周訓(xùn)璽，彭敏，賀曉琪，孫國強(qiáng)

越來越多的研究顯示，異常表達(dá)的微小RNA（microRNA，miRNA，miR）可通過影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為參與子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展。miR-373是miR-371-372-373家族成員，定位于人19q13.42染色體上，在皮膚鱗狀細(xì)胞癌和非小細(xì)胞肺癌等腫瘤中常見異常表達(dá)，且可通過影響細(xì)胞生物學(xué)功能在腫瘤惡性進(jìn)展中發(fā)揮著癌基因或抑癌基因的作用。同源異型盒基因B3（HOXB3）是同源異型盒基因（HOX基因）家族成員，被證實(shí)在結(jié)直腸癌和胰腺癌等腫瘤中異常表達(dá)，通過影響細(xì)胞增殖、遷移和凋亡等參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。miR-373在子宮內(nèi)膜癌組織中異常高表達(dá)，與腫瘤分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等緊密相關(guān)，且對(duì)癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移具有促進(jìn)作用；然而，miR-373影響子宮內(nèi)膜癌生物學(xué)行為的作用機(jī)制并不完全清楚。HOXB3被證實(shí)在子宮內(nèi)膜癌組織中低表達(dá)，發(fā)揮抑癌作用。本研究通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)miR-373與HOXB3 3’非編碼區(qū)（Untranslated Region，UTR）存在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，猜測miR-373可能通過靶向HOXB3調(diào)控子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展。因此，本研究從2018年2月至2019年6月，開展體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)旨在觀察miR-373通過靶向調(diào)控HOXB3對(duì)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡的調(diào)控作用，以期為子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機(jī)制和治療提供新線索。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株Ishikawa（上海復(fù)祥生物公司），胎牛血清和胰蛋白酶（美國Gibco公司），青霉素-鏈霉素雙抗、脂質(zhì)體2000和Trizol試劑（美國Invitrogen公司），HOXB3抗體（美國Abcam公司），miR-373抑制劑（inhibitor）及抑制劑陰性對(duì)照（inhibitor-NC）（上海吉瑪公司），HOXB3 siRNA及其陰性對(duì)照NC siRNA（美國SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY公司），psiCHECK2熒光素酶載體（西安賽拓博泰生物公司）。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒（大連Takara公司）。Transwell小室（美國Corning公司），膜聯(lián)蛋白V-FITC（Annexin V-FITC）/碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（美國BD公司），細(xì)胞計(jì)數(shù)（Cell Counting Kit-8，CCK-8）試劑盒（上海碧云天公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、分組和轉(zhuǎn)染

采用含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗的洛斯維公園紀(jì)念研究所（Roswell Park Memorial Institute，RPMI）-1640培養(yǎng)基在濕度飽和、37℃、5%二氧化碳常規(guī)條件的二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)Ishikawa細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分為inhibitor-NC組（轉(zhuǎn)染inhibitor-NC）、miR-373 inhibitor組（轉(zhuǎn)染miR-373 inhibitor）、miR-373 inhibitor+siNC組（共轉(zhuǎn)染miR-373 inhibitor和NC siRNA）和miR-373 inhibitor+siHOXB3組（共轉(zhuǎn)染miR-373 inhibitor和HOXB3 siRNA），每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。將對(duì)數(shù)生長期的Ishikawa細(xì)胞以10個(gè)/孔接種至6孔細(xì)胞板上，待細(xì)胞匯合達(dá)70%時(shí)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組參照脂質(zhì)體2000說明書將miR-373 inhibitor、inhibitor-NC、NCsiRNA和HOXB3 siRNA轉(zhuǎn)染至Ishikawa細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染6 h后更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h后收集各組細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 miR-373和HOXB3靶向關(guān)系驗(yàn)證

采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測miR-373和HOXB3的靶向關(guān)系。將HOXB33'UTR片段克隆重組至psi-CHECK2熒光素酶載體上，構(gòu)建野生型psiCHECK2-HOXB3報(bào)告基因質(zhì)粒（HOXB3-WT），另外將miR-373與HOXB3 3’UTR結(jié)合的位點(diǎn)定點(diǎn)突變后，將其克隆重組至熒光素酶載體上，構(gòu)建突變型psi-CHECK2-HOXB3報(bào)告基因質(zhì)粒（HOXB3-MUT）。參照脂質(zhì)體2000說明書將構(gòu)建的HOXB3-WT、HOXB3-MUT質(zhì)粒分別同miR-373 inhibitor、inhibitor-NC共轉(zhuǎn)染至Ishikawa細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48h后，檢測各組細(xì)胞的熒光素酶活性。

