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        高效液相色譜法測定鹽酸伐地那非原料藥中的有關(guān)物質(zhì)

        2021-07-07 02:56:32黃美容曹陽黃順旺曹明成
        安徽醫(yī)藥 2021年7期

        黃美容,曹陽,黃順旺,曹明成

        鹽酸伐地那非,英文名為Vardenafil hydrochloride,CAS:224785-91-5,化學(xué)名為2-[2-乙氧基-5-(4-乙基-哌嗪-1-磺?;┍交?5-甲基-7-丙基-3H-咪唑[5,1-f]-[1,2,4]三聯(lián)氮-4-酮單鹽酸鹽,于2003年8月在美國獲得批準(zhǔn)上市,它是由德國拜耳和葛蘭素史克公司共同開發(fā)研制,伐地那非對PDE5的抑制作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對其他PDE的作用(高于PDE6的1.5倍,PDE1的130倍,PDE11的300倍)。適應(yīng)癥:治療男性陰莖勃起功能障礙(ED),其作用機(jī)制是通過抑制人體陰莖海綿體內(nèi)降解cGMP的磷酸二酯酶5型(PDE5),增加性刺激作用下海綿體局部內(nèi)源性的一氧化氮的釋放,使得平滑肌松弛,增加人體陰莖海綿體血流,最終作用于陰莖海綿體,使海綿體平滑肌舒張,促進(jìn)勃起。最新文獻(xiàn)報道,伐地那非還具有治療慢性前列腺炎、肺動脈高壓等作用。

        鹽酸伐地那非的合成是以鄰乙氧基苯甲脒鹽酸鹽、N-乙基哌嗪等為起始物料,經(jīng)過取代、縮合、環(huán)合、磺?;?、取代和成鹽等一系列化學(xué)反應(yīng)制成鹽酸伐地那非。本實驗結(jié)合合成工藝路線及降解途徑分析,對以下雜質(zhì)進(jìn)行定量研究。

        目前,國內(nèi)相關(guān)文獻(xiàn)報道,均是采用乙腈-醋酸銨溶液體系,測定鹽酸伐地那非原料藥及制劑中的有關(guān)物質(zhì)且最多控制了5個已知雜質(zhì)(雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)F、雜質(zhì)G,各雜質(zhì)結(jié)構(gòu)見圖1)。本實驗采用乙腈-磷酸三乙胺緩沖液體系,新增了2個雜質(zhì)(雜質(zhì)D、雜質(zhì)E,雜質(zhì)結(jié)構(gòu)見圖1),進(jìn)行梯度洗脫,結(jié)果7個雜質(zhì)峰之間、雜質(zhì)與主成分(鹽酸伐地那非結(jié)構(gòu)見圖1)峰之間的分離度均符合要求(≥1.5),其靈敏度好、準(zhǔn)確度高,可作為原料藥有關(guān)物質(zhì)檢查的測定方法。該研究尚未見文獻(xiàn)報道。

        圖1 鹽酸伐地那非及各雜質(zhì)結(jié)構(gòu)示意圖

        1 儀器與試藥

        儀器:AG135電子天平、XP-6電子天平(METTLER TOLEDO);LC-20AT高效液相色譜儀(日本島津),SPD-20A檢測器,SIL-20AC進(jìn)樣器,島津LabSolutions DB Essentia工作站。試藥:鹽酸伐地那非對照品(批次20190301-J,99.7%)、雜質(zhì)A(批次20190101,98.6%)、雜質(zhì)B(批次20190112,98.4%)、雜質(zhì)C(批次20190124,98.2%)、雜質(zhì)D(批 次20181214,98.4%)、雜質(zhì)E(批次20181226,97.6%)、雜 質(zhì)F(批 次20181206,99.2%)、雜 質(zhì)G(批 次20181025,96.8%);鹽酸伐地那非原料(批次20190501、20190502、20190503),以上對照品及供試品均來源于合肥創(chuàng)新醫(yī)藥技術(shù)有限公司。除乙腈、三乙胺為色譜純、水為超純水外,其他均為分析純。

        2 實驗方法

        2.1 溶液的制備

        混合雜質(zhì)對照品溶液:精密稱取雜質(zhì)A、B、C、D、E、F、G各約5 mg,置同一50 mL容量瓶中,加乙腈適量振搖使溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為混合雜質(zhì)對照品貯備液;精密量取0.3 mL置100 mL量瓶中,加流動相A稀釋至刻度,搖勻,即得。

