徐漢橋，方軍，張梁

肺癌是一個多基因共同調(diào)控的復(fù)雜事件，盡管圍繞肺癌機(jī)制的研究取得了部分進(jìn)展，但臨床治療肺癌的藥物效果并不理想，因此尋找新的有效的治療靶點(diǎn)一直是包括肺癌在內(nèi)的腫瘤研究的熱點(diǎn)。我們采用生物信息學(xué)軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，微RNA（miR）-130a與人類RUNT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子3（RUNX3）3’非翻譯區(qū)（UTR）存在互補(bǔ)的核苷酸序列，猜測miR-130a可能通過靶向調(diào)控RUNX3介導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展。為了驗(yàn)證上述猜測，本研究于2018年2月至2019年5月以肺癌A549細(xì)胞為研究對象，通過觀察miR-130a與RUNX3的靶向關(guān)系以及其對A549細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響，旨在闡明miR-130a在肺癌發(fā)生中的作用，以期為以miR-130a為靶點(diǎn)的肺癌治療提供新的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549（中科院上海細(xì)胞庫），胰蛋白酶、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）試劑和青鏈霉雙抗（美國Sigma公司）。兔抗人上皮型鈣黏蛋白（E-cadherin）、神經(jīng)型鈣黏蛋白（N-cadherin）和波形蛋白（Vimentin）多克隆抗體（英國Abcam公司），辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗（北京中杉金橋生物公司），DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和Transwell小室（美國Hyclone公司），Matrigel基質(zhì)膠（美國BD公司），miR-130a mimics、miR-130a inhibitor及其對照和RUNX3-siRNA及對照NC-siRNA（上海吉瑪公司）。轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體2000、青鏈霉素（美國Invitrogen公司），鼠抗人RUNX3單克隆抗體和β-actin多克隆抗體（美國Santa Cruz公司），聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）（瑞典Amersham公司），脫脂奶粉（北京鼎國生物公司），Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）試劑盒和PCR擴(kuò)增相關(guān)試劑（大連TaKaRa公司），BCA蛋白定量試劑盒、熒光素酶報告基因檢測試劑盒和十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠配制試劑盒（上海碧云天公司），總蛋白提取試劑盒和ECL試劑盒（上海凱基生物公司）。二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Formascientific公司），熒光倒置顯微鏡（日本Nikon公司），熒光定量PCR儀（澳大利亞Corbett公司），凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 A549細(xì)胞培養(yǎng)、實(shí)驗(yàn)分組與轉(zhuǎn)染

以DMEM培養(yǎng)基（含100 mL/L胎牛血清+100 kU/L青鏈霉雙抗）于5%二氧化碳、95%相對濕度和37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)A549細(xì)胞。將對數(shù)生長期的A549細(xì)胞以10個/孔的密度接種至6孔細(xì)胞板上，常規(guī)培養(yǎng)過夜。實(shí)驗(yàn)分為對照組（未處理）、anti-miR-NC組（轉(zhuǎn)染miR-130 inhibitor陰性對照）、anti-miR-130a組（轉(zhuǎn)染miR-130a inhibitor）、anti-miR-130a+siNC組（轉(zhuǎn)染miR-130a inhibitor和NC-siRNA）和anti-miR-130a+siRUNX3（轉(zhuǎn)染miR-130a inhibitor和RUNX3-siRNA）。待細(xì)胞匯合度高于75%時，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組并參照脂質(zhì)體2000說明書步驟將miRNAs和siRNAs轉(zhuǎn)染至相應(yīng)的A549細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48 h后，收集各組細(xì)胞分別用于miR-130a、RUNX3 mRNA和蛋白表達(dá)以及細(xì)胞增殖、侵襲、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的檢測。

1.2.2 實(shí)時熒光定量PCR檢測A549細(xì)胞中miR-130a和RUNX3 mRNA的表達(dá)

