吳佳，錢芳波，王家俊

壓力性尿失禁（stress urinary incontinence，SUI）是一種常見成年女性盆底功能障礙性疾病，據(jù)報道SUI在世界各地的發(fā)病率在10%～30%。隨著人口老齡化及人們對生活質(zhì)量要求的提高，SUI對病人的生活方式、社會影響、心理健康等已造成了嚴(yán)重的負(fù)面影響，了解其病因以及發(fā)病機制對于提高其治愈率有著重要的作用。目前，國內(nèi)外的多數(shù)學(xué)者認(rèn)為該疾病的發(fā)病機制與盆底結(jié)締組織支托力不足有關(guān)，盆底結(jié)締組織是盆底主要的支撐結(jié)構(gòu)，由大量的膠原和少量非膠原成分構(gòu)成。膠原主要由Ⅰ型膠原（CollagenⅠ）和Ⅲ型膠原（CollagenⅢ）組成，是對盆底結(jié)締組織起支持作用的主要物質(zhì)，具有較強的抗張力作用。研究表明，SUI病人的膀胱陰道筋膜、圓韌帶等組織中的膠原含量與無SUI組相比顯著性減少，且膠原分解增加是其含量減少的主要原因。轉(zhuǎn)化生長因子（Transforming Growth Factor，TGF-β）是一系列調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化的蛋白質(zhì)家族，有三種異構(gòu)體，即TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，其中TGF-β1是最主要的促纖維形成細(xì)胞因子，其具有增加以膠原為主的間質(zhì)蛋白的合成進而抑制膠原降解等作用。微RNA-93（microRNA-93，miR-93）為小分子單鏈非編碼RNA，其通過抑制翻譯或基因分割等方式可調(diào)控蛋白編碼基因等靶基因的表達，在細(xì)胞增殖、分化以及蛋白質(zhì)合成等發(fā)揮著重要作用，miRNAs的異常表達與諸多疾病的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)。miRNAs對膠原表達具有調(diào)節(jié)作用，miR-93在SUI病人膀胱陰道筋膜中表達降低，提示miR-93與SUI發(fā)病機制相關(guān)。TGF-β1與膠原代謝密切相關(guān)，且刺激細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)中膠原基因miRNAs及相關(guān)膠原的表達。本研究擬通過對SUI病人陰道前壁組織中miR-93、TGF-β1表達進一步分析miR-93、TGF-β1與膠原代謝的相關(guān)性，探討miR-93、TGF-β1在SUI發(fā)病機制中的作用。

1 資料和方法

1.1 一般資料

2014年1月至2018年1月，選取南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫市婦幼保健院收治的SUI病人（SUI組，

n

=53）以及同期至本院進行婦科良性腫瘤治療且術(shù)前檢查無SUI及其他盆腔器官脫垂臨床癥狀的病人（無SUI組，

n

=53）為研究對象。入選標(biāo)準(zhǔn)：依據(jù)臨床和尿動力學(xué)檢查結(jié)果診斷其為SUI，年齡范圍為50～60歲的病人。SUI的診斷標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)典型的壓力性尿失禁癥狀，即大笑、咳嗽、噴嚏或行走等各種程度腹壓增加時尿液溢出，停止加壓動作時尿流是否隨即終止即可明確診斷。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有中度及重度盆腔臟器脫重（POP）者；②年齡大于60歲的病人；③近半年有服用激素類藥物史；④有陰道手術(shù)史；⑤生殖器及泌尿系統(tǒng)感染。病人或其近親屬已經(jīng)簽署知情同意書，本研究經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫市婦幼保健院倫理委員會審核批準(zhǔn)（院字〔2014〕1號）。

1.1.1 標(biāo)本采集

用棉簽從病人的陰道前壁黏膜處采集微量標(biāo)本，取下的組織置于-80℃冰箱冷凍保存用以后期測定指標(biāo)。

1.1.2 儀器和試劑

正常成纖維細(xì)胞以及SUI原代成纖維細(xì)胞購于中國科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心；新生胎牛血清及良伊格爾培養(yǎng)基購于美國賽默飛世爾公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑和RNA提取試劑TRIzol購于Invitrogen公司；ABI PRISM 7700檢測系統(tǒng)購于美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。Taq-Man miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。Roche LightCycler 480實時熒光定量PCR儀器購于瑞士羅氏集團。

1.2 方法

1.2.1 病人的指標(biāo)檢測

為對比miR-93在SUI病人與無SUI組表達的不同，本研究采用RT-PCT對SUI病人及無SUI組病人陰道壁組織的miR-93的表達進行測定，采用Western方法對TFG-β1、CollagenⅢ的表達進行測定。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

