黃美容，曹陽，黃順旺，曹明成

鹽酸伐地那非，英文名為Vardenafil hydrochloride，CAS：224785-91-5，化學(xué)名為2-［2-乙氧基-5-（4-乙基-哌嗪-1-磺?；┍交?5-甲基-7-丙基-3H-咪唑［5，1-f］-［1，2，4］三聯(lián)氮-4-酮單鹽酸鹽，于2003年8月在美國獲得批準(zhǔn)上市，它是由德國拜耳和葛蘭素史克公司共同開發(fā)研制，伐地那非對PDE5的抑制作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對其他PDE的作用（高于PDE6的1.5倍，PDE1的130倍，PDE11的300倍）。適應(yīng)癥：治療男性陰莖勃起功能障礙（ED），其作用機(jī)制是通過抑制人體陰莖海綿體內(nèi)降解cGMP的磷酸二酯酶5型（PDE5），增加性刺激作用下海綿體局部內(nèi)源性的一氧化氮的釋放，使得平滑肌松弛，增加人體陰莖海綿體血流，最終作用于陰莖海綿體，使海綿體平滑肌舒張，促進(jìn)勃起。最新文獻(xiàn)報道，伐地那非還具有治療慢性前列腺炎、肺動脈高壓等作用。

鹽酸伐地那非的合成是以鄰乙氧基苯甲脒鹽酸鹽、N-乙基哌嗪等為起始物料，經(jīng)過取代、縮合、環(huán)合、磺?；?、取代和成鹽等一系列化學(xué)反應(yīng)制成鹽酸伐地那非。本實驗結(jié)合合成工藝路線及降解途徑分析，對以下雜質(zhì)進(jìn)行定量研究。

目前，國內(nèi)相關(guān)文獻(xiàn)報道，均是采用乙腈-醋酸銨溶液體系，測定鹽酸伐地那非原料藥及制劑中的有關(guān)物質(zhì)且最多控制了5個已知雜質(zhì)（雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)F、雜質(zhì)G，各雜質(zhì)結(jié)構(gòu)見圖1）。本實驗采用乙腈-磷酸三乙胺緩沖液體系，新增了2個雜質(zhì)（雜質(zhì)D、雜質(zhì)E，雜質(zhì)結(jié)構(gòu)見圖1），進(jìn)行梯度洗脫，結(jié)果7個雜質(zhì)峰之間、雜質(zhì)與主成分（鹽酸伐地那非結(jié)構(gòu)見圖1）峰之間的分離度均符合要求（≥1.5），其靈敏度好、準(zhǔn)確度高，可作為原料藥有關(guān)物質(zhì)檢查的測定方法。該研究尚未見文獻(xiàn)報道。

圖1 鹽酸伐地那非及各雜質(zhì)結(jié)構(gòu)示意圖

1 儀器與試藥

儀器：AG135電子天平、XP-6電子天平（METTLER TOLEDO）；LC-20AT高效液相色譜儀（日本島津），SPD-20A檢測器，SIL-20AC進(jìn)樣器，島津LabSolutions DB Essentia工作站。試藥：鹽酸伐地那非對照品（批次20190301-J，99.7%）、雜質(zhì)A（批次20190101，98.6%）、雜質(zhì)B（批次20190112，98.4%）、雜質(zhì)C（批次20190124，98.2%）、雜質(zhì)D（批 次20181214，98.4%）、雜質(zhì)E（批次20181226，97.6%）、雜 質(zhì)F（批 次20181206，99.2%）、雜 質(zhì)G（批 次20181025，96.8%）；鹽酸伐地那非原料（批次20190501、20190502、20190503），以上對照品及供試品均來源于合肥創(chuàng)新醫(yī)藥技術(shù)有限公司。除乙腈、三乙胺為色譜純、水為超純水外，其他均為分析純。

2 實驗方法

2.1 溶液的制備

混合雜質(zhì)對照品溶液：精密稱取雜質(zhì)A、B、C、D、E、F、G各約5 mg，置同一50 mL容量瓶中，加乙腈適量振搖使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為混合雜質(zhì)對照品貯備液；精密量取0.3 mL置100 mL量瓶中，加流動相A稀釋至刻度，搖勻，即得。

