周訓璽，彭敏，賀曉琪，孫國強

越來越多的研究顯示，異常表達的微小RNA（microRNA，miRNA，miR）可通過影響腫瘤細胞的生物學行為參與子宮內膜癌細胞的發(fā)生發(fā)展。miR-373是miR-371-372-373家族成員，定位于人19q13.42染色體上，在皮膚鱗狀細胞癌和非小細胞肺癌等腫瘤中常見異常表達，且可通過影響細胞生物學功能在腫瘤惡性進展中發(fā)揮著癌基因或抑癌基因的作用。同源異型盒基因B3（HOXB3）是同源異型盒基因（HOX基因）家族成員，被證實在結直腸癌和胰腺癌等腫瘤中異常表達，通過影響細胞增殖、遷移和凋亡等參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。miR-373在子宮內膜癌組織中異常高表達，與腫瘤分期、分化程度、淋巴結轉移等緊密相關，且對癌細胞增殖、侵襲和遷移具有促進作用；然而，miR-373影響子宮內膜癌生物學行為的作用機制并不完全清楚。HOXB3被證實在子宮內膜癌組織中低表達，發(fā)揮抑癌作用。本研究通過生物信息學軟件預測發(fā)現miR-373與HOXB3 3’非編碼區(qū)（Untranslated Region，UTR）存在互補結合位點，猜測miR-373可能通過靶向HOXB3調控子宮內膜癌發(fā)生發(fā)展。因此，本研究從2018年2月至2019年6月，開展體外細胞實驗旨在觀察miR-373通過靶向調控HOXB3對子宮內膜癌Ishikawa細胞增殖、侵襲和凋亡的調控作用，以期為子宮內膜癌的發(fā)病機制和治療提供新線索。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人子宮內膜癌細胞株Ishikawa（上海復祥生物公司），胎牛血清和胰蛋白酶（美國Gibco公司），青霉素-鏈霉素雙抗、脂質體2000和Trizol試劑（美國Invitrogen公司），HOXB3抗體（美國Abcam公司），miR-373抑制劑（inhibitor）及抑制劑陰性對照（inhibitor-NC）（上海吉瑪公司），HOXB3 siRNA及其陰性對照NC siRNA（美國SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY公司），psiCHECK2熒光素酶載體（西安賽拓博泰生物公司）。逆轉錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒（大連Takara公司）。Transwell小室（美國Corning公司），膜聯(lián)蛋白V-FITC（Annexin V-FITC）/碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）細胞凋亡檢測試劑盒（美國BD公司），細胞計數（Cell Counting Kit-8，CCK-8）試劑盒（上海碧云天公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)、分組和轉染

采用含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗的洛斯維公園紀念研究所（Roswell Park Memorial Institute，RPMI）-1640培養(yǎng)基在濕度飽和、37℃、5%二氧化碳常規(guī)條件的二氧化碳細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)Ishikawa細胞。實驗分為inhibitor-NC組（轉染inhibitor-NC）、miR-373 inhibitor組（轉染miR-373 inhibitor）、miR-373 inhibitor+siNC組（共轉染miR-373 inhibitor和NC siRNA）和miR-373 inhibitor+siHOXB3組（共轉染miR-373 inhibitor和HOXB3 siRNA），每組設置3個復孔。將對數生長期的Ishikawa細胞以10個/孔接種至6孔細胞板上，待細胞匯合達70%時，根據實驗分組參照脂質體2000說明書將miR-373 inhibitor、inhibitor-NC、NCsiRNA和HOXB3 siRNA轉染至Ishikawa細胞中。轉染6 h后更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h后收集各組細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.2 miR-373和HOXB3靶向關系驗證

采用雙熒光素酶報告基因實驗檢測miR-373和HOXB3的靶向關系。將HOXB33'UTR片段克隆重組至psi-CHECK2熒光素酶載體上，構建野生型psiCHECK2-HOXB3報告基因質粒（HOXB3-WT），另外將miR-373與HOXB3 3’UTR結合的位點定點突變后，將其克隆重組至熒光素酶載體上，構建突變型psi-CHECK2-HOXB3報告基因質粒（HOXB3-MUT）。參照脂質體2000說明書將構建的HOXB3-WT、HOXB3-MUT質粒分別同miR-373 inhibitor、inhibitor-NC共轉染至Ishikawa細胞中。轉染48h后，檢測各組細胞的熒光素酶活性。

1.2.3 Ishikawa細胞中miR-373表達檢測

采用實時熒光定量PCR進行測定。采用Trizol法提取轉染48 h后的各組Ishikawa細胞的總RNA，并在美國ACTGene公司的紫外分光光度計檢測RNA的濃度與純度。參照逆轉錄試劑盒說明書將RNA進行逆轉錄，再以逆轉錄產物cDNA為模板，參照熒光定量PCR試劑盒說明書在瑞士Roche公司實時定量PCR儀上進行PCR擴增，以U6為管家基因，2法計算各組細胞中miR-373的表達水平。其中，來自上海生工生物公司的PCR引物為：miR-373，正向引物為5’-GGGAAGTGCTTCGATTTTG-3’，反向引物為5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’；U6，正向引物為5’-CTCAGAGCGTGGTTCTCCGTCAC-3’，反向引物為5’-TATAAATCTTTACCCTGTTGGCAGT-3’。