以Trizol法提取A549細(xì)胞的總RNA，并將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)DNA（cDNA）。以cDNA為模板，配制20μLPCR反應(yīng)體系（2μL cDNA、各0.8μL正反向引物、10μLSYBRPreix EXTaqⅡ、0.4μLROXReference Dye和6μL雙蒸水），設(shè)定PCR擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性20 s、（95℃變性15 s、58℃退火30s、72℃延伸30s）循環(huán)38次，以U6和β-肌動蛋白（β-actin）作為內(nèi)參基因，2法計算A549細(xì)胞中miR-130a和RUNX3mRNA的相對表達(dá)量。miR-130a引物（正向：5’-TTCACATTGTGCTACTGTCTGC-3’，反向：5’-GCTCTGACTTTATTGCACTACT-3’）、U6引物（正向：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反 向：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’）、RUNX3引物（正向：5’-CAGTGGGCGAGGGAAGAGT-3’，反向：5’-CGGGAGGTAGGTATGGTAA-3’）和β-actin引物（正向：5’-GGCGGCAACACCATGTACCCT-3’，反向：5’-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3’）是由上海吉瑪公司合成。

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）檢測A549細(xì)胞中RUNX3蛋白和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白的表達(dá)

參照總蛋白提取試劑盒抽提A549細(xì)胞的總蛋白，并采用BCA法檢測總蛋白的濃度與純度。將蛋白樣品與上樣緩沖液（2×）等體積混合煮沸5 min。參照SDSPAGE試劑盒配制SDS-PAGE凝膠，以每孔80μg行電泳分離。轉(zhuǎn)至PVDF膜后，浸泡于含5%脫脂奶粉的封閉液中室溫封閉2 h。加入一抗（RUNX3 1∶500、E-cadherin 1∶1 000、N-cadherin 1∶1 000和Vimentin 1∶1 000）于4℃下與目的蛋白特性性結(jié)合24 h。封閉液洗膜5分鐘/次，共3次。再加入二抗（1∶2 000）室溫下孵育1 h。參照ECL試劑盒顯影曝光后，以β-actin為內(nèi)參，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法（MTT法）檢測A549細(xì)胞存活率

將轉(zhuǎn)染后的各組A549細(xì)胞按照10個/孔的密度接種于96孔細(xì)胞板上。每個處理設(shè)5個平行孔，并設(shè)置一組不含細(xì)胞的培養(yǎng)基作為空白組。常規(guī)培養(yǎng)48 h后，給予20μLMTT試劑（5 g/L）作用細(xì)胞，4 h后以100μL二甲基亞砜溶解紫色結(jié)晶。選取檢測波長為570 nm，酶標(biāo)儀測定各組細(xì)胞吸光度OD值，并計算出各組細(xì)胞的存活率。計算公式：細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值）/（對照組OD值-空白組OD值）×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測A549細(xì)胞的克隆形成能力

取12孔細(xì)胞板，將轉(zhuǎn)染后的各組A549細(xì)胞按照10個/孔的密度進(jìn)行鋪板，常規(guī)培養(yǎng)2周左右（每隔3 d換液）。當(dāng)形成肉眼可見克隆時，取出培養(yǎng)板棄上清液。先以磷酸緩沖液洗滌細(xì)胞后，分別采用4%多聚甲醛和0.5%結(jié)晶紫對A549細(xì)胞進(jìn)行固定與染色。染色結(jié)束后，洗滌風(fēng)干，置于顯微鏡下統(tǒng)計有效克隆數(shù)（超過50個細(xì)胞的集落），并計算各組細(xì)胞的克隆形成率。計算公式：克隆形成率（%）=（有效克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 Transwell小室檢測A549細(xì)胞的侵襲和遷移能力

采用無血清培養(yǎng)基調(diào)整轉(zhuǎn)染后的各組A549細(xì)胞濃度，使其每毫升含有10個細(xì)胞。將以Matrigel膠包被或不包被的Transwell小室放于12孔細(xì)胞板中，下室中加入含血清的培養(yǎng)基500μL，上室中加入細(xì)胞液200μL。常規(guī)培養(yǎng)24 h后，取出小室。使用棉簽小心除去上室內(nèi)的細(xì)胞，并以4%多聚甲醛固定和0.5%結(jié)晶紫對下層細(xì)胞進(jìn)行固定與染色。沖洗晾干后，置于倒置顯微鏡下觀察（隨機(jī)選取5個視野）侵襲細(xì)胞數(shù)或遷移細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7 熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測miR-130a和RUNX3的靶向關(guān)系