供試品溶液：取鹽酸伐地那非原料適量，精密稱取20 mg，置100 mL量瓶中，加流動相A適量振搖使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。1%對照溶液：精密量取上述供試品溶液1 mL，置100 mL量瓶中，加流動相A稀釋至刻度，搖勻，即得。

系統(tǒng)適用性溶液：精密稱取鹽酸伐地那非對照品約20 mg，置100 mL量瓶中，再精密量取雜質(zhì)對照品貯備溶液0.3mL，置同一100 mL量瓶中，加流動相A適量振搖使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2 色譜條件及系統(tǒng)適用性

流動相A：0.5%三乙胺溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH至3.0）-乙腈（90∶10），流動相B：0.5%三乙胺溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH至3.0）-乙腈（10：90），Agilent C柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；柱溫40℃；檢測波長242 nm；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量20μL；采用梯度洗脫，洗脫條件見表1。

表1 流動相梯度洗脫條件

精密稱取雜質(zhì)A、B、C、D、E、F、G適量，分別制備各雜質(zhì)的對照品溶液，精密量取20μL，注入液相色譜儀，進(jìn)行定位，再進(jìn)注系統(tǒng)適用性溶液進(jìn)行液相色譜分析。見圖2，3。

圖2 各雜質(zhì)定位色譜圖

系統(tǒng)適用性溶液中各已知雜質(zhì)峰之間及與主成分峰與相鄰雜質(zhì)峰之間的分離度均符合要求（≥1.5）。

圖3 系統(tǒng)適用性實驗色譜圖

3 實驗結(jié)果

3.1 專屬性

精密稱取鹽酸伐地那非原料約20 mg，6份，分別置100 mL量瓶中，其中1份作為破壞對照，另外5份分別進(jìn)行60℃高溫破壞10 d、光照（4 500±500）lx破壞10 d、3%過氧化氫溶液（1 mL）破壞4 h、1 mol/L鹽酸溶液（1 mL）60℃水浴破壞8 h、1 mol/L氫氧化鈉溶液（1 mL）60℃水浴破壞8 h，酸、堿破壞結(jié)束時分別加等量的堿、酸進(jìn)行中和，再用流動相A適量振搖使溶解并稀釋至刻度，搖勻。按“2.2”項下色譜條件進(jìn)樣分析。結(jié)果表明，本品在高溫、光照、酸、堿破壞條件下較穩(wěn)定，僅產(chǎn)生少量的降解雜質(zhì)；氧化破壞條件下不穩(wěn)定，能產(chǎn)生明顯的降解雜質(zhì)。高溫、光照、酸、堿、氧化破壞色譜圖顯示，本品主成分峰與相鄰雜質(zhì)峰之間分離度良好（≥1.5），主成分峰純度因子符合要求，破壞前后物料基本守恒。

3.2 定量限、檢測限、線性范圍與校正因子

精密量取“2.1”項下的混合雜質(zhì)對照品貯備液，加流動相A稀釋制成0.04～1.00μg/mL濃度范圍的一系列混合對照品溶液，精密量取20μL，注入色譜儀，記錄色譜圖。以各成分的濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)（

X

），峰面積為縱坐標(biāo)（

Y

），進(jìn)行線性回歸，并以回歸方程的斜率計算各已知雜質(zhì)相對于鹽酸伐地那非的校正因子（RCF），同時測定各成分的定量限與檢測限，結(jié)果見表2。

表2 鹽酸伐地那非有關(guān)物質(zhì)線性和校正因子

3.3 重復(fù)性

取鹽酸伐地那非原料約20 mg，精密稱定，6份，按“2.1”項下供試品溶液制備方法制備，在“2.2”色譜條件下進(jìn)行測定，以外標(biāo)法計算已知雜質(zhì)的含量，主成分自身對照法計算未知雜質(zhì)的含量，結(jié)果單雜含量（≥0.05%）的RSD均＜10%（

n

=6），總雜含量的RSD均＜5%（

n

=6）。

3.4 中間精密度

由另一人，取鹽酸伐地那非原料約20 mg，精密稱定，6份，按“2.1”項下供試品溶液制備方法制備，換另一臺液相色譜儀，在“2.2”色譜條件下進(jìn)行測定，以外標(biāo)法計算已知雜質(zhì)的含量，主成分自身對照法計算未知雜質(zhì)的含量，結(jié)果單雜含量（≥0.05%）的RSD均＜15%（

