朱琳

腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā) 性惡性腫瘤。目前，最大限度的手術(shù)切除，術(shù)后輔以放化療是神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療的主要方法。其中替莫唑胺（Temozolomide，TMZ）在腦膠質(zhì)瘤，尤其是神經(jīng)膠質(zhì)母細胞瘤（WHOⅣ）治療上取得了成功，其明顯降低了術(shù)后復(fù)發(fā)率，大大提高了腦膠質(zhì)瘤的生存率。目前替莫唑胺是臨床治療腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤的一線化療藥物。但隨著用藥周期的延長，幾乎所有初始治療有效的病人都會出現(xiàn)病情進展，產(chǎn)生替莫唑胺耐藥（Temozolomide Resistance，TR）。其耐藥機制尚未完全明確。

環(huán)狀RNA（Circular RNA，circRNA）是一類新型的內(nèi)源性非編碼RNA（noncoding RNA，ncRNA），其特征是3'和5'端以閉環(huán)結(jié)構(gòu)共價連接，因此circRNA不易受核酸內(nèi)切酶的影響，在體內(nèi)表達穩(wěn)定，是目前較為理想的疾病診斷生物標志物，以及分子生物治療靶點。circRNA可通過多種途徑發(fā)揮腫瘤調(diào)控作用，但目前研究較為清楚的是其微小RNA（microRNA，miRNA）海綿作用，circRNA通過miRNA海綿競爭性的與靶miRNA結(jié)合，使miRNA降解或者失去調(diào)控功能，進而調(diào)控miRNA下游靶基因的表達水平。目前研究表明，circRNA在非小細胞肺癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、肝癌、胃癌等多種腫瘤中異常表達，而且環(huán)狀RNA（circRNA）-微小RNA（miRNA）-信使RNA（mRNA）調(diào)控網(wǎng)絡(luò)也參與了多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、放療抵抗，以及化療耐藥等過程。但目前circRNA以及circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤替莫唑胺中研究較少。

因此，本研究以人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤替莫唑胺耐藥細胞株U87/TR以及其親本細胞株U87為細胞模型，通過高通量circRNA芯片比較其circRNAs表達譜差異，并初步篩選關(guān)鍵circRNAs，并預(yù)測circRNAmiRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為進一步深入研究circRNA在腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤替莫唑胺耐藥中的作用及其分子機制提供依據(jù)。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1 材料與方法

1.1 主要材料試劑

人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤替莫唑胺耐藥U87/TR細胞株以及其親本U87細胞株購買于上海弘順生物科技有限公司（規(guī)格BW124577）。RPMI-1640培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶購自美國GIBCO公司。RNeasy Mini Kit購自德國Qiagen公司，RT-PCR試劑盒等購自美國Sigma公司。circRNA芯片的制備與雜交由上海吉凱生物科技公司完成。

1.2 方法

1.2.1 circRNA芯片檢測及數(shù)據(jù)分析

用RNeasy Mini Kit（Qiagen，Hilden，德國）提取人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤替莫唑胺耐藥U87/TR細胞株以及其親本U87細胞株總RNA（n=3）。使用NanoDrop ND-1000量化每個樣品的總RNA。樣品制備和微陣列雜交是根據(jù)美國Arraystar公司的標準方案進行的。總RNA用Rnase R消化以除去線性RNA并富集環(huán)狀RNA。然后，將富集的環(huán)狀RNA擴增并轉(zhuǎn)錄為熒光cRNA（Arraystar超級RNA標記試劑盒；Arraystar）。標記的cDNA（complementary DNA）探針與美國Arraystar人源性環(huán)形RNA芯片2.0版Arraystar Human circRNA Array V2（8x15K，Arraystar）雜交。使用安捷倫功能提取軟件（版本11.0.1.1）來分析獲取的陣列圖像。使用R軟件Limma軟件包執(zhí)行分位數(shù)歸一化和后續(xù)數(shù)據(jù)處理。通過火山圖（Volcano Plot）過濾鑒定了兩組之間表達circRNA差異有統(tǒng)計學(xué)意義。通過倍數(shù)變化過濾鑒定了兩個樣品之間差異表達的circRNA。進行了層次聚類，以顯示樣品之間可區(qū)別的circRNA表達模式。

1.2.2 RT-PCR芯片結(jié)果驗證

將circRNA芯片分析結(jié)果中差異表達倍數(shù)及信號值較高的4個circRNAs行RT-PCR分析，分布為上調(diào)的circRNAs：人環(huán) 狀 RNAhsa_circRNA_009054，hsa_circRNA_104338；和下調(diào)的circRNAs：hsa_circRNA_016459，hsa_circRNA_101975，進一步驗證芯片檢測結(jié)果的可靠性。利用軟件Primer Premier 5.0設(shè)計引物（表1）。以U87和U87/TR細胞總RNA 2μg為模板，進行逆轉(zhuǎn)錄，以GAPDH作為內(nèi)參照。按照試劑盒操作進行PCR反應(yīng)，條件為：95℃30 s；95℃5 s，60℃31 s，擴增40個循環(huán)。以2表示circRNA的表達水平，實驗重復(fù)3次。

