吳佳，錢芳波，王家俊

壓力性尿失禁（stress urinary incontinence，SUI）是一種常見(jiàn)成年女性盆底功能障礙性疾病，據(jù)報(bào)道SUI在世界各地的發(fā)病率在10%～30%。隨著人口老齡化及人們對(duì)生活質(zhì)量要求的提高，SUI對(duì)病人的生活方式、社會(huì)影響、心理健康等已造成了嚴(yán)重的負(fù)面影響，了解其病因以及發(fā)病機(jī)制對(duì)于提高其治愈率有著重要的作用。目前，國(guó)內(nèi)外的多數(shù)學(xué)者認(rèn)為該疾病的發(fā)病機(jī)制與盆底結(jié)締組織支托力不足有關(guān)，盆底結(jié)締組織是盆底主要的支撐結(jié)構(gòu)，由大量的膠原和少量非膠原成分構(gòu)成。膠原主要由Ⅰ型膠原（CollagenⅠ）和Ⅲ型膠原（CollagenⅢ）組成，是對(duì)盆底結(jié)締組織起支持作用的主要物質(zhì)，具有較強(qiáng)的抗張力作用。研究表明，SUI病人的膀胱陰道筋膜、圓韌帶等組織中的膠原含量與無(wú)SUI組相比顯著性減少，且膠原分解增加是其含量減少的主要原因。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（Transforming Growth Factor，TGF-β）是一系列調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的蛋白質(zhì)家族，有三種異構(gòu)體，即TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，其中TGF-β1是最主要的促纖維形成細(xì)胞因子，其具有增加以膠原為主的間質(zhì)蛋白的合成進(jìn)而抑制膠原降解等作用。微RNA-93（microRNA-93，miR-93）為小分子單鏈非編碼RNA，其通過(guò)抑制翻譯或基因分割等方式可調(diào)控蛋白編碼基因等靶基因的表達(dá)，在細(xì)胞增殖、分化以及蛋白質(zhì)合成等發(fā)揮著重要作用，miRNAs的異常表達(dá)與諸多疾病的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)。miRNAs對(duì)膠原表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用，miR-93在SUI病人膀胱陰道筋膜中表達(dá)降低，提示miR-93與SUI發(fā)病機(jī)制相關(guān)。TGF-β1與膠原代謝密切相關(guān)，且刺激細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)中膠原基因miRNAs及相關(guān)膠原的表達(dá)。本研究擬通過(guò)對(duì)SUI病人陰道前壁組織中miR-93、TGF-β1表達(dá)進(jìn)一步分析miR-93、TGF-β1與膠原代謝的相關(guān)性，探討miR-93、TGF-β1在SUI發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 資料和方法

1.1 一般資料

2014年1月至2018年1月，選取南京醫(yī)科大學(xué)附屬無(wú)錫市婦幼保健院收治的SUI病人（SUI組，

n

=53）以及同期至本院進(jìn)行婦科良性腫瘤治療且術(shù)前檢查無(wú)SUI及其他盆腔器官脫垂臨床癥狀的病人（無(wú)SUI組，

n

=53）為研究對(duì)象。入選標(biāo)準(zhǔn)：依據(jù)臨床和尿動(dòng)力學(xué)檢查結(jié)果診斷其為SUI，年齡范圍為50～60歲的病人。SUI的診斷標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)典型的壓力性尿失禁癥狀，即大笑、咳嗽、噴嚏或行走等各種程度腹壓增加時(shí)尿液溢出，停止加壓動(dòng)作時(shí)尿流是否隨即終止即可明確診斷。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有中度及重度盆腔臟器脫重（POP）者；②年齡大于60歲的病人；③近半年有服用激素類藥物史；④有陰道手術(shù)史；⑤生殖器及泌尿系統(tǒng)感染。病人或其近親屬已經(jīng)簽署知情同意書，本研究經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)附屬無(wú)錫市婦幼保健院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)（院字〔2014〕1號(hào)）。

