劉仁海，穆伽俐，陳小蓮，張玉佳，高霞，李黎黎，羅琴，馮秋秋，何思宇，蒲丹嵐

糖尿病腎病是糖尿病常見并發(fā)癥之一，并可促進(jìn)終末期腎病的發(fā)生，其中腎小管間質(zhì)纖維化是造成慢性腎病發(fā)展的重要原因。研究表明上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）在腎小管間質(zhì)纖維化形成過程中發(fā)揮重要作用，其中氧化應(yīng)激、微小RNA（miRNA）、信號通路等與EMT的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)。微小RNA-126-5p（miR-126-5p）在脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷中呈低表達(dá)，上調(diào)miR-126-5p表達(dá)可減輕急性肺損傷。生物信息學(xué)分析顯示pellino E3泛素蛋白連接酶家族成員2（Peli2）可能是miR-126-5p的靶基因，研究表明Peli2表達(dá)量升高可加重脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷。本研究從2018年12月至2019年12月期間通過高糖誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞模擬糖尿病腎病環(huán)境，驗(yàn)證miR-126-5p是否可通過靶向Peli2抑制糖尿病腎病腎小管上皮細(xì)胞EMT發(fā)生。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人腎小管上皮細(xì)胞HK-2購自美國ATCC公司；D-葡萄糖購自上海甄準(zhǔn)生物；Lipofectamine2000購自美國Invitrogen；miR-126-5p寡核苷酸模擬物（miR-126-5p mimics）及陰性對照mimic NC序列（miR-NC）、Peli2小干擾RNA（si-Peli2）、亂序無意義陰性序列（si-NC）購自廣州銳博生物；pcDNA3.1購自武漢淼靈生物；Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒均購自日本TaKaRa；RIPA裂解液購自上海聯(lián)邁生物；二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）購自杭州弗德生物；兔抗人Peli2抗體購自美國CST公司；兔抗人上皮型鈣黏蛋白（ECadherin）、神經(jīng)型鈣黏蛋白（N-Cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、鋅指蛋白（Snail）抗體購自北京中杉金橋生物；山羊抗兔二抗購自武漢艾美捷。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組

收集對數(shù)期HK-2細(xì)胞，使用含有30 mmol/L的D-葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，記作HG組；使用含有5 mmol/LD-葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，記作對照組。收集對數(shù)期HK-2細(xì)胞接種于6孔板，分為miR-NC+HG組（miR-NC轉(zhuǎn)染至HK-2細(xì)胞，使用含有30 mmol/L的D-葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h）；miR-126-5p+HG組（miR-126-5p mimics轉(zhuǎn)染至HK-2細(xì)胞，使用含有30 mmol/L的D-葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h）；si-NC+HG組（si-NC轉(zhuǎn)染至HK-2細(xì)胞，使用含有30 mmol/L的D-葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h）；si-Peli2+HG組（si-Peli2轉(zhuǎn)染至HK-2細(xì)胞，使用含有30 mmol/L的D-葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h）；miR-126-5p+HG+pcDNANC組（miR-126-5p mimics與pcDNA-NC共轉(zhuǎn)染至HK-2細(xì)胞，使用含有30 mmol/L的D-葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h）；miR-126-5p+HG+pcDNA-Peli2組（miR-126-5p mimics與pcDNA-Peli2共轉(zhuǎn)染至HK-2細(xì)胞，使用含有30 mmol/L的D-葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h）。

1.2.2 qRT-PCR檢測細(xì)胞中miR-126-5p、Peli2 mRNA的表達(dá)水平

采用Trizol法提取細(xì)胞中總RNA，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：95℃2 min（循環(huán)1次），95℃30 s，60℃30 s，72℃30 s（循環(huán)40次）。miR-126-5p以U6小核RNA（U6 small nuclearRNA，U6）為內(nèi)參，Peli2以β肌動蛋白（β-actin）為內(nèi)參，采用2法計(jì)算miR-126-5p、Peli2 mRNA的相對表達(dá)量。

