趙松耀，尹劉杰，李世澤

急性腦梗死（acute cerebral infarction，ACI）是一種由于腦部血管急性阻塞，從而引起腦組織供血供氧不足，進(jìn)而造成局部腦組織壞死和功能喪失，導(dǎo)致一系列臨床癥狀，常見病因?yàn)閯?dòng)脈粥樣硬化。當(dāng)前，臨床采用急診靜脈溶栓治療等措施以疏通阻塞血管，使血管灌流區(qū)腦組織恢復(fù)血氧供應(yīng)。研究顯示，重組人組織型纖溶酶原激活劑（recombinant human tissue type plasminogen activator，rt-PA）是臨床唯一被證明可有效實(shí)現(xiàn)缺血腦組織再灌注的藥物，可有效治療腦梗死，大大降低ACI病人的致死率和致殘率。研究發(fā)現(xiàn)，影響ACI病人治療后預(yù)后因素多樣化，對(duì)ACI病人采用rt-PA溶栓治療，24 h后出現(xiàn)不同結(jié)局，多數(shù)病人獲得改善，部分病人出現(xiàn)早期神經(jīng)功能惡化，加劇神經(jīng)功能缺損。因此尋找合適的生物分子標(biāo)志對(duì)病人rt-PA溶栓后預(yù)后分析具有重要意義。鋅指樣轉(zhuǎn)錄因子家族（Kruppel-like transcription factors，KLFs）是一種與真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄關(guān)系密切的鋅指蛋白，可調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，是調(diào)控心血管系統(tǒng)的重要轉(zhuǎn)錄因子。目前關(guān)于外周血單個(gè)核細(xì)胞KLF2、KLF4表達(dá)與ACI病人rt-PA靜脈溶栓預(yù)后關(guān)系的研究尚未見報(bào)道，本研究旨在通過檢測行rt-PA靜脈溶栓的ACI病人外周血單個(gè)核細(xì)胞KLF2、KLF4表達(dá)水平，分析其與病人預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年4月至2018年4月鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院就診并接受rt-PA靜脈溶栓治療的ACI病人117例為研究對(duì)象，其中男60例，女57例，年齡范圍38～72歲，年齡（61.54±11.78）歲。其中因失訪脫落4例，最終納入113例，根據(jù)溶栓治療結(jié)局將病人分為預(yù)后良好組和預(yù)后不良組，其中預(yù)后良好組64例，男34例，女30例，年齡范圍40～72歲，年齡（62.74±12.03）歲；預(yù)后不良組49例，男26例，女23例，年齡范圍38～71歲，年齡（61.26±11.51）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①病人經(jīng)診斷為ACI，符合全國第四屆腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議制定的缺血性腦血管病診斷標(biāo)準(zhǔn)，且經(jīng)CT或MRI等影像學(xué)檢查確診；②病人發(fā)病時(shí)間＜4.5 h；③美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表（NIHSS）評(píng)分≥5分；④經(jīng)影像學(xué)及超聲、心電圖等輔助檢查確診為動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死；排除標(biāo)準(zhǔn)：①月經(jīng)期、妊娠期病人；②治療前顯著高血壓病人（收縮壓＞180 mmHg，舒張壓＞110 mmHg）；③腦內(nèi)動(dòng)靜脈畸形，顱內(nèi)動(dòng)脈瘤或出血性疾病病人；④顱內(nèi)出血史或2個(gè)月內(nèi)接受較大手術(shù)病人。兩組病人年齡性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）。病人或近親屬知情同意，研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。治療結(jié)局評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：以rt-PA靜脈溶栓治療后90 d病人改良RANKIN量表（Modified Rankin Scale，MRS）評(píng)分，其中64例MRS評(píng)分為0～2分，表示預(yù)后良好；49例MRS評(píng)分為3～6分，表示為預(yù)后不良，其中腦出血18例，病情進(jìn)展再阻塞25例，其它6例。