1.1.1 標(biāo)本采集

用棉簽從病人的陰道前壁黏膜處采集微量標(biāo)本，取下的組織置于-80℃冰箱冷凍保存用以后期測(cè)定指標(biāo)。

1.1.2 儀器和試劑

正常成纖維細(xì)胞以及SUI原代成纖維細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心；新生胎牛血清及良伊格爾培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)賽默飛世爾公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑和RNA提取試劑TRIzol購(gòu)于Invitrogen公司；ABI PRISM 7700檢測(cè)系統(tǒng)購(gòu)于美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。Taq-Man miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。Roche LightCycler 480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀器購(gòu)于瑞士羅氏集團(tuán)。

1.2 方法

1.2.1 病人的指標(biāo)檢測(cè)

為對(duì)比miR-93在SUI病人與無(wú)SUI組表達(dá)的不同，本研究采用RT-PCT對(duì)SUI病人及無(wú)SUI組病人陰道壁組織的miR-93的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定，采用Western方法對(duì)TFG-β1、CollagenⅢ的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

正常成纖維細(xì)胞以及SUI成纖維細(xì)胞培養(yǎng)于含10%新生胎牛血清的良伊格爾培養(yǎng)基中，置于37℃、含有5%二氧化碳的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，常規(guī)傳代培養(yǎng)，取其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 原代成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染

取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞接種于96孔板中，接種密度為4×10個(gè)/孔。設(shè)對(duì)照組（Control）、陰性對(duì)照組（miR Negative Contronl，miRNC）、miR-93模擬組（miR-93 mimic）及其抑制劑組（miR-93 inhibitor）。對(duì)照組：Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染劑5μL；陰性對(duì)照組：Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染劑5μL以及100 nmol/L的miR-93陰性對(duì)照物；miR-93模擬組：加Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染劑5μL以及100 nmol/L的miR-93模擬物；抑制劑組：加Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染劑5μL及100 nmol/L的miR-93抑制劑，每組平行設(shè)置3個(gè)樣本，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。miR-93模擬物和miR-93抑制劑的引物序列：miR-93模擬物：5'-CAAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG-3'；miR-93抑制劑：5'-CUACCUGCACGAACAGCACUUUG-3'。

1.2.4 RT-PCR測(cè)定miR-93的表達(dá)

采用TRIzol（Invitrogen公司）從成纖維細(xì)胞以及陰道壁組織中分離提取RNA，測(cè)定樣品RNA的A，其值在1.8～2.0范圍內(nèi)滿足實(shí)驗(yàn)要求。按照TaqMan miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作方法合成cDNA，引物序列見(jiàn)表3。取25μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為：94℃變性1min，60℃復(fù)變性1.5 min，72℃擴(kuò)增2 min，共設(shè)35個(gè)循環(huán)。每組平行測(cè)定3次。數(shù)據(jù)以ABI Prism 7700 SDS軟件系統(tǒng)分析miR-93的表達(dá)。miR-93的PCR引物序列：miR-93正向：5'-AGTCTCTGGGCTGACTACATCACAG-3'；miR-93反向：5'-CTACTCACAAAACAGGAGTGGAATC-3'。

1.2.5 Western-blot法測(cè)定TGF-β1以及CollagenⅢ表達(dá)

采用放射性免疫印跡法提取成纖維細(xì)胞以及陰道壁組織中的蛋白。于4℃下，以12 000 r/min離心15 min。以雙吲哚丁酸蛋白試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。以常規(guī)法制備SDS-PAGE膠，以β-actin作為內(nèi)參，將50μg蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行上樣，在70 V電壓下電泳1.5 h后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜。采用5%的脫脂奶粉室溫下封裝。加入1∶250稀釋的TGF-β1抗體（Abcam公司）及1∶400稀釋的CollagenⅢ抗體（購(gòu)于Santa Cruz Biotechnology），4℃下孵育12 h后，加入相對(duì)應(yīng)的二抗，室溫25℃下孵育1 h。ECL顯色，通過(guò)Image Lab 4.1圖像分析系統(tǒng)對(duì)膠片進(jìn)行掃描分析。