表1 引物設(shè)計

1.2.3 生物信息學(xué)分析

運用Miranda v5數(shù)據(jù)庫（http：//www.ebi.ac.uk/enright-srv/microcosiTi/htdocs/targets/v5）預(yù)測circRNA-miRNA結(jié)合關(guān)系以及結(jié)合位點。miRNA靶基因預(yù)測軟件：miRanda v5（http：//www.ebi.ac.uk/enright-srv/microcosiTi/htdo/targets/v5），TargetScan（http：//www.targetscan.org）和mi-Base（http：//pictar.bio.nyu.edu）。circRNA-miRNAmRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)通過Cytoscape軟件進行可視化（Version 3.6.1：http：//cytoscape.org/）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 18.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，兩組細胞間各circRNAs水平差異分析采用配對樣本

t

檢驗，

P

＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 circRNA差異表達譜

circRNA芯片數(shù)據(jù)經(jīng)過標準化處理和統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果顯示，與親本U87細胞株相比，在U87/TR細胞株中，共鑒定出313個差異有統(tǒng)計學(xué)意義表達的circRNAs，其中包括145個明顯上調(diào)的circRNA和168個明顯下調(diào)的circRNA，成功建立神經(jīng)膠質(zhì)瘤替莫唑胺耐藥相關(guān)circRNA差異表達譜。層次聚類分析篩選顯示了顯著上調(diào)的下調(diào)的前10位circRNAs。表2，3列出了顯著上調(diào)和下調(diào)的前10位circRNAs詳細信息。

表2 在U87/TR細胞株中鑒定出較親本U87細胞株上調(diào)的前10位circRNAs

2.2 RT-PCR驗證芯片結(jié)果

為了進一步證實circRNA芯片的準確性，我們將circRNA芯片分析結(jié)果中差異表達倍數(shù)及信號值較高的4個關(guān)鍵circRNAs行RT-PCR分析驗證（上下調(diào)circRNAs各2個），RTPCR結(jié)果顯示，相比較于U87細胞，hsa_circRNA_009054和hsa_circRNA_104338在U87/TR細胞中顯著高表達（

n

=3，

t

=12.09、9.52，

P

=0.007、0.011），hsa_circRNA_016459和hsa_circRNA_101975在U87/TR細胞中明顯低表達（

n

=3，

t

=13.86、7.75，

P

=0.005、0.016），而且RT-qPCR結(jié)果與circRNA芯片結(jié)果相符（表4），證實了circRNA芯片的準確性。從而鑒定了hsa_circRNA_009054，hsa_circRNA_104338（上調(diào)）以 及hsa_circRNA_016459，hsa_circRNA_101975（下調(diào)）4個神經(jīng)膠質(zhì)瘤替莫唑胺耐藥相關(guān)的關(guān)鍵circRNAs。

表4 RT-PCR驗證結(jié)果與circRNA芯片檢測結(jié)果對比

2.3 circRNA-miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

同時，我們通過miRanda v5數(shù)據(jù)庫對鑒定的關(guān)鍵circRNAs進行miRNA靶位點預(yù)測。miRNA靶位點預(yù)測結(jié)果顯示，hsa_circRNA_009054，hsa_circRNA_104338以及hsa_circRNA_016459，hsa_circRNA_101975均可與多個miRNAs靶向結(jié)合，hsa_circRNA_009054排名前五位的miRNA分別為：hsa-miR-33a-5p，hsamiR-4685-5p，hsa-miR-6855-5p，hsa-miR-2467-5p，hsa-miR-4446-3p；hsa_circRNA_009054排名前五位的miRNA分別為：hsa-miR-15b-3p，hsa-miR-550a-5p，hsa-miR-509-5p，hsa-miR-1224-3p，hsa-miR-758-5p；hsa_circRNA_009054排名前五位的miRNA分 別 為：hsa-miR-193b-5p，hsa-miR-134-5p，hsamiR-4439，hsa-miR-6820-5p，hsa-miR-5190；hsa_circRNA_009054排名前五位的miRNA分別為：hsa-miR-23a-5p，hsa-miR-423-5p，hsa-miR-875-3p，hsamiR-877-3p，hsa-miR-30b-3p。通過生物信息學(xué)分析，我們進一步預(yù)測了hsa_circRNA_009054，hsa_circRNA_104338以及hsa_circRNA_016459，hsa_circRNA_101975與其排名第一位的靶向miRNA的具體結(jié)合位點（分別為：hsa-miR-33a-5p，hsamiR-15b-3p以 及hsa-miR-193b-5p，hsa-miR-23a-5p），見圖1。從而鑒定了hsa-miR-33a-5p，hsa-miR-15b-3p以及hsa-miR-193b-5p，hsa-miR-23a-5p 4個神經(jīng)膠質(zhì)瘤替莫唑胺耐藥相關(guān)的關(guān)鍵miRNAs，構(gòu)建了神經(jīng)膠質(zhì)瘤替莫唑胺耐藥相關(guān)的circRNA-miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