正常成纖維細(xì)胞以及SUI成纖維細(xì)胞培養(yǎng)于含10%新生胎牛血清的良伊格爾培養(yǎng)基中，置于37℃、含有5%二氧化碳的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，常規(guī)傳代培養(yǎng)，取其對數(shù)生長期細(xì)胞進行實驗。

1.2.3 原代成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染

取對數(shù)期生長的細(xì)胞接種于96孔板中，接種密度為4×10個/孔。設(shè)對照組（Control）、陰性對照組（miR Negative Contronl，miRNC）、miR-93模擬組（miR-93 mimic）及其抑制劑組（miR-93 inhibitor）。對照組：Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染劑5μL；陰性對照組：Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染劑5μL以及100 nmol/L的miR-93陰性對照物；miR-93模擬組：加Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染劑5μL以及100 nmol/L的miR-93模擬物；抑制劑組：加Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染劑5μL及100 nmol/L的miR-93抑制劑，每組平行設(shè)置3個樣本，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。miR-93模擬物和miR-93抑制劑的引物序列：miR-93模擬物：5'-CAAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG-3'；miR-93抑制劑：5'-CUACCUGCACGAACAGCACUUUG-3'。

1.2.4 RT-PCR測定miR-93的表達

采用TRIzol（Invitrogen公司）從成纖維細(xì)胞以及陰道壁組織中分離提取RNA，測定樣品RNA的A，其值在1.8～2.0范圍內(nèi)滿足實驗要求。按照TaqMan miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作方法合成cDNA，引物序列見表3。取25μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為：94℃變性1min，60℃復(fù)變性1.5 min，72℃擴增2 min，共設(shè)35個循環(huán)。每組平行測定3次。數(shù)據(jù)以ABI Prism 7700 SDS軟件系統(tǒng)分析miR-93的表達。miR-93的PCR引物序列：miR-93正向：5'-AGTCTCTGGGCTGACTACATCACAG-3'；miR-93反向：5'-CTACTCACAAAACAGGAGTGGAATC-3'。

1.2.5 Western-blot法測定TGF-β1以及CollagenⅢ表達

采用放射性免疫印跡法提取成纖維細(xì)胞以及陰道壁組織中的蛋白。于4℃下，以12 000 r/min離心15 min。以雙吲哚丁酸蛋白試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。以常規(guī)法制備SDS-PAGE膠，以β-actin作為內(nèi)參，將50μg蛋白質(zhì)樣品進行上樣，在70 V電壓下電泳1.5 h后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜。采用5%的脫脂奶粉室溫下封裝。加入1∶250稀釋的TGF-β1抗體（Abcam公司）及1∶400稀釋的CollagenⅢ抗體（購于Santa Cruz Biotechnology），4℃下孵育12 h后，加入相對應(yīng)的二抗，室溫25℃下孵育1 h。ECL顯色，通過Image Lab 4.1圖像分析系統(tǒng)對膠片進行掃描分析。

1.2.6 熒光素酶報告分析miR-93、TFG-β1及CollagenⅢ表達的相關(guān)性

本部分采用293T細(xì)胞用于瞬時轉(zhuǎn)染的載體，將293T細(xì)胞以5×10個/孔的密度接種于24孔板上。采用miRecords預(yù)測TFG-β1的3’-UTR上miR-93可能的結(jié)合位點，構(gòu)建含有miRNA-93結(jié)合位點TFG-β1基因3’-UTR的序列，插入pmir-REPORT luciferase載體，隨后經(jīng)限制性內(nèi)切酶處理并進行純化鑒定。構(gòu)建含有pmir-REPORTTGFβ1-3’UTR的報告質(zhì)粒以及含有100 nmol/L的miR-93及陰性對照組的microRNAs在Lipofectamine孵育48 h，進行共轉(zhuǎn)染。隨后，收集細(xì)胞并用PBS洗滌2次，加入細(xì)胞裂解液后離心并收集裂解液進一步通過熒光素酶檢測系統(tǒng)對細(xì)胞進行熒光檢測。采樣品50μL，加入100μL螢火蟲熒光素酶檢測試劑混勻，以報告基因細(xì)胞溶解液為空白，測定螢火蟲熒光素酶相對光單位，即RLU值，隨后加入100μL海腎熒光酶檢測工作液，混勻后測定RLU值，以RLU螢火日熒光素酶/RLU海腎熒光素酶即為熒光素酶活性。實驗平行測定3次。