1.2.3 Ishikawa細(xì)胞中miR-373表達(dá)檢測

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行測定。采用Trizol法提取轉(zhuǎn)染48 h后的各組Ishikawa細(xì)胞的總RNA，并在美國ACTGene公司的紫外分光光度計(jì)檢測RNA的濃度與純度。參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，再以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板，參照熒光定量PCR試劑盒說明書在瑞士Roche公司實(shí)時(shí)定量PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以U6為管家基因，2法計(jì)算各組細(xì)胞中miR-373的表達(dá)水平。其中，來自上海生工生物公司的PCR引物為：miR-373，正向引物為5’-GGGAAGTGCTTCGATTTTG-3’，反向引物為5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’；U6，正向引物為5’-CTCAGAGCGTGGTTCTCCGTCAC-3’，反向引物為5’-TATAAATCTTTACCCTGTTGGCAGT-3’。

1.2.4 Ishikawa細(xì)胞中HOXB3蛋白檢測

采用免疫印跡法進(jìn)行測定。胰酶消化收集轉(zhuǎn)染48 h后的各組Ishikawa細(xì)胞后，加入細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，并采用二喹啉甲酸（Bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒檢測總蛋白的濃度。將60μg沸水變性后的蛋白樣品上樣至10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠中行電泳分離。電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜并在5%脫脂奶粉中封閉2 h。以1∶1 000稀釋的HOXB3和GAPDH抗體4℃下孵育24 h后，以1∶2 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h。經(jīng)化學(xué)發(fā)光劑暗室中顯影曝光后，采用凝膠成像分析系統(tǒng)掃描分析HOXB3蛋白條帶的灰度值，以HOXB3蛋白條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH蛋白條帶灰度值的比值表示Ishikawa細(xì)胞中HOXB3蛋白的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 Ishikawa細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

采用CCK-8法進(jìn)行測定。將對(duì)數(shù)生長期的Ishikawa細(xì)胞以每孔10個(gè)接種至6孔細(xì)胞板上，按照1.2.1進(jìn)行分組并轉(zhuǎn)染24 h、48 h和72 h后，參照CCK-8試劑盒說明書上全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測各組Ishikawa細(xì)胞在450nm處的光密度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 Ishikawa細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

采用Transwell小室進(jìn)行檢測。首先，以無血清培養(yǎng)基制備濃度為1 mg/mL的基質(zhì)膠，并取50μL平鋪于孔徑為8μm的Transwell小室聚碳酸酯微孔膜上，室溫下使其充分融合。胰蛋白酶消化收集轉(zhuǎn)染48 h后的各組Ishikawa細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基饑餓處理12 h，并調(diào)整細(xì)胞濃度為3×10個(gè)/mL。取細(xì)胞懸液200μL加入到上層小室內(nèi)，并在下層加入含血清的培養(yǎng)基600μL。置于二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h后，使用棉簽小心拭去上層內(nèi)殘留的基質(zhì)膠和細(xì)胞后，分別使用4%多聚甲醛和0.1%結(jié)晶紫對(duì)下表面細(xì)胞進(jìn)行固定與染色。采用Olympus倒置顯微鏡觀察各組中的穿膜細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7 Ishikawa細(xì)胞細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)

采用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測Ishikawa細(xì)胞的凋亡能力。胰蛋白酶消化收集轉(zhuǎn)染48h后的各組Ishikawa細(xì)胞，按照Annexin V-FITC/PI試劑盒操作步驟在流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果

2.1 miR-373和HOXB3表達(dá)靶向關(guān)系的驗(yàn)證

HOXB33'UTR中存在miR-373的互補(bǔ)位點(diǎn)。與inhibitor-NC相比，miR-373 inhibitor可使轉(zhuǎn)染HOXB3-WT質(zhì)粒細(xì)胞的熒光素酶活性明顯升高（

P

＜0.05）；然而HOXB3-MUT質(zhì)粒細(xì)胞的熒光素酶活性在miR-373 inhibitor組與inhibitor-NC組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）。見表1。

表1 各組細(xì)胞熒光素酶活性和HOXB3蛋白表達(dá)水平的比較/±s

2.2 轉(zhuǎn)染后子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞中miR-373和HOXB3蛋白的表達(dá)

與inhibitor-NC組相比，miR-373 inhibitor組、miR-373 inhibitor+siNC組和miR-373 inhibitor+siHOXB3組細(xì)胞中miR-373的表達(dá)水平明顯降低，而HOXB3蛋白的表達(dá)水平明顯升高（

P

＜0.05）；與miR-373 inhibitor組相比，miR-373 inhibitor+siHOXB3細(xì)胞中miR-373的表達(dá)水平無明顯改變（

P

＞0.05），而HOXB3蛋白的表達(dá)水平明顯降低（

P

＜0.05），但miR-373 inhibitor+siNC組細(xì)胞中miR-373和HOXB3蛋白的表達(dá)與miR-373 inhibitor組相比均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）。見表2。

表2 各組細(xì)胞中miR-373和HOXB3蛋白的表達(dá)/±s

2.3 miR-373靶向HOXB3對(duì)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞增殖的影響