        供試品溶液:取鹽酸伐地那非原料適量,精密稱取20 mg,置100 mL量瓶中,加流動相A適量振搖使溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得。1%對照溶液:精密量取上述供試品溶液1 mL,置100 mL量瓶中,加流動相A稀釋至刻度,搖勻,即得。

        系統(tǒng)適用性溶液:精密稱取鹽酸伐地那非對照品約20 mg,置100 mL量瓶中,再精密量取雜質(zhì)對照品貯備溶液0.3mL,置同一100 mL量瓶中,加流動相A適量振搖使溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得。

        2.2 色譜條件及系統(tǒng)適用性

        流動相A:0.5%三乙胺溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH至3.0)-乙腈(90∶10),流動相B:0.5%三乙胺溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH至3.0)-乙腈(10:90),Agilent C柱(4.6 mm×250 mm,5μm);柱溫40℃;檢測波長242 nm;流速1.0 mL/min;進(jìn)樣量20μL;采用梯度洗脫,洗脫條件見表1。

        表1 流動相梯度洗脫條件

        精密稱取雜質(zhì)A、B、C、D、E、F、G適量,分別制備各雜質(zhì)的對照品溶液,精密量取20μL,注入液相色譜儀,進(jìn)行定位,再進(jìn)注系統(tǒng)適用性溶液進(jìn)行液相色譜分析。見圖2,3。

        圖2 各雜質(zhì)定位色譜圖

        系統(tǒng)適用性溶液中各已知雜質(zhì)峰之間及與主成分峰與相鄰雜質(zhì)峰之間的分離度均符合要求(≥1.5)。

        圖3 系統(tǒng)適用性實驗色譜圖

        3 實驗結(jié)果

        3.1 專屬性

        精密稱取鹽酸伐地那非原料約20 mg,6份,分別置100 mL量瓶中,其中1份作為破壞對照,另外5份分別進(jìn)行60℃高溫破壞10 d、光照(4 500±500)lx破壞10 d、3%過氧化氫溶液(1 mL)破壞4 h、1 mol/L鹽酸溶液(1 mL)60℃水浴破壞8 h、1 mol/L氫氧化鈉溶液(1 mL)60℃水浴破壞8 h,酸、堿破壞結(jié)束時分別加等量的堿、酸進(jìn)行中和,再用流動相A適量振搖使溶解并稀釋至刻度,搖勻。按“2.2”項下色譜條件進(jìn)樣分析。結(jié)果表明,本品在高溫、光照、酸、堿破壞條件下較穩(wěn)定,僅產(chǎn)生少量的降解雜質(zhì);氧化破壞條件下不穩(wěn)定,能產(chǎn)生明顯的降解雜質(zhì)。高溫、光照、酸、堿、氧化破壞色譜圖顯示,本品主成分峰與相鄰雜質(zhì)峰之間分離度良好(≥1.5),主成分峰純度因子符合要求,破壞前后物料基本守恒。

        3.2 定量限、檢測限、線性范圍與校正因子

        精密量取“2.1”項下的混合雜質(zhì)對照品貯備液,加流動相A稀釋制成0.04~1.00μg/mL濃度范圍的一系列混合對照品溶液,精密量取20μL,注入色譜儀,記錄色譜圖。以各成分的濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)(

        X

        ),峰面積為縱坐標(biāo)(

        Y

        ),進(jìn)行線性回歸,并以回歸方程的斜率計算各已知雜質(zhì)相對于鹽酸伐地那非的校正因子(RCF),同時測定各成分的定量限與檢測限,結(jié)果見表2。

        表2 鹽酸伐地那非有關(guān)物質(zhì)線性和校正因子

        3.3 重復(fù)性

        取鹽酸伐地那非原料約20 mg,精密稱定,6份,按“2.1”項下供試品溶液制備方法制備,在“2.2”色譜條件下進(jìn)行測定,以外標(biāo)法計算已知雜質(zhì)的含量,主成分自身對照法計算未知雜質(zhì)的含量,結(jié)果單雜含量(≥0.05%)的RSD均<10%(