n

=12），總雜含量的RSD均＜10%（

n

=12）。

3.5 準(zhǔn)確度

精密稱取鹽酸伐地那非原料約20 mg，9份，每3份分別精密加入2.1項下的混合雜質(zhì)對照品貯備液0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL，按“2.1”項下供試品溶液制備方法制成低、中、高濃度的加樣供試品溶液，精密量取20μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計算各已知雜質(zhì)的回收率，雜質(zhì)A、B、C、D、E、F、G的 平 均 回 收 率 分 別 為99.8%、101.6%、102.4%、99.5%、100.5%、101.7%、103.6%，在99.5%～103.6%范圍內(nèi)，RSD分別為1.8%、0.6%、1.2%、1.4%、0.9%、1.5%、0.9%，均＜2%。

3.6 溶液穩(wěn)定性

按“2.1”項下制備混合雜質(zhì)對照品溶液與供試品溶液，25℃放置，分別于0、2、4、8、12、24、48h精密量取20μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，實驗結(jié)果表明：混合雜質(zhì)對照品溶液各測定時間點的單個雜質(zhì)峰面積與0 h比較，其相對平均偏差均小于2%；供試品溶液各測定時間點的單個雜質(zhì)峰面積與0 h比較，大于0.05%的單個雜質(zhì)峰面積的相對平均偏差均小于5%，且無新的降解雜質(zhì)產(chǎn)生。

3.7 耐用性

分別調(diào)整柱溫（40±2）℃、檢測波長（242±2）nm、流速（1.0±0.05）mL/min及pH（3.0±0.2），同時更換不同品牌的色譜柱，考察色譜條件參數(shù)的變化對系統(tǒng)適用性溶液中雜質(zhì)與主成分之間分離度的影響。實驗結(jié)果表明，柱溫、波長、流速及pH、不同品牌的色譜柱等參數(shù)的變化對系統(tǒng)適用性測定結(jié)果無影響，即鹽酸伐地那非和雜質(zhì)A、B、C、D、E、F、G 7個已知雜質(zhì)的分離度均符合要求（≥1.5），方法的耐用性良好。

3.8 樣品測定

按2.2項下的色譜條件及方法，對3批鹽酸伐地那非原料進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)測定，以外標(biāo)法計算已知雜質(zhì)的含量，主成分自身對照法計算未知雜質(zhì)的含量，結(jié)果見表3。

表3 鹽酸伐地那非有關(guān)物質(zhì)檢測結(jié)果/%

4 討論

進(jìn)口藥品注冊標(biāo)準(zhǔn)JX20030240中收載了3個已知雜質(zhì)，分別為硫代二嗪酮酸、N-氧化物（Bay40-7424）、代謝物-1（Bay44-5576）。本研究在進(jìn)口藥品注冊標(biāo)準(zhǔn)JX20030240的基礎(chǔ)上，結(jié)合鹽酸伐地那非的合成工藝路線，增加了中間體、反應(yīng)副產(chǎn)物等工藝雜質(zhì)的定量研究。另外，進(jìn)口藥品注冊標(biāo)準(zhǔn)JX20030240中流動相體系為醋酸銨緩沖液-乙腈，其緩沖鹽濃度較高，鹽酸伐地那非主峰與雜質(zhì)A分離度未達(dá)到1.5；為了改善雜質(zhì)與雜質(zhì)、雜質(zhì)與主成分峰之間的分離度，本實驗采用常規(guī)的C18柱（l=0.25 m，Φ=4.6 mm）、乙腈-磷酸三乙胺緩沖液體系，進(jìn)行色譜條件的篩選優(yōu)化，最終確定梯度洗脫色譜條件，結(jié)果各雜質(zhì)峰及主成分峰的峰形良好（拖尾因子均在0.8～1.2之間），分離度均符合要求（≥1.5），色譜條件的耐用性良好，方法準(zhǔn)確、靈敏、精密度良好，可作為鹽酸伐地那非原料藥有關(guān)物質(zhì)的檢測方法。