1.2.3 雙熒光素酶報告基因檢測miR-126-5p的靶基因

將含有結(jié)合位點(diǎn)及突變位點(diǎn)的Peli2-3’UTR插入熒光素酶報告基因載體構(gòu)建野生型報告質(zhì)粒WTPeli2、突變型報告質(zhì)粒MUT-Peli2，分別將WT-Peli2、MUT-Peli2與miR-NC、miR-126-5p mimics共轉(zhuǎn)染至HK-2細(xì)胞，參照熒光素酶活性檢測試劑盒檢測各組細(xì)胞相對熒光素酶活性。參照Lipofectamine2000試劑說明書分別將miR-NC、miR-126-5p mimics、antimiR-NC、anti-miR-126-5p轉(zhuǎn)染至HK-2細(xì)胞，通過Western blot檢測各組細(xì)胞中Peli2蛋白相對表達(dá)量。

1.2.4 Western blot檢測Peli2、E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin、Snail蛋白表達(dá)

收集各組HK-2細(xì)胞加入RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，用SDS-PAGE分離蛋白，將電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至PVDF膜，封閉2 h，加入一抗稀釋液（Peli2稀釋比1∶800、E-Cadherin稀釋比1∶1 000、N-Cadherin稀釋比1∶1 000、Vimentin稀釋比1∶1 000、Snail稀釋比1∶1 000）4℃孵育24 h，加入二抗稀釋液（稀釋比1∶5 000），TBST洗滌，暗室內(nèi)曝光顯影，應(yīng)用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 在腎小管上皮細(xì)胞HK-2中，Peli2和miR-126

-

5p表達(dá)情況

與對照組相比，模型組細(xì)胞中miR-126-5p的表達(dá)水平降低（

t

=19.540，

P

＜0.05），Peli2 mRNA及蛋白表達(dá)水平升高（

t

=19.837，16.147；

P

＜0.05），見圖1、表1。

表1 腎小管上皮細(xì)胞HK-2中miR-126-5p和Peli2表達(dá)量/±s

圖1 Western Blot檢測Peli2蛋白的表達(dá)

2.2 miR-126-5p高表達(dá)抑制高糖處理的腎小管上皮細(xì)胞HK-2發(fā)生EMT

與對照組相比，模型組細(xì)胞中E-Cadherin蛋白相對表達(dá)量降低（

t

=15.535；

P

＜0.05），N-Cadherin、Vimentin、Snail蛋白相對表達(dá)量升高（

t

=14.490，18.974，19.282；均

P

＜0.05）；與miRNC+HG組相比，miR-126-5p+HG組細(xì)胞中E-Cadherin蛋白相對表達(dá)量升高（

t

=14.396；

P

＜0.05），NCadherin、Vimentin、Snail蛋白相對表達(dá)量降低（

t

=12.166，12.611，13.396；均

P

＜0.05），見圖2。表明miR-126-5p過表達(dá)可抑制高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT。見表2。

圖2 miR-126-5p高表達(dá)的腎小管上皮細(xì)胞E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin和Snail蛋白的表達(dá)

表2 miR-126-5p高表達(dá)抑制高糖處理的腎小管上皮細(xì)胞HK-2發(fā)生EMT/±s

2.3 Peli2低表達(dá)抑制高糖處理的腎小管上皮細(xì)胞HK-2發(fā)生EMT

與si-NC+HG組相比，si-Peli2+HG組細(xì)胞中Peli2蛋白相對表達(dá)量降低（

t

=11.732，

P

＜0.05），E-Cadherin蛋白相對表達(dá)量升高（

t

=18.120，

P

＜0.05），N-Cadherin、Vimentin、Snail蛋白相對表達(dá)量降低（

t

=12.692，16.155，12.652；

P

＜0.05）。表明抑制Peli2的表達(dá)可抑制高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT，見表3、圖3。

圖3 Peli2低表達(dá)的腎小管上皮細(xì)胞E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin和Snail蛋白的表達(dá)