與inhibitor-NC組相比，miR-373 inhibitor可使Ishikawa細(xì)胞增殖活力明顯降低（

P

＜0.05）；與miR-373 inhibitor組相比，miR-373 inhibitor+siHOXB3組細(xì)胞增殖活力明顯升高（

P

＜0.05），而細(xì)胞增殖活力在miR-373 inhibitor+siNC組和miR-373 inhibitor組之間無明顯變化（

P＞

0.05）。見表3。

表3 各組細(xì)胞光密度值的比較/±s

2.4 miR-373靶向HOXB3對(duì)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞侵襲的影響

與inhibitor-NC組相比，miR-373 inhibitor組、miR-373 inhibitor+siNC組和miR-373 inhibitor+siHOXB3組中穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少（

P

＜0.05）；與miR-373 inhibitor組相比，miR-373 inhibitor+siNC組中穿膜細(xì)胞數(shù)無明顯變化（

P＞

0.05），但miR-373 inhibitor+siHOXB3組中穿膜細(xì)胞數(shù)較miR-373 inhibitor組明顯增多（

P

＜0.05）。見表4。

表4 各組中穿膜細(xì)胞數(shù)的比較/±s

2.5 miR-373靶向HOXB3對(duì)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞凋亡的影響

與inhibitor-NC組（8.75±1.23）相比，miR-373 inhibitor組（25.64±3.38）、miR-373 inhibitor+siNC組（28.48±3.26）和miR-373 inhibitor+si-HOXB3組（14.25±2.02）細(xì)胞凋亡率均明顯升高（

P

＜0.05），且miR-373 inhibitor組明顯高于miR-373 inhibitor+siHOXB3（

P

＜0.05），但miR-373 inhibitor+siNC組和miR-373 inhibitor組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P＞

0.05）。四組比較，

F

=113.410，

P＜

0.001。

3 討論

子宮內(nèi)膜癌是一種常見的婦科腫瘤，過去十年里其死亡率以1.4%比例上升；在2017年中約有6.1萬人受其影響，1.092萬人因其死亡。盡管目前的手術(shù)治療、放化療等治療技術(shù)已取得了很好的成績，但部分子宮內(nèi)膜癌的患者的治療效果并不理想。因此，深入探討子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機(jī)制以更好地治療子宮內(nèi)膜癌是十分必要的。

miRNAs是一類短小的非編碼RNA，影響細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡等生物過程，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。miR-373是miRNAs中重要一員，其在腫瘤中的作用逐漸引起關(guān)注。Shi Y等研究發(fā)現(xiàn)，miR-373在胃癌組織中表達(dá)上調(diào)，且可通過調(diào)控波形蛋白的表達(dá)在胃癌轉(zhuǎn)移中發(fā)揮致癌作用。Zhang X J等在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織和細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)miR-373異常高表達(dá)，且體外上調(diào)miR-373表達(dá)可通過靶向調(diào)控POZ蛋白（SPOP）促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。Li Y等研究指出，miR-373在腎細(xì)胞癌中高表達(dá)，抑制其表達(dá)可抑制癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。盡管miR-373在子宮內(nèi)膜癌中已有研究，但具體的調(diào)控機(jī)制尚不完全明了。

HOXB3是一類與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切的調(diào)控基因，具有同源異形盒DNA結(jié)構(gòu)，可編碼60個(gè)氨基酸殘基。在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和白血病等腫瘤中HOXB3水平異常，通過細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡等過程調(diào)控作為癌因子或抑癌因子發(fā)揮作用。Chen H等研究指出，HOXB3在子宮內(nèi)膜癌組織中低表達(dá)，并可通過影響細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡等起腫瘤抑制作用。本研究證實(shí)HOXB3是miR-373的靶基因；采用常規(guī)生物學(xué)手段檢測發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-373 inhibitor成功下調(diào)miR-373表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞增殖、侵襲能力明顯減弱。該結(jié)果反向印證了Li Y等所得出的上調(diào)miR-373促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞侵襲和增殖的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。本研究還發(fā)現(xiàn)，下調(diào)miR-373表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞中HOXB3蛋白的表達(dá)水平和細(xì)胞凋亡率明顯升高。結(jié)果表明，miR-373可通過調(diào)控細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡參與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生與發(fā)展，其分子機(jī)制可能與調(diào)控HOXB3表達(dá)有關(guān)。此外，本研究通過轉(zhuǎn)染HOXB3干擾序列HOXB3 siRNA成功下調(diào)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞中HOXB3表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，miR-373低表達(dá)對(duì)Ishikawa細(xì)胞增殖、侵襲的抑制作用及促凋亡作用得到部分逆轉(zhuǎn)。這提示，在子宮內(nèi)膜癌中miR-373可通過靶向調(diào)控HOXB3影響癌細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡；此外，miR-373除了靶向調(diào)控HOXB3表達(dá)外，其可能還通過其他機(jī)制發(fā)揮作用。

綜上所述，下調(diào)miR-373表達(dá)可通過靶向HOXB3抑制子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞增殖、侵襲并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，該結(jié)果豐富了子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，也為miR-373有望成為子宮內(nèi)膜癌的候選靶基因提供了新的參考依據(jù)。