1.2 治療方法

病人入院后開通綠色救護(hù)通道，行頭顱CT或MRI檢查，監(jiān)測病人血壓，開放肘靜脈通道，留置套管針。靜脈溶栓藥物rt-PA（德國Boehringer Ingelheim公司，50 mg），用時(shí)稀釋為1 mg/mL，靜脈輸注：1 mg/kg，先以總劑量的10%進(jìn)行靜脈推注，1 min內(nèi)注射完畢，再于1 h內(nèi)注入總劑量的50%，剩余的在第2、3 h注射完畢。溶栓治療開始后24 h內(nèi)，停止抗凝和抗血小板治療。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 樣本采集

病人入院后及溶栓治療24 h后分別取病人靜脈血7 mL，其中2 mL置于EDTA-K2抗凝管，另5 mL利用淋巴細(xì)胞分離液分離出單個(gè)核細(xì)胞，-70℃保存。

1.3.2 一般資料收集

統(tǒng)計(jì)病人既往高血壓、高血脂、卒中史、糖尿病病史、給藥時(shí)間；檢測病人入院血壓、血糖水平。對(duì)病人進(jìn)行入院時(shí)和溶栓后24 h NIHSS評(píng)分。

1.3.3 病人外周血單個(gè)核細(xì)胞KLF2、KLF4 mRNA水平檢測

TRIzol RNA提取液提取單個(gè)核細(xì)胞中總RNA，檢測合格后，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA，利用實(shí)時(shí)定量PCR（quantitative reverse transcription-PCR，qRT-PCR）試劑盒檢測外周血單個(gè)核細(xì)胞KLF2、KLF4 mRNA水平。以GAPDH為內(nèi)參基因，反應(yīng)體系為20μL：SYBR Premix Ex Taq（2×），正向引物0.5μL，反向引物0.5μL，模板2.0 μL。反應(yīng)條件如下：94℃5 min，94℃30 s，60℃30 s，72℃1 min，72℃5 min，30個(gè)循環(huán)。本研究使用引物交由上海生物工程有限公司合成，引物序列見表1。采用2法計(jì)算目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.4 病人外周血IL-2、IL-6水平檢測

取抗凝后的外周血，采用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法檢測IL-2、IL-6水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明操作。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較

預(yù)后良好組病人給藥時(shí)間、血糖水平、入院NIHSS評(píng)分、24hNIHSS評(píng)分、90 d MRS評(píng)分、糖尿病病人比例均較預(yù)后不良組顯著降低（

P

＜0.05）。見表2。

表2 兩組急性腦梗死病人一般資料比較

2.2 病人外周血單個(gè)核細(xì)胞KLF2、KLF4 mRNA表達(dá)水平和外周血IL-2、IL-6表達(dá)水平

與入院時(shí)比較，預(yù)后良好組溶栓后24 h KLF2、KLF4 mRNA高表達(dá)，IL-2、IL-6低表達(dá)（

P

＜0.05），預(yù)后不良組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）；與預(yù)后良好組比較，預(yù)后不良組病人入院時(shí)及溶栓后24 h KLF2、KLF4 mRNA低表達(dá)，IL-2、IL-6高表達(dá)（

P

＜0.05）。見表3。

表3 急性腦梗死病人外周血單個(gè)核細(xì)胞KLF2、KLF4 mRNA及IL-2、IL-6表達(dá)水平/±s

2.3 入院時(shí)外周血單個(gè)核細(xì)胞KLF2、KLF4 mRNA水平與90 d MRS評(píng)分相關(guān)性

病人入院時(shí)外周血單個(gè)核細(xì)胞KLF2、KLF4 mRNA水平與90 d MRS評(píng) 分 負(fù) 相 關(guān)（

r

=-0.347、-0.349，均

P

＜0.05），見圖1。

圖1 急性腦梗死外周血單個(gè)核細(xì)胞與90 d MRS評(píng)分相關(guān)性：A為KLF2表達(dá)水平；B為KLF4 mRNA表達(dá)水平

2.4 外周血KLF2、KLF4 mRNA水平對(duì)rt-PA溶栓后ACI病人不良預(yù)后的預(yù)測

入院時(shí)ACI病人外周血單個(gè)核細(xì)胞KLF2 mRNA水平（截?cái)嘀担?.36）預(yù)測病人不良結(jié)局的靈敏度為76.60%，特異度為93.90%，AUC為0.901（95%