采用生物信息學(xué)軟件預(yù)測miR-130a與RUNX3 3’UTR存在互補(bǔ)的核苷酸序列，構(gòu)建突變型（RUNX3-MUT）和野生型（RUNX3-WT）的RUNX3 3’UTR熒光素酶載體，參照脂質(zhì)體2000行miR-NC（miR-130a mimics陰性對照）+RUNX3-WT、miR-130a（miR-130a mimics）+RUNX3-WT、miR-NC+RUNX3-MUT、miR-130a+RUNX3-MUT四組共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h后，參照熒光素酶活性檢測試劑盒檢測各組細(xì)胞的熒光素酶活性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 RUNX3是miR-130a的潛在靶基因

采用生物信息學(xué)軟件TargetScan預(yù)測結(jié)果（表1）顯示，miR-130a與RUNX3 3’UTR存在互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)。進(jìn)一步采用熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測顯示，四組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（

F

=75.960，

P

＜0.001），與miR-NC+RUNX3-WT組（1.01±0.07）相比，miR-130a+RUNX3-WT組（0.42±0.04）細(xì)胞的熒光素酶活性顯著下降（

t

=12.675，

P

＜0.05），而miR-NC+RUNX3-MUT組（0.98±0.05）和miR-130a+RUNX3-MUT組（0.96±0.06）之間細(xì)胞的熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（

t

=0.444，

P=

0.680）。

表1 微RNA（miR）-130a與人類RUNT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子3（RUNX3）3’UTR的結(jié)合位點(diǎn)

2.2 轉(zhuǎn)染miR-130a inhibitor和RUNX3-siRNA使A549細(xì)胞中miR-130a和RUNX3表達(dá)的表達(dá)降低

與對照組相比，轉(zhuǎn)染miR-130a inhibitor可成功下調(diào)A549細(xì)胞中miR-130a的表達(dá)水平，而上調(diào)RUNX3 mRNA和蛋白的表達(dá)（

P

＜0.05）；與anti-miR-130a組相比，轉(zhuǎn)染RUNX3-siRNA可使A549細(xì)胞中RUNX3 mRNA和蛋白的表達(dá)水平明顯降低（

P

＜0.05）。見圖1和表2。

表2 各組細(xì)胞中微RNA（miR）-130a以及人類RUNT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子3（RUNX3）mRNA和蛋白相對表達(dá)量的比較/±s

圖1 蛋白質(zhì)印跡法檢測人類RUNT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子3（RUNX3）蛋白表達(dá)的影響

2.3 下調(diào)miR-130a通過靶向RUNX3抑制A549細(xì)胞增殖

與對照組相比，下調(diào)miR-130a可抑制A549細(xì)胞增殖和克隆形成能力（

P

＜0.05）；與anti-miR-130a相比，靶向干擾RUNX3的表達(dá)可逆轉(zhuǎn)miR-130a對A549細(xì)胞增殖的抑制作用（

P

＜0.05）。見表3。

表3 各組非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞存活率和克隆形成率的比較/±s

2.4 下調(diào)miR-130a通過靶向RUNX3抑制A549細(xì)胞侵襲和遷移

與對照組相比，下調(diào)miR-130a表達(dá)可抑制A549細(xì)胞的侵襲和遷移能力（

P

＜0.05）；與anti-miR-130a相比，下調(diào)靶基因RUNX3的表達(dá)可逆轉(zhuǎn)miR-130a的上述作用（

P

＜0.05）。見圖2、表4。

表4 miR-451過表達(dá)對非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞侵襲和遷移的影響/±s

圖2 Transwell小室檢測各組細(xì)胞的侵襲和遷移（0.5%結(jié)晶紫染色×200）

2.5 下調(diào)miR-130a通過靶向RUNX3抑制A549細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

與對照組相比，下調(diào)miR-130a的表達(dá)可抑制N-cadherin和Vimentin蛋白的表達(dá)，而促進(jìn)E-cadherin蛋白的表達(dá)（

P

＜0.05）；與anti-miR-130a相比，干擾RUNX3的表達(dá)可逆轉(zhuǎn)miR-130a對N-cadherin、E-cadherin和Vimentin蛋白的調(diào)控作用（

