馬賽，安峰，李立恒，林媛媛，汪佳

黏液表皮樣癌（mucoepidermoid carcinoma，MEC）是口腔頜面部常見的一類涎腺上皮源性惡性腫瘤。最新研究顯示，在我國北方地區(qū)涎腺MEC在口腔頜面部惡性腫瘤當(dāng)中的占比高居第二位。目前普遍認(rèn)為腫瘤細(xì)胞的增殖活性能夠準(zhǔn)確的反映惡性腫瘤的惡性程度，與腫瘤的治療、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移有著密切的相關(guān)性。癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞黏附分子6（CEACAM 6）是癌胚抗原（CEA）家族當(dāng)中的成員之一，它主要存在于哺乳動物細(xì)胞表面和細(xì)胞膜上，起到調(diào)節(jié)細(xì)胞間黏附的作用。有研究證實，CEACAM 6高表達(dá)可以引起腫瘤組織增生和腫瘤細(xì)胞增殖活性的增強(qiáng)。增殖細(xì)胞核抗原（Ki-67）作為一種非?？煽康呐袛嗄[瘤細(xì)胞增殖活性的標(biāo)志物，目前普遍應(yīng)用于臨床。故本研究采用免疫組織化學(xué)法檢測CEACAM 6與Ki-67在不同臨床病理特征的涎腺MEC組織中的表達(dá)情況，以期進(jìn)一步提高臨床對涎腺MEC增殖活性的認(rèn)識。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2005年6月至2014年10月河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院病理科留存的涎腺MEC病人石蠟標(biāo)本50例，其中男22例，女28例。以上病例均為涎腺原發(fā)腫瘤，均有完整的臨床病理資料，治療方式均為手術(shù)擴(kuò)大切除原發(fā)灶，有頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者行頸淋巴結(jié)清掃術(shù)；所有病例術(shù)前均未接受放療、化療及免疫治療等其他治療。另取與手術(shù)同期切取的正常涎腺組織30例及30例涎腺多形性腺瘤（SPA）作為實驗對照組。以上所有病理標(biāo)本均由兩名資深病理科醫(yī)師分別按照WHO 2005年涎腺腫瘤組織分類法確認(rèn)診斷的準(zhǔn)確性。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 標(biāo)本處理及檢測方法

所有石蠟標(biāo)本均嚴(yán)格按照免疫組織化學(xué)SP法處理。3%甲醇-雙氧水在常溫下孵育10 min，以滅活內(nèi)源性的過氧化物酶，PBS沖洗標(biāo)本，滴加10%山羊血清封閉標(biāo)本內(nèi)游離的結(jié)合位點，滴加特異性一抗、二抗，37℃孵育30 min，PBS沖洗，滴加辣根酶HRP標(biāo)記鏈酶卵白素工作液，PBS沖洗，DAB顯色，復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。兔抗人CEACAM 6單克隆濃縮抗體購于英國Abcam公司，Ki-67抗體購自Santa Crue公司，DAB顯色試劑盒購于博士德公司。

1.3 結(jié)果判定

細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)顆粒狀棕黃色染色的標(biāo)本被認(rèn)定為CEACAM 6表達(dá)陽性細(xì)胞。細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色染色顆粒的標(biāo)本被認(rèn)定為Ki-67表達(dá)陽性細(xì)胞。繼而以細(xì)胞染色程度及染色細(xì)胞百分率來對標(biāo)本做進(jìn)一步評定。染色程度：基本無著色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分；染色細(xì)胞百分率：無為0分，＜25%為1分，25%～50%為2分，＞50%為3分。染色程度得分與染色細(xì)胞百分率得分各自相乘：0～1分為陰性（-），2～3分為弱陽性（+），4～6分為陽性（++），6分以上為強(qiáng)陽性（+++），將陰性和弱陽性表達(dá)定義為陰性組，陽性和強(qiáng)陽性表達(dá)定義為陽性組。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

運用SPSS 17．0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析，用百分率表示計數(shù)資料，采用