1.2.6 熒光素酶報(bào)告分析miR-93、TFG-β1及CollagenⅢ表達(dá)的相關(guān)性

本部分采用293T細(xì)胞用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的載體，將293T細(xì)胞以5×10個(gè)/孔的密度接種于24孔板上。采用miRecords預(yù)測(cè)TFG-β1的3’-UTR上miR-93可能的結(jié)合位點(diǎn)，構(gòu)建含有miRNA-93結(jié)合位點(diǎn)TFG-β1基因3’-UTR的序列，插入pmir-REPORT luciferase載體，隨后經(jīng)限制性內(nèi)切酶處理并進(jìn)行純化鑒定。構(gòu)建含有pmir-REPORTTGFβ1-3’UTR的報(bào)告質(zhì)粒以及含有100 nmol/L的miR-93及陰性對(duì)照組的microRNAs在Lipofectamine孵育48 h，進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。隨后，收集細(xì)胞并用PBS洗滌2次，加入細(xì)胞裂解液后離心并收集裂解液進(jìn)一步通過(guò)熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行熒光檢測(cè)。采樣品50μL，加入100μL螢火蟲熒光素酶檢測(cè)試劑混勻，以報(bào)告基因細(xì)胞溶解液為空白，測(cè)定螢火蟲熒光素酶相對(duì)光單位，即RLU值，隨后加入100μL海腎熒光酶檢測(cè)工作液，混勻后測(cè)定RLU值，以RLU螢火日熒光素酶/RLU海腎熒光素酶即為熒光素酶活性。實(shí)驗(yàn)平行測(cè)定3次。

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象一般情況

兩組年齡、分娩次數(shù)、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。見(jiàn)表1。

表1 研究對(duì)象一般情況/±s

2.2 miR-93、TFG-β1以及CollagenⅢ在SUI病人陰道壁組織中的表達(dá)

miR-93在SUI病人陰道壁組織中的表達(dá)低于無(wú)SUI組（

t

=7.821，

P

=0.001），TFGβ1及CollagenⅢ在SUI病人陰道壁組織中的表達(dá)亦低于無(wú)SUI組（

t

=8.125，

P

=0.002）。見(jiàn)圖1、表2。

圖1 TFG-β1、CollagenⅢ在SUI病人及無(wú)SUI組陰道壁組織中的表達(dá)

表2 miR-93、TFG-β1、CollagenⅢ在SUI病人陰道壁組織中的表達(dá)/±s

2.3 miR-93、TFG-β1以及CollagenⅢ在原代成纖維細(xì)胞的表達(dá)

結(jié)合“2.1”項(xiàng)下結(jié)果，進(jìn)一步測(cè)定了miR-93表達(dá)與TFG-β1及CollagenⅢ在SUI原代成纖維細(xì)胞（觀察組）及正常原代成纖維細(xì)胞（對(duì)照組）的表達(dá)。觀察組與對(duì)照組相比，miR-93表達(dá)降低（

t

=7.063，

P

=0.005），TFG-β1及CollagenⅢ在SUI原代成纖維細(xì)胞中的表達(dá)均降低（

t

=8.268，

P

=0.001）。見(jiàn)圖2、表3。

表3 miR-93、TFG-β1以及CollagenⅢ在原代成纖維細(xì)胞的表達(dá)/±s

圖2 TFG-β1、CollagenⅢ在SUI及無(wú)SUI組原代成纖維細(xì)胞的表達(dá)