P

＜0.05）。見圖3、表5。

圖3 蛋白質(zhì)印跡法檢測非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞中上皮型鈣黏蛋白（E-cadherin）、神經(jīng)型鈣黏蛋白（N-cadherin）和波形蛋白（Vimentin）的表達(dá)

表5 各組非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞中上皮型鈣黏蛋白（E-cadherin）、神經(jīng)型鈣黏蛋白（N-cadherin）和波形蛋白（Vimentin）相對表達(dá)量的比較/±s

3 討論

既往研究表明，微小RNA（miRNAs）可通過靶向相關(guān)靶基因調(diào)控細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和凋亡等過程在肺癌發(fā)生及發(fā)展中扮演著癌基因和抑癌基因的角色。miR-130a是miR-130家族成員，被證實(shí)在白血病、鼻咽癌和結(jié)腸癌等腫瘤中異常表達(dá)，通過多種途徑影響腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和耐藥等，作為致癌或抑癌因子參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Chen X等在三陰性乳腺癌組織中發(fā)現(xiàn)miR-130a表達(dá)下調(diào)，miR-130a過表達(dá)可通過靶向調(diào)控與癌癥的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)FOSL1的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。Wang等指出，miR-130a在胃癌組織中表達(dá)下降，且與病人總生存期縮短有關(guān)；上調(diào)其表達(dá)可靶向調(diào)控TBL1XR1體外抑制癌細(xì)胞遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，體內(nèi)抑制成瘤和肺轉(zhuǎn)移。除了在乳腺癌和胃癌中發(fā)揮著抑癌基因的作用外，miR-130a還在部分腫瘤中異常高表達(dá)，發(fā)揮著致癌基因的作用。例如：Chen J等在骨肉瘤研究中證實(shí)miR-130a表達(dá)上調(diào)，與骨肉瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)；并證實(shí)miR-130a可通過靶向調(diào)控PTEN在骨肉瘤細(xì)胞遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮著重要的促進(jìn)作用。許旭東等研究發(fā)現(xiàn)，miR-130a在口腔腫瘤組織中高表達(dá)，其過表達(dá)可通過抑制PJA1促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移。

盡管張海濤等研究證實(shí)miR-130a在肺癌組織中高表達(dá)，與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期有關(guān)，可通過下調(diào)Smad4在肺癌細(xì)胞惡性增殖過程中發(fā)揮著促進(jìn)作用，但其對細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制并不完全清楚。RUNX3是RUNT家族成員，可通過調(diào)控生長信號途徑如TGF-β等影響細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移等過程，在結(jié)腸直腸癌、胃癌和喉癌等腫瘤的進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用。已有研究證實(shí)，RUNX3在非小細(xì)胞肺癌中低表達(dá)，而敲除其表達(dá)可顯著挽救了miR-661表達(dá)不足對肺癌細(xì)胞增殖和侵襲的抑制作用。

本研究通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測到miR-130a與RUNX3 3’UTR區(qū)域存在互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)，猜測miR-130a可能通過靶向調(diào)控RUNX3的表達(dá)參與肺癌的發(fā)生發(fā)展。為了驗(yàn)證上述猜測本研究采用熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)RUNX3是miR-130a的潛在靶基因。同時成功下調(diào)miR-130a表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，肺癌A549細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程均明顯受到抑制；同時轉(zhuǎn)染RUNX3-siRNA干擾RUNX3表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，RUNX3的表達(dá)下降逆轉(zhuǎn)了miR-130a低表達(dá)對A549細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的抑制作用。該結(jié)果首次證實(shí)了RUNX3是miR-130a的靶基因，miR-130a低表達(dá)可通過靶向調(diào)控RUNX3表達(dá)抑制A549細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。提示，miR-130a靶向調(diào)控RUNX3表達(dá)介導(dǎo)的細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移是肺癌惡性發(fā)展的重要機(jī)制，該結(jié)果為肺癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制和治療提供了新線索。

綜上所述，RUNX3是miR-130a的潛在靶基因，下調(diào)miR-130a可通過靶向調(diào)控RUNX3表達(dá)抑制肺癌A549細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。