表3 Peli2低表達(dá)抑制高糖處理的腎小管上皮細(xì)胞HK-2發(fā)生EMT/±s

2.4 miR-126-5p靶向Peli2的表達(dá)

starBase預(yù)測顯示miR-126-5p與Peli2存在結(jié)合位點(diǎn)，見圖4A。轉(zhuǎn)染野生型報告質(zhì)粒WT-Peli2的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，miR-126-5p組熒光素酶活性顯著低于miR-NC組（

t

=14.942；

P

＜0.05）。與miR-NC組相比，miR-126-5p組細(xì)胞中Peli2蛋白相對表達(dá)量顯著降低（

t

=16.713；

P

＜0.05）；與anti-miR-NC組相比，anti-miR-126-5p組細(xì)胞中Peli2蛋白相對表達(dá)量顯著升高（

t

=10.062；

P

＜0.05），見圖4、表4。表明miR-126-5p可靶向結(jié)合Peli2，并可負(fù)向調(diào)控Peli2的表達(dá)。

表4 miR-NC或miR-126-5p與報告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞后雙熒光素酶活性檢測/±s

圖4 miR-126-5p靶向Peli2的表達(dá)：A為starbase對miR-126-5p和Peli2結(jié)合進(jìn)行預(yù)測示意圖；B為Western Blot檢測Peli2蛋白的表達(dá)

2.5 Peli2高表達(dá)可以部分反轉(zhuǎn)miR-126-5p高表達(dá)對高糖處理的HK-2的EMT的影響

與miR-126-5p+HG+pcDNA-NC組相比，miR-126-5p+HG+pcDNA-Peli2組細(xì)胞中E-Cadherin蛋白相對表達(dá)量顯著降低（

t

=12.746，

P

＜0.05），N-Cadherin、Vimentin、Snail蛋白相對表達(dá)量顯著升高（

t

=11.655，13.416，12.652；

P

＜0.05）。表明Peli2過表達(dá)可減弱miR-126-5p過表達(dá)對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞EMT的作用。見圖5和表5，6。

表5 Western Blot檢測Peli2的表達(dá)/±s

圖5 Western Blot檢測Peli2、E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin和Snail

3 討論

miR-126在冠心病等血管性疾病中異常表達(dá)并可參與多種疾病發(fā)生及發(fā)展過程。miR-126-5p在帕金森病中低表達(dá)，并可參與該疾病發(fā)展過程。miR-126-5p高表達(dá)可促進(jìn)視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞存活。長的非編碼RNA PRNCR1通過調(diào)控miR-126-5p的表達(dá)從而調(diào)節(jié)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞生物學(xué)行為。本研究顯示高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞中miR-126-5p的表達(dá)水平降低，證實(shí)miR-126-5p能夠靶向結(jié)合Peli2，并可負(fù)向調(diào)控Peli2的表達(dá)。本研究顯示高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞中Peli2的表達(dá)水平明顯升高，其表達(dá)量與miR-126-5p的表達(dá)量趨勢相反。

表6 Peli2高表達(dá)可以部分反轉(zhuǎn)miR-126-5p高表達(dá)對高糖處理的HK-2的EMT的影響/±s

腎小管上皮細(xì)胞EMT過程可促進(jìn)腎小管間質(zhì)纖維化的發(fā)生，E-Cadherin表達(dá)量降低可促進(jìn)EMT發(fā)生，N-Cadherin、Vimentin、Snail屬于間質(zhì)表型標(biāo)志物，其表達(dá)量降低可抑制EMT發(fā)生。研究表明EMT轉(zhuǎn)化可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞遷移及侵襲能力從而促進(jìn)癌癥進(jìn)展。本研究結(jié)果顯示，高糖處理后腎小管上皮細(xì)胞中E-Cadherin表達(dá)量降低，N-Cadherin、Vimentin、Snail表達(dá)量升高，miR-126-5p過表達(dá)能夠抑制高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞EMT的發(fā)生，而Peli2過表達(dá)可逆轉(zhuǎn)miR-126-5p過表達(dá)對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞EMT的影響。提示miR-126-5p過表達(dá)能夠靶向Peli2從而抑制高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞EMT的發(fā)生。

綜上所述，高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞miR-126-5p表達(dá)下調(diào)，Peli2表達(dá)上調(diào)，miR-126-5p過表達(dá)可抑制Peli2、N-Cadherin、Vimentin、Snail表達(dá)，并可促進(jìn)E-Cadherin表達(dá)從而調(diào)控EMT發(fā)生過程，可為揭示腎小管上皮細(xì)胞EMT發(fā)生的分子機(jī)制提供新方向。