        n

        =6),總雜含量的RSD均<5%(

        n

        =6)。

        3.4 中間精密度

        由另一人,取鹽酸伐地那非原料約20 mg,精密稱定,6份,按“2.1”項下供試品溶液制備方法制備,換另一臺液相色譜儀,在“2.2”色譜條件下進(jìn)行測定,以外標(biāo)法計算已知雜質(zhì)的含量,主成分自身對照法計算未知雜質(zhì)的含量,結(jié)果單雜含量(≥0.05%)的RSD均<15%(

        n

        =12),總雜含量的RSD均<10%(

        n

        =12)。

        3.5 準(zhǔn)確度

        精密稱取鹽酸伐地那非原料約20 mg,9份,每3份分別精密加入2.1項下的混合雜質(zhì)對照品貯備液0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL,按“2.1”項下供試品溶液制備方法制成低、中、高濃度的加樣供試品溶液,精密量取20μL,注入液相色譜儀,記錄色譜圖,計算各已知雜質(zhì)的回收率,雜質(zhì)A、B、C、D、E、F、G的 平 均 回 收 率 分 別 為99.8%、101.6%、102.4%、99.5%、100.5%、101.7%、103.6%,在99.5%~103.6%范圍內(nèi),RSD分別為1.8%、0.6%、1.2%、1.4%、0.9%、1.5%、0.9%,均<2%。

        3.6 溶液穩(wěn)定性

        按“2.1”項下制備混合雜質(zhì)對照品溶液與供試品溶液,25℃放置,分別于0、2、4、8、12、24、48h精密量取20μL,注入液相色譜儀,記錄色譜圖,實驗結(jié)果表明:混合雜質(zhì)對照品溶液各測定時間點的單個雜質(zhì)峰面積與0 h比較,其相對平均偏差均小于2%;供試品溶液各測定時間點的單個雜質(zhì)峰面積與0 h比較,大于0.05%的單個雜質(zhì)峰面積的相對平均偏差均小于5%,且無新的降解雜質(zhì)產(chǎn)生。

        3.7 耐用性

        分別調(diào)整柱溫(40±2)℃、檢測波長(242±2)nm、流速(1.0±0.05)mL/min及pH(3.0±0.2),同時更換不同品牌的色譜柱,考察色譜條件參數(shù)的變化對系統(tǒng)適用性溶液中雜質(zhì)與主成分之間分離度的影響。實驗結(jié)果表明,柱溫、波長、流速及pH、不同品牌的色譜柱等參數(shù)的變化對系統(tǒng)適用性測定結(jié)果無影響,即鹽酸伐地那非和雜質(zhì)A、B、C、D、E、F、G 7個已知雜質(zhì)的分離度均符合要求(≥1.5),方法的耐用性良好。

        3.8 樣品測定

        按2.2項下的色譜條件及方法,對3批鹽酸伐地那非原料進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)測定,以外標(biāo)法計算已知雜質(zhì)的含量,主成分自身對照法計算未知雜質(zhì)的含量,結(jié)果見表3。

        表3 鹽酸伐地那非有關(guān)物質(zhì)檢測結(jié)果/%

        4 討論

        進(jìn)口藥品注冊標(biāo)準(zhǔn)JX20030240中收載了3個已知雜質(zhì),分別為硫代二嗪酮酸、N-氧化物(Bay40-7424)、代謝物-1(Bay44-5576)。本研究在進(jìn)口藥品注冊標(biāo)準(zhǔn)JX20030240的基礎(chǔ)上,結(jié)合鹽酸伐地那非的合成工藝路線,增加了中間體、反應(yīng)副產(chǎn)物等工藝雜質(zhì)的定量研究。另外,進(jìn)口藥品注冊標(biāo)準(zhǔn)JX20030240中流動相體系為醋酸銨緩沖液-乙腈,其緩沖鹽濃度較高,鹽酸伐地那非主峰與雜質(zhì)A分離度未達(dá)到1.5;為了改善雜質(zhì)與雜質(zhì)、雜質(zhì)與主成分峰之間的分離度,本實驗采用常規(guī)的C18柱(l=0.25 m,Φ=4.6 mm)、乙腈-磷酸三乙胺緩沖液體系,進(jìn)行色譜條件的篩選優(yōu)化,最終確定梯度洗脫色譜條件,結(jié)果各雜質(zhì)峰及主成分峰的峰形良好(拖尾因子均在0.8~1.2之間),分離度均符合要求(≥1.5),色譜條件的耐用性良好,方法準(zhǔn)確、靈敏、精密度良好,可作為鹽酸伐地那非原料藥有關(guān)物質(zhì)的檢測方法。

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