2 結(jié)果

2.1 研究對象一般情況

兩組年齡、分娩次數(shù)、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義，具有可比性。見表1。

表1 研究對象一般情況/±s

2.2 miR-93、TFG-β1以及CollagenⅢ在SUI病人陰道壁組織中的表達

miR-93在SUI病人陰道壁組織中的表達低于無SUI組（

t

=7.821，

P

=0.001），TFGβ1及CollagenⅢ在SUI病人陰道壁組織中的表達亦低于無SUI組（

t

=8.125，

P

=0.002）。見圖1、表2。

圖1 TFG-β1、CollagenⅢ在SUI病人及無SUI組陰道壁組織中的表達

表2 miR-93、TFG-β1、CollagenⅢ在SUI病人陰道壁組織中的表達/±s

2.3 miR-93、TFG-β1以及CollagenⅢ在原代成纖維細(xì)胞的表達

結(jié)合“2.1”項下結(jié)果，進一步測定了miR-93表達與TFG-β1及CollagenⅢ在SUI原代成纖維細(xì)胞（觀察組）及正常原代成纖維細(xì)胞（對照組）的表達。觀察組與對照組相比，miR-93表達降低（

t

=7.063，

P

=0.005），TFG-β1及CollagenⅢ在SUI原代成纖維細(xì)胞中的表達均降低（

t

=8.268，

P

=0.001）。見圖2、表3。

表3 miR-93、TFG-β1以及CollagenⅢ在原代成纖維細(xì)胞的表達/±s

圖2 TFG-β1、CollagenⅢ在SUI及無SUI組原代成纖維細(xì)胞的表達

2.4 miR-93、TFG-β1及CollagenⅢ表達相關(guān)性研究

miR-93基因可與TFG-β1基因結(jié)合，并且通過結(jié)合提高了TFG-β1的表達。本研究進一步通過Western測定miR-93過表達及抑制情況下對于TFG-β1調(diào)節(jié)作用，進一步證實miR-93過表達的情況下可以提高TFG-β1的表達，而當(dāng)miR-93的表達被抑制時，TFG-β1的表達亦表現(xiàn)為下調(diào)（

t

=6.590，

P

=0.007）。上述結(jié)果證實了TFG-β1是miR-93的調(diào)控靶標(biāo)。見圖3，表4。

圖3 miR-93陰性對照、過表達以及抑制劑對于TFG-β1表達的影響

表4 miR-93、TFG-β1及CollagenⅢ表達相關(guān)性研究/±s

3 討論

目前多數(shù)國內(nèi)學(xué)者對于SUI的研究集中在手術(shù)治療效果以及流行病學(xué)調(diào)查方面，基礎(chǔ)方面研究較少。國際上對于SUI的發(fā)病機制研究主要集中在三個方面：①由于多種原因使盆內(nèi)筋膜含量較少，從而導(dǎo)致盆底組織結(jié)構(gòu)支持力不足，使膀胱尿道等下移，腹壓增大時，壓力不能沿著陰道前壁以及恥骨宮頸筋膜進而傳遞至膀胱頸以及尿道，而更多地傳導(dǎo)至膀胱，使膀胱內(nèi)壓高于尿道的閉合壓，從而發(fā)生尿失禁的情況。如果盆底支撐組織膠原含量降低，導(dǎo)致膠原直徑代償性增粗，還會使尿道發(fā)生僵硬、出現(xiàn)閉合等現(xiàn)象；②由于神經(jīng)肌肉的功能障礙，從而導(dǎo)致盆底支持組織的結(jié)構(gòu)和功能改變，使膀胱頸和尿道的近端下移。

膠原蛋白在維持盆底結(jié)締組織的彈性和韌性方面發(fā)揮著重要作用。提肛肌通過膠原蛋白對尿道產(chǎn)生收縮作用。膠原變性后，肛提肌向尿道收縮，陰道壁吊床狀結(jié)構(gòu)的支撐作用減弱，導(dǎo)致尿失禁。本研究表明，在SUI病人陰道前壁組織以及SUI原代成纖維細(xì)胞中對比無SUI組Ⅲ型膠原蛋白含量降低，且miR-93及TFG-β1表達均呈現(xiàn)下調(diào)現(xiàn)象。盆底功能障礙性疾病主要包括盆底器官脫垂（pelvic organ prolapse，POP）和SUI，臨床經(jīng)驗表明有諸多病人在患有SUI的同時還伴有不同程度的POP，本研究在納入SUI對象時將患有中度及重度的POP病人排除在外，但有研究顯示，TFG-β1可能是治療POP的潛在靶點，提示miR-93亦可能通過介導(dǎo)TFG-β1從而調(diào)節(jié)膠原蛋白在POP病人中的表達。其機制是TFG-β1可以刺激細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)中大部分膠原基因和膠原產(chǎn)物的增加。TFG-β1是與膠原代謝最密切相關(guān)的細(xì)胞因子。miR-29b可通過調(diào)控TGF-β1/Smad信號通路，故其是TFG-β1的正向調(diào)控因子。課題組后期將對miR-93與盆底功能障礙性疾病的關(guān)系進一步深入探索。

綜上所述，SUI病人中，miR-93表達降低，介導(dǎo)TGF-β1表達下調(diào)，最終導(dǎo)致膠原Ⅲ含量降低。