1.2.4 Ishikawa細胞中HOXB3蛋白檢測

采用免疫印跡法進行測定。胰酶消化收集轉染48 h后的各組Ishikawa細胞后，加入細胞裂解液提取細胞總蛋白，并采用二喹啉甲酸（Bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒檢測總蛋白的濃度。將60μg沸水變性后的蛋白樣品上樣至10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠中行電泳分離。電轉至聚偏二氟乙烯膜并在5%脫脂奶粉中封閉2 h。以1∶1 000稀釋的HOXB3和GAPDH抗體4℃下孵育24 h后，以1∶2 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育2 h。經化學發(fā)光劑暗室中顯影曝光后，采用凝膠成像分析系統(tǒng)掃描分析HOXB3蛋白條帶的灰度值，以HOXB3蛋白條帶灰度值與內參GAPDH蛋白條帶灰度值的比值表示Ishikawa細胞中HOXB3蛋白的表達水平。實驗重復3次。

1.2.5 Ishikawa細胞增殖實驗

采用CCK-8法進行測定。將對數生長期的Ishikawa細胞以每孔10個接種至6孔細胞板上，按照1.2.1進行分組并轉染24 h、48 h和72 h后，參照CCK-8試劑盒說明書上全自動酶標儀檢測各組Ishikawa細胞在450nm處的光密度值。實驗重復3次。

1.2.6 Ishikawa細胞侵襲實驗

采用Transwell小室進行檢測。首先，以無血清培養(yǎng)基制備濃度為1 mg/mL的基質膠，并取50μL平鋪于孔徑為8μm的Transwell小室聚碳酸酯微孔膜上，室溫下使其充分融合。胰蛋白酶消化收集轉染48 h后的各組Ishikawa細胞，加入無血清培養(yǎng)基饑餓處理12 h，并調整細胞濃度為3×10個/mL。取細胞懸液200μL加入到上層小室內，并在下層加入含血清的培養(yǎng)基600μL。置于二氧化碳細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h后，使用棉簽小心拭去上層內殘留的基質膠和細胞后，分別使用4%多聚甲醛和0.1%結晶紫對下表面細胞進行固定與染色。采用Olympus倒置顯微鏡觀察各組中的穿膜細胞數。實驗重復3次。

1.2.7 Ishikawa細胞細胞凋亡實驗

采用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測Ishikawa細胞的凋亡能力。胰蛋白酶消化收集轉染48h后的各組Ishikawa細胞，按照Annexin V-FITC/PI試劑盒操作步驟在流式細胞儀進行檢測。

2 結果

2.1 miR-373和HOXB3表達靶向關系的驗證

HOXB33'UTR中存在miR-373的互補位點。與inhibitor-NC相比，miR-373 inhibitor可使轉染HOXB3-WT質粒細胞的熒光素酶活性明顯升高（

P

＜0.05）；然而HOXB3-MUT質粒細胞的熒光素酶活性在miR-373 inhibitor組與inhibitor-NC組差異無統(tǒng)計學意義（

P

＞0.05）。見表1。

表1 各組細胞熒光素酶活性和HOXB3蛋白表達水平的比較/±s

2.2 轉染后子宮內膜癌Ishikawa細胞中miR-373和HOXB3蛋白的表達

與inhibitor-NC組相比，miR-373 inhibitor組、miR-373 inhibitor+siNC組和miR-373 inhibitor+siHOXB3組細胞中miR-373的表達水平明顯降低，而HOXB3蛋白的表達水平明顯升高（

P

＜0.05）；與miR-373 inhibitor組相比，miR-373 inhibitor+siHOXB3細胞中miR-373的表達水平無明顯改變（

P

＞0.05），而HOXB3蛋白的表達水平明顯降低（

P

＜0.05），但miR-373 inhibitor+siNC組細胞中miR-373和HOXB3蛋白的表達與miR-373 inhibitor組相比均差異無統(tǒng)計學意義（

P

＞0.05）。見表2。

表2 各組細胞中miR-373和HOXB3蛋白的表達/±s

2.3 miR-373靶向HOXB3對子宮內膜癌Ishikawa細胞增殖的影響

與inhibitor-NC組相比，miR-373 inhibitor可使Ishikawa細胞增殖活力明顯降低（

P

＜0.05）；與miR-373 inhibitor組相比，miR-373 inhibitor+siHOXB3組細胞增殖活力明顯升高（

P

＜0.05），而細胞增殖活力在miR-373 inhibitor+siNC組和miR-373 inhibitor組之間無明顯變化（

P＞

0.05）。見表3。

表3 各組細胞光密度值的比較/±s

2.4 miR-373靶向HOXB3對子宮內膜癌Ishikawa細胞侵襲的影響

與inhibitor-NC組相比，miR-373 inhibitor組、miR-373 inhibitor+siNC組和miR-373 inhibitor+siHOXB3組中穿膜細胞數明顯減少（