χ

檢驗分析CEACAM 6和Ki-67的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系，兩組間比較設(shè)

P

＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，三組之間兩兩比較采用

P

值修正的方法，即

P

＜0.016 7為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。兩者表達(dá)的相關(guān)性采用Spearmen檢驗，設(shè)

P

＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CEACAM 6、Ki-67在MEC、SPA、正常涎腺組織中的表達(dá)比較

在涎腺MEC、SPA及正常涎腺組織中，CEACAM 6均呈棕黃色顆粒狀表達(dá)于細(xì)胞的胞質(zhì)中，而Ki-67則呈棕黃色顆粒表達(dá)于細(xì)胞核中。涎腺MEC組的CEACAM 6、Ki-67陽性率均明顯高于其余兩組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（

P

＜0.0167）。見表1。

表1 CEACAM 6、Ki-67在三組中的表達(dá)比較/例（%）

2.2 CEACAM 6、Ki-67在不同臨床病理特征的涎腺MEC中的表達(dá)

在涎腺MEC組織中病理分級Ⅲ級者CEACAM 6、Ki-67表達(dá)陽性率均明顯高于病理分級Ⅰ+Ⅱ級者（

P

＜0.05），TNM分期Ⅲ+Ⅳ期者CEACAM 6、Ki-67表達(dá)陽性率均明顯高于TNM分期I+II者（

P

＜0.05），有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者CEACAM 6、Ki-67表達(dá)陽性率均明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（

P

＜0.05），而在不同性別、年齡、部位組中CEACAM 6、Ki-67表達(dá)陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（

P

＞0.05），見表2。

表2 不同病理特征的涎腺MEC中CEACAM 6、Ki-67的表達(dá)/例（%）

2.3 涎腺MEC組織中CEACAM 6和Ki-67表達(dá)的相關(guān)性分析

涎腺MEC組織中CEACAM 6和Ki-67二者共同陽性表達(dá)例數(shù)為24例，共同陰性表達(dá)例數(shù)為15例，Spearmen相關(guān)性分析顯示CEACAM 6和Ki-67的表達(dá)呈正相關(guān)（

r

=0.551，

P

＜0.001）。

3 討論

現(xiàn)代腫瘤學(xué)研究認(rèn)為，增殖與分化是細(xì)胞生命進(jìn)程中相輔相成的必然過程，細(xì)胞一旦出現(xiàn)增殖失控則必然會伴有分化異常；反之，細(xì)胞異常分化的程度也與細(xì)胞增殖失控呈正相關(guān)。目前，通過檢測腫瘤細(xì)胞增殖活性來評價腫瘤的惡性程度、判斷預(yù)后已獲得腫瘤學(xué)研究的共識。CEACAM 6基因（又稱為CD66c）定位于19號染色體q13.2，其編碼的蛋白包含266個氨基酸殘基，分子量為90-95 kD。CEACAM 6蛋白主要通過脂筏結(jié)構(gòu)發(fā)揮細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、識別和鏈接功能。Cameron等在研究CEACAM 6在頭頸部鱗癌中的表達(dá)情況時發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中過表達(dá)的CEACAM 6可以促進(jìn)腫瘤生長增殖并抑制細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，CEACAM6通過與表皮生長因子（EGF）受體（EGFR）相互作用并增強(qiáng)EGFR的活性的方式來促進(jìn)口腔鱗狀細(xì)胞癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。國內(nèi)研究顯示，高表達(dá)的CEACAM 6通過抑制腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞的浸潤對腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移產(chǎn)生明顯的促進(jìn)作用。以上研究均證實CEACAM 6在病理條件下通過調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附、阻斷細(xì)胞分化、抑制失巢凋亡，使細(xì)胞極性消失、增殖失控，并形成有利于腫瘤組織侵襲、轉(zhuǎn)移的微循環(huán)，從而影響腫瘤組織的生物學(xué)行為。另有多項研究顯示，CEACAM 6在同一系統(tǒng)的正常組織、良性腫瘤組織與惡性腫瘤組織中的表達(dá)逐級升高，這一現(xiàn)象很可能與CEACAM 6參與細(xì)胞從G0/G1期向S期轉(zhuǎn)化過程的調(diào)控有關(guān)，從而也證實了CEACAM 6可以促進(jìn)正常細(xì)胞向腫瘤細(xì)胞發(fā)展這一理論。以上這些研究均證實CEACAM 6有作為理想的腫瘤標(biāo)志物的潛質(zhì)，目前國內(nèi)外均已有相關(guān)臨床試驗把CEACAM 6作為惡性腫瘤早期診斷的備選指標(biāo)之一。本研究檢測了CEACAM 6在涎腺MEC組織中的表達(dá)情況，結(jié)果證實CEACAM 6與涎腺MEC組織的病理分級、TNM分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，說明在涎腺MEC組織中CEACAM 6同樣發(fā)揮著促癌基因的作用。另外，CEACAM 6在涎腺MEC與多形性腺瘤中的表達(dá)有顯著差異，說明檢測CEACAM 6的表達(dá)水平有助于臨床良惡性腫瘤的鑒別診斷。