CI

：0.846～0.957，

P

＜0.05）；外周血單個(gè)核細(xì)胞KLF4 mRNA水平（截?cái)嘀担?.44）預(yù)測病人不良結(jié)局的靈敏度為87.50%，特異度為91.80%，AUC為0.915（95%

CI

：0.856～0.973，

P＜

0.05）；二者聯(lián)合預(yù)測病人不良結(jié)局的靈敏度為85.90%，特異度為98.00%，AUC為0.970（95%

CI

：0.944～0.996，

P＜

0.05），與KLF2、KLF4單項(xiàng)預(yù)測相比顯著升高（

Z

=0.245，

P＜

0.05），見圖2。

圖2 急性腦梗死外周血單個(gè)核細(xì)胞KLF2、KLF4 mRNA水平對(duì)rt-PA溶栓預(yù)后的預(yù)測

2.5 影響rt-PA溶栓后ACI病人不良預(yù)后的危險(xiǎn)因素分析

按照IL-2、IL-6表達(dá)水平的平均數(shù)將ACI病人分組，其中高于平均數(shù)的稱為高表達(dá)組，其余稱為低表達(dá)組。以溶栓治療后ACI病人是否出現(xiàn)不良預(yù)后為因變量，將年齡、病人入院時(shí)外周血單個(gè)核細(xì)胞KLF2 mRNA、KLF4 mRNA、是否存在糖尿病高血壓等因素納入logistic回歸分析，結(jié)果表明，入院時(shí)外周血KLF2 mRNA≤0.36、KLF4 mRNA≤0.44、IL-2高表達(dá)、IL-6高表達(dá)、NIHSS評(píng)分＞5分、糖尿病是溶栓治療后ACI病人出現(xiàn)不良預(yù)后的危險(xiǎn)因素（

P

＜0.05）。見表4。

表4 影響rt-PA溶栓后腦梗死不良預(yù)后的危險(xiǎn)因素分析

3 討論

ACI病人發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，其主要病因?yàn)閯?dòng)脈粥樣硬化。動(dòng)脈粥樣硬化斑塊所致管腔狹窄或斑塊破裂脫落導(dǎo)致動(dòng)脈閉塞可引發(fā)腦梗死。研究顯示，不同病因引發(fā)的ACI病人行rt-PA靜脈溶栓治療后，其預(yù)后具有一定差異性，而不同年齡病人在治療后，結(jié)局也不相同。目前臨床缺乏可靠有效的分子生物標(biāo)志用于ACI病人rt-PA靜脈溶栓后預(yù)后判斷。已有研究表明，病人糖尿病史、血糖、24 h NIHSS評(píng)分可能與溶栓病人預(yù)后有關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，預(yù)后良好組病人給藥時(shí)間、血糖水平、入院NIHSS評(píng)分、24 h NIHSS評(píng)分、90 d MRS評(píng)分、糖尿病病人比例均較預(yù)后不良組顯著降低，提示該類因素可能與病人溶栓治療后預(yù)后有關(guān)，與占達(dá)良等研究結(jié)果一致。