P

＜0.05）；與miR-373 inhibitor組相比，miR-373 inhibitor+siNC組中穿膜細胞數無明顯變化（

P＞

0.05），但miR-373 inhibitor+siHOXB3組中穿膜細胞數較miR-373 inhibitor組明顯增多（

P

＜0.05）。見表4。

表4 各組中穿膜細胞數的比較/±s

2.5 miR-373靶向HOXB3對子宮內膜癌Ishikawa細胞凋亡的影響

與inhibitor-NC組（8.75±1.23）相比，miR-373 inhibitor組（25.64±3.38）、miR-373 inhibitor+siNC組（28.48±3.26）和miR-373 inhibitor+si-HOXB3組（14.25±2.02）細胞凋亡率均明顯升高（

P

＜0.05），且miR-373 inhibitor組明顯高于miR-373 inhibitor+siHOXB3（

P

＜0.05），但miR-373 inhibitor+siNC組和miR-373 inhibitor組之間差異無統(tǒng)計學意義（

P＞

0.05）。四組比較，

F

=113.410，

P＜

0.001。

3 討論

子宮內膜癌是一種常見的婦科腫瘤，過去十年里其死亡率以1.4%比例上升；在2017年中約有6.1萬人受其影響，1.092萬人因其死亡。盡管目前的手術治療、放化療等治療技術已取得了很好的成績，但部分子宮內膜癌的患者的治療效果并不理想。因此，深入探討子宮內膜癌的發(fā)病機制以更好地治療子宮內膜癌是十分必要的。

miRNAs是一類短小的非編碼RNA，影響細胞增殖、侵襲和凋亡等生物過程，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。miR-373是miRNAs中重要一員，其在腫瘤中的作用逐漸引起關注。Shi Y等研究發(fā)現，miR-373在胃癌組織中表達上調，且可通過調控波形蛋白的表達在胃癌轉移中發(fā)揮致癌作用。Zhang X J等在口腔鱗狀細胞癌組織和細胞中發(fā)現miR-373異常高表達，且體外上調miR-373表達可通過靶向調控POZ蛋白（SPOP）促進癌細胞增殖、侵襲和遷移。Li Y等研究指出，miR-373在腎細胞癌中高表達，抑制其表達可抑制癌細胞增殖并誘導細胞凋亡。盡管miR-373在子宮內膜癌中已有研究，但具體的調控機制尚不完全明了。

HOXB3是一類與腫瘤發(fā)生發(fā)展關系密切的調控基因，具有同源異形盒DNA結構，可編碼60個氨基酸殘基。在膠質母細胞瘤和白血病等腫瘤中HOXB3水平異常，通過細胞增殖、侵襲和凋亡等過程調控作為癌因子或抑癌因子發(fā)揮作用。Chen H等研究指出，HOXB3在子宮內膜癌組織中低表達，并可通過影響細胞增殖、侵襲和凋亡等起腫瘤抑制作用。本研究證實HOXB3是miR-373的靶基因；采用常規(guī)生物學手段檢測發(fā)現，轉染miR-373 inhibitor成功下調miR-373表達后發(fā)現，子宮內膜癌Ishikawa細胞增殖、侵襲能力明顯減弱。該結果反向印證了Li Y等所得出的上調miR-373促進子宮內膜癌細胞侵襲和增殖的實驗結果。本研究還發(fā)現，下調miR-373表達后發(fā)現，子宮內膜癌Ishikawa細胞中HOXB3蛋白的表達水平和細胞凋亡率明顯升高。結果表明，miR-373可通過調控細胞增殖、侵襲和凋亡參與子宮內膜癌的發(fā)生與發(fā)展，其分子機制可能與調控HOXB3表達有關。此外，本研究通過轉染HOXB3干擾序列HOXB3 siRNA成功下調子宮內膜癌Ishikawa細胞中HOXB3表達后發(fā)現，miR-373低表達對Ishikawa細胞增殖、侵襲的抑制作用及促凋亡作用得到部分逆轉。這提示，在子宮內膜癌中miR-373可通過靶向調控HOXB3影響癌細胞增殖、侵襲和凋亡；此外，miR-373除了靶向調控HOXB3表達外，其可能還通過其他機制發(fā)揮作用。

綜上所述，下調miR-373表達可通過靶向HOXB3抑制子宮內膜癌Ishikawa細胞增殖、侵襲并促進細胞凋亡，該結果豐富了子宮內膜癌發(fā)生發(fā)展的分子機制，也為miR-373有望成為子宮內膜癌的候選靶基因提供了新的參考依據。