Ki-67是一種能夠準(zhǔn)確反映細(xì)胞增殖活性的核蛋白，它主要表達(dá)于有增殖活性的細(xì)胞中，而在無增殖活性的細(xì)胞內(nèi)則缺乏此蛋白。在多種惡性腫瘤組織中Ki-67的表達(dá)水平均能較準(zhǔn)確地反映細(xì)胞的增殖程度，因此，人們普遍認(rèn)為Ki-67的表達(dá)水平對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有顯著影響。這一結(jié)論在涎腺MEC組織中一樣適用。通過檢測Ki-67的表達(dá)水平來評估腫瘤的惡性程度、判斷預(yù)后這一理論是現(xiàn)代腫瘤學(xué)研究的廣泛共識。為了進(jìn)一步驗證CEACAM 6對涎腺MEC組織增殖的影響，本研究選取了Ki-67作為聯(lián)合研究對象。研究結(jié)果顯示，Ki-67的表達(dá)情況與以往研究相一致；CEACAM 6的表達(dá)與Ki-67的表達(dá)呈正相關(guān)，說明在涎腺MEC組織中CEACAM 6的過表達(dá)造成腫瘤組織增殖失控，從而影響了腫瘤組織的生物學(xué)行為。進(jìn)一步分析其機(jī)制可能為CEACAM 6的過表達(dá)激活了磷脂肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（PI3K/AKT/mTOR）通路。作為一種細(xì)胞膜表面受體，當(dāng)CEACAM 6蛋白與細(xì)胞外界信號結(jié)合后可激活細(xì)胞膜上的PI3K，繼而活化的PI3K激活其下游的AKT，AKT活化后隨即激活了mTOR，活化的mTOR使其下游底物真核細(xì)胞翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白1（4EBP1）磷酸化，磷酸化后的4EBP1失去了與真核細(xì)胞翻譯啟動因子（eIF4E）結(jié)合的能力，從而使eIF4E解離出來與其他翻譯起始因子結(jié)合，啟動了蛋白質(zhì)的翻譯，Ki-67蛋白正是受eIF4E調(diào)控的蛋白之一。

綜上所述，在涎腺腫瘤組織中CEACAM 6與Ki-67異常高表達(dá)提示腫瘤惡性的可能性較大，而在涎腺MEC組織中CEACAM 6與Ki-67高表達(dá)則預(yù)示著腫瘤惡性程度高、侵襲性強(qiáng)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高。臨床通過檢測CEACAM 6與Ki-67有助于涎腺腫瘤的良惡性預(yù)判及涎腺MEC惡性程度的評估。進(jìn)一步驗證CEACAM 6與Ki-67在涎腺MEC組織中發(fā)揮作用的具體機(jī)制，有望為涎腺MEC的精確診斷及靶向治療提供科學(xué)依據(jù)。