小麥根際土壤微生物豐度和多樣性均有所上升，細菌群落結(jié)構(gòu)的變化與小麥根際土壤pH值和有效Cd含量有關(guān)。