2.4 miR-93、TFG-β1及CollagenⅢ表達(dá)相關(guān)性研究

miR-93基因可與TFG-β1基因結(jié)合，并且通過(guò)結(jié)合提高了TFG-β1的表達(dá)。本研究進(jìn)一步通過(guò)Western測(cè)定miR-93過(guò)表達(dá)及抑制情況下對(duì)于TFG-β1調(diào)節(jié)作用，進(jìn)一步證實(shí)miR-93過(guò)表達(dá)的情況下可以提高TFG-β1的表達(dá)，而當(dāng)miR-93的表達(dá)被抑制時(shí)，TFG-β1的表達(dá)亦表現(xiàn)為下調(diào)（

t

=6.590，

P

=0.007）。上述結(jié)果證實(shí)了TFG-β1是miR-93的調(diào)控靶標(biāo)。見(jiàn)圖3，表4。

圖3 miR-93陰性對(duì)照、過(guò)表達(dá)以及抑制劑對(duì)于TFG-β1表達(dá)的影響

表4 miR-93、TFG-β1及CollagenⅢ表達(dá)相關(guān)性研究/±s

3 討論

目前多數(shù)國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)于SUI的研究集中在手術(shù)治療效果以及流行病學(xué)調(diào)查方面，基礎(chǔ)方面研究較少。國(guó)際上對(duì)于SUI的發(fā)病機(jī)制研究主要集中在三個(gè)方面：①由于多種原因使盆內(nèi)筋膜含量較少，從而導(dǎo)致盆底組織結(jié)構(gòu)支持力不足，使膀胱尿道等下移，腹壓增大時(shí)，壓力不能沿著陰道前壁以及恥骨宮頸筋膜進(jìn)而傳遞至膀胱頸以及尿道，而更多地傳導(dǎo)至膀胱，使膀胱內(nèi)壓高于尿道的閉合壓，從而發(fā)生尿失禁的情況。如果盆底支撐組織膠原含量降低，導(dǎo)致膠原直徑代償性增粗，還會(huì)使尿道發(fā)生僵硬、出現(xiàn)閉合等現(xiàn)象；②由于神經(jīng)肌肉的功能障礙，從而導(dǎo)致盆底支持組織的結(jié)構(gòu)和功能改變，使膀胱頸和尿道的近端下移。

膠原蛋白在維持盆底結(jié)締組織的彈性和韌性方面發(fā)揮著重要作用。提肛肌通過(guò)膠原蛋白對(duì)尿道產(chǎn)生收縮作用。膠原變性后，肛提肌向尿道收縮，陰道壁吊床狀結(jié)構(gòu)的支撐作用減弱，導(dǎo)致尿失禁。本研究表明，在SUI病人陰道前壁組織以及SUI原代成纖維細(xì)胞中對(duì)比無(wú)SUI組Ⅲ型膠原蛋白含量降低，且miR-93及TFG-β1表達(dá)均呈現(xiàn)下調(diào)現(xiàn)象。盆底功能障礙性疾病主要包括盆底器官脫垂（pelvic organ prolapse，POP）和SUI，臨床經(jīng)驗(yàn)表明有諸多病人在患有SUI的同時(shí)還伴有不同程度的POP，本研究在納入SUI對(duì)象時(shí)將患有中度及重度的POP病人排除在外，但有研究顯示，TFG-β1可能是治療POP的潛在靶點(diǎn)，提示miR-93亦可能通過(guò)介導(dǎo)TFG-β1從而調(diào)節(jié)膠原蛋白在POP病人中的表達(dá)。其機(jī)制是TFG-β1可以刺激細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)中大部分膠原基因和膠原產(chǎn)物的增加。TFG-β1是與膠原代謝最密切相關(guān)的細(xì)胞因子。miR-29b可通過(guò)調(diào)控TGF-β1/Smad信號(hào)通路，故其是TFG-β1的正向調(diào)控因子。課題組后期將對(duì)miR-93與盆底功能障礙性疾病的關(guān)系進(jìn)一步深入探索。

綜上所述，SUI病人中，miR-93表達(dá)降低，介導(dǎo)TGF-β1表達(dá)下調(diào)，最終導(dǎo)致膠原Ⅲ含量降低。