圖1 關(guān)鍵circRNAs與關(guān)鍵miRNAs靶向結(jié)合位點的詳細注釋圖

表3 在U87/TR細胞株中鑒定出較親本U87細胞株下調(diào)的前10位circRNAs

2.4 circRNA-miRNA-mRNAs調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

進一步我們通過miRanda v5、TargetScan、miBase數(shù)據(jù)庫對關(guān)鍵miRNAs.進行靶基因預(yù)測，并通過Cytoscape軟件對circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進行可視化分析。從而構(gòu)建了神經(jīng)膠質(zhì)瘤替莫唑胺耐藥相關(guān)的circRNA-miRNA-mRNAs調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，我們預(yù)測的circRNA-miRNA-mRNAs調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，包括4個關(guān)鍵circRNAs，20個關(guān)鍵miRNAs，以及278個關(guān)鍵mRNAs。這些關(guān)鍵circRNAs，miRNAs，以及mRNAs通過網(wǎng)絡(luò)互相作用，影響神經(jīng)膠質(zhì)瘤替莫唑胺耐藥過程。

3 討論

腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤替莫唑胺耐藥仍是臨床亟待解決的關(guān)鍵問題。目前研究認為，DNA損傷修復(fù)機制，如O-甲基鳥嘌呤-DNA-甲基轉(zhuǎn)移酶（MGMT），DNA錯配修復(fù)（mismatch repair，MMR），堿基切除修復(fù)（base excision repair，BER）；腫瘤微環(huán)境；腫瘤細胞自噬；p53、EGFR、PI3K/AKT、JAK2/STAT3等信號通路等異常激活與失活、非編碼RNA調(diào)控均可能與腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤替莫唑胺耐藥相關(guān)，但其具體機制尚未完全闡述。其中非編碼RNA調(diào)控與腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤替莫唑胺耐藥的相關(guān)性越來越受到重視。

circRNAs表達較線性RNA穩(wěn)定，而且在體內(nèi)的表達量是線性RNA的10倍以上。研究表明，circRNA的異常表達與調(diào)控作用與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，而circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)成為腫瘤研究的重要方向。在非小細胞肺癌中，有研究 表 明，hsa_circ_0087862可 通 過 靶 向miR-1253/RAB3D軸在非小細胞肺癌中發(fā)揮癌基因作用，circ_FGFR1可通過miR-381-3p促進在非小細胞肺癌細胞的進展以及PD-1耐藥。在乳腺癌中，有研究 發(fā) 現(xiàn)，Hsa_circ_0091074可 通 過microRNA-1297促進三陰性乳腺癌細胞的進展，circ-ABCB10可通過Let-7a-5p/DUSP7軸促進乳腺癌的紫杉醇耐藥。在胃癌中，有報道稱，circRNA_100876可通過抑制miR-136上調(diào)MIEN1的表達增強胃癌的增殖和轉(zhuǎn)移能力，circ_CCDC66可通過miR-618/BCL2軸促進胃癌的順鉑耐藥。這些研究表明circRNA以及circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)參與了多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，以及耐藥等演進過程。但目前circRNA以及circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤替莫唑胺中未見相關(guān)研究。

在我們研究中，我們選取了人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤替莫唑胺耐藥U87/TR細胞株以及其親本U87細胞株為細胞模型，通過高通量circRNA芯片篩選其circRNAs表達譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)倆細胞株之間存在313個差異有統(tǒng)計學(xué)意義表達的circRNAs，其中包括145個明顯上調(diào)的circRNA和168個明顯下調(diào)的circRNA，說明腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤替莫唑胺耐藥伴隨著circRNA的改變，為篩選關(guān)鍵circRNAs，我們選取上下調(diào)差異倍數(shù)最高的兩個circRNA進行PR-PCR驗證，其結(jié)果與芯片相符，我們通過miRNA預(yù)測，以及靶基因預(yù)測，構(gòu)建了circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，這個包括hsa_circRNA_009054，hsa_circRNA_104338 和 hsa_circRNA_016459，hsa_circRNA_101975 4個 關(guān) 鍵circRNAs，hsa-miR-33a-5p，hsamiR-15b-3p以及hsa-miR-193b-5p，hsa-miR-23a-5p等20個關(guān)鍵miRNAs，以及THOC2，TP53，STAT5B，RORC等與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)278個關(guān)鍵mRNAs。這些關(guān)鍵circRNAs，miRNAs，以及mRNAs可能通過網(wǎng)絡(luò)互相作用，影響神經(jīng)膠質(zhì)瘤替莫唑胺耐藥過程。但目前的研究仍無法直接證明circRNAs對腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤替莫唑胺耐藥的調(diào)控作用，接下來，我們課題組將向U87/TR細胞株轉(zhuǎn)染關(guān)鍵circRNA過表達和干擾質(zhì)粒，建立過表達或干擾circRNA細胞模型，鑒定circRNA對U87/TR細胞株生物學(xué)行為的影響，明確circRNA下游的具體的miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其機制。

綜上所述，我們的研究構(gòu)建了替莫唑胺耐藥相關(guān)的關(guān)鍵circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為深入研究circRNA在腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤替莫唑胺耐藥中的作用及其分子機制提供了實驗依據(jù)和前期基礎(chǔ)。