轉(zhuǎn)錄因子是一類具有重要功能的DNA結(jié)合蛋白，可通過調(diào)控目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)控基因表達(dá)，進(jìn)而參與細(xì)胞生長、分化等生理過程。KLF家族結(jié)構(gòu)高度保守，具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能，普遍存在于多個(gè)物種中。已有研究表明，KLF2、KLF4是血管內(nèi)皮細(xì)胞穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因素，參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，與血管炎癥及血栓形成關(guān)系密切。KLF2可誘導(dǎo)內(nèi)皮源性一氧化氮合酶等抗凝基因高表達(dá)，與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展有關(guān)。在大面積腦梗死病人外周血中，KLF2 mRNA表達(dá)水平較小面積腦梗死病人顯著降低，提示其與病人腦梗死面積有關(guān)。呂永楠等研究表明，KLF4可調(diào)控血管內(nèi)皮功能，與平滑肌增生有關(guān)，參與動(dòng)脈粥樣硬化。研究顯示，KLF2、KLF4可能抑制凝血因子血管性血友病因子（vWF）分泌，干預(yù)人體血栓形成。KLF2、KLF4可通過影響血管凝血、內(nèi)皮炎癥及纖溶靶基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，抑制血栓形成，推測其水平變化可能與血栓性疾病發(fā)生有關(guān)。ACI發(fā)生發(fā)展并發(fā)炎癥反應(yīng)，炎性因子IL-2、IL-6等異常高表達(dá)，有研究發(fā)現(xiàn)，KLF2、KLF4能抑制炎性因子表達(dá)，使內(nèi)皮細(xì)胞保持一定的穩(wěn)定狀態(tài)，緩解ACI癥狀。本研究結(jié)果表明，與預(yù)后良好組相比，預(yù)后不良組病人rt-PA溶栓后24 h外周血單個(gè)核細(xì)胞KLF2、KLF4 mRNA水平顯著降低，外周血IL-2、IL-6表達(dá)水平顯著升高，提示ACI病人rt-PA溶栓后外周血單個(gè)核細(xì)胞KLF2、KLF4 mRNA水平和外周血IL-2、IL-6表達(dá)水平可能與治療結(jié)局有關(guān)，檢測其水平變化可用于預(yù)測病人預(yù)后。MRS作為衡量卒中后病人神經(jīng)功能恢復(fù)狀況的量表，可直接反映溶栓治療效果，本研究分析顯示，病人入院時(shí)外周血單個(gè)核細(xì)胞KLF2、KLF4 mRNA水平與90 d MRS評(píng)分負(fù)相關(guān)。提示KLF2、KLF4 mRNA在一定程度可用于評(píng)估病人溶栓效果。

耿利嬌等研究發(fā)現(xiàn)，血漿脂蛋白聯(lián)合血清抵抗素預(yù)測ACI病人不良結(jié)局敏感度為81.35%，特異度為78.26%。梁安心等發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞分別寬度（RDW）預(yù)測ACI病人不良結(jié)局敏感度為51.7%，特異度為77.2%。本研究ROC分析結(jié)果表明，入院時(shí)外周血單個(gè)核細(xì)胞KLF2、KLF4 mRNA水平均對(duì)溶栓治療90d后病人結(jié)局預(yù)測具有一定價(jià)值，二者聯(lián)合檢測預(yù)測病人不良結(jié)局的靈敏度為85.90%，特異度為98.00%，進(jìn)一步表明入院時(shí)外周血單個(gè)核細(xì)胞KLF2、KLF4 mRNA水平可能作為生物分子標(biāo)記用于溶栓治療病人預(yù)后。logistic回歸分析，結(jié)果表明，KLF2 mRNA≤0.36、KLF4 mRNA≤0.44、IL-2高表達(dá)、IL-6高表達(dá)、NIHSS評(píng)分＞5分、糖尿病是溶栓治療后ACI病人出現(xiàn)不良預(yù)后的危險(xiǎn)因素，提示KLF2 mRNA＞0.36、KLF4 mRNA＞0.44、IL-2低表達(dá)、IL-6低表達(dá)、NIHSS評(píng)分＜5分、無糖尿病病人預(yù)后良好，醫(yī)務(wù)工作者應(yīng)及早動(dòng)員該類病人進(jìn)行rt-PA靜脈溶栓治療，以提升該類病人良好預(yù)后概率。

綜上所述，與預(yù)后良好組比較，預(yù)后不良組病人入院時(shí)及溶栓后24 h外周血單個(gè)核細(xì)胞KLF2、KLF4 mRNA低表達(dá)，入院時(shí)外周血單個(gè)核細(xì)胞KLF2、KLF4 mRNA水平對(duì)溶栓治療90 d后病人結(jié)局具有一定預(yù)測價(jià)值。本研究不足之處：ACI包含不同病因發(fā)病機(jī)制，可能對(duì)溶栓治療結(jié)局產(chǎn)生影響，從而對(duì)結(jié)果造成一定偏倚，將在后續(xù)研究中加大樣本量，針對(duì)病人病因分類研究。