鐘凱苑 楊秋萍 郭微 李菲 石聰聰 李思濤 肖昕 李思平

1佛山市三水區(qū)婦幼保健院產(chǎn)科，廣東 528100；2中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院兒科，廣州 510000；3佛山市三水區(qū)婦幼保健院兒科，廣東 528100

婦女妊娠期間，在身體結(jié)構(gòu)、生理和生物化學(xué)等方面會(huì)發(fā)生復(fù)雜的改變，孕婦在妊娠期身體成分及代謝的改變將影響胎兒的生長(zhǎng)發(fā)育，并影響妊娠結(jié)局。受孕產(chǎn)物、子宮和母體的血液中，蛋白質(zhì)的含量比脂肪、碳水化合物的含量更為豐富［1］。足月時(shí)，胎兒及胎盤的總重量約4 kg，其中包含約500 g的蛋白質(zhì)，占妊娠造成蛋白質(zhì)增加的一半［2］。由此可見，妊娠期蛋白質(zhì)代謝至關(guān)重要。本研究基于MS/MS的代謝組平臺(tái)，對(duì)不同孕周母親及其新生兒血氨基酸進(jìn)行檢測(cè)分析，探討不同孕周母親及新生兒氨基酸代謝特點(diǎn)，為孕期營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取佛山市三水區(qū)婦幼保健院和中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院產(chǎn)科、新生兒科2017年11月至2020年7月住院的健康妊娠婦女143例（年齡范圍21～35歲）及其所生新生兒143例（胎齡范圍28～41周），分為3組：＜32周，22例；32～36+6周，59例；≥37周，62例。所有孕婦無妊娠期合并癥或遺傳性高血脂、糖尿病、甲減、肝臟病或腎臟病病史。3組產(chǎn)婦一般臨床資料比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。本研究獲得佛山市三水區(qū)婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)、中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，所有血液樣本獲得孕婦的知情同意。

1.2 樣本收集 在孕婦及家屬了解和簽署遺傳代謝病疾病篩查知情同意書后，對(duì)孕婦及其所生新生兒進(jìn)行血標(biāo)本采集。干血片采集：在孕婦生產(chǎn)前、新生兒生后1 d內(nèi)進(jìn)行采血，對(duì)采血指尖/足跟進(jìn)行消毒，使用采血針進(jìn)行采血，血滴自然滲透濾紙，連續(xù)采集3個(gè)血斑，每個(gè)血斑直徑大于8 mm，且濾紙正反面完全充分滲透，以保證血濃度均勻一致且無滲血環(huán)。樣本存放及檢測(cè)：采血完畢后把血片平放在陰涼清潔地方進(jìn)行自然晾干，同時(shí)避開紫外線、陽(yáng)光照射及外源污染，干燥后的血片經(jīng)檢查合格后置于密封袋內(nèi)，于2～8℃冰箱中保存，于1周內(nèi)在中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院遺傳代謝病實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 檢測(cè)方法 血串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)儀器為Waters超效液相色譜（I-class）串聯(lián)質(zhì)譜儀（Xevo-TQD，美國(guó)生物應(yīng)用系統(tǒng)公司），采用琥珀酰丙酮和多種氨基酸、肉堿測(cè)定試劑盒進(jìn)行非衍生化，干濾紙血片經(jīng)打孔后加入含100μl內(nèi)標(biāo)的萃取液（甲醇∶超純水=8∶2），放入微孔板震蕩器以700轉(zhuǎn)/min、45℃條件下振蕩45 min后，室溫靜置5 min，取上清液75μl放于96孔耐熱V底板中，鋁膜覆蓋后上機(jī)檢測(cè)。

1.4 數(shù)據(jù)采集與分析 根據(jù)質(zhì)譜峰的m/z進(jìn)行定性，采用定量分析軟件自動(dòng)計(jì)算出所測(cè)樣品氨基酸代謝產(chǎn)物的濃度值，利用SIMCA 14.0數(shù)據(jù)處理軟件，采用正交偏最小二乘判別分析法（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）對(duì)孕婦血氨基酸代謝物質(zhì)進(jìn)行分析并尋找關(guān)鍵差異代謝物。評(píng)價(jià)OPLS-DA模型匹配度的3個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)（R2X表示X矩陣解釋率；R2Y代表Y矩陣解釋率，二者共同反應(yīng)模型穩(wěn)定性；Q2代表模型預(yù)測(cè)性，3者都大于0.5表明模型匹配良好，越接近1說明模型的匹配度越高）。根據(jù)OPLS-DA模型所有變量S-plot圖越偏向兩端的物質(zhì)，其協(xié)方差和相關(guān)性越大，以此篩選差異代謝物。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.5 差異物質(zhì)篩選標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)模型所得的變量權(quán)重圖（variable importance plot，VIP）尋找差異代謝物，選取VIP＞1的代謝物。

2 結(jié) 果

2.1 不同孕周母親及新生兒血氨基酸代謝譜分析結(jié)果 為了消除非必要因素作用的影響，完成兩組間最大化分離，尋找權(quán)重較大的差異代謝物，利用有監(jiān)督OPLS-DA的方法去除與樣品分組無關(guān)的信息，分析不同孕周母親及新生兒血氨基酸代謝全譜。

2.1.1 不同孕周母親血氨基酸代謝譜分析結(jié)果 圖1為不同孕周母親血氨基酸代謝全譜數(shù)據(jù)的OPLS-DA得分圖。由圖1可看出，早產(chǎn)組與足月組母親血氨基酸水平分布在兩個(gè)區(qū)域，表明早產(chǎn)組與足月組母親血氨基酸水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而早產(chǎn)兩組母親（＜32周與32～36+6周）血氨基酸分布在同一個(gè)區(qū)域，表明不同孕周的早產(chǎn)組母親血氨基酸水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 不同孕周母親血氨基酸水平OPLS-DA聚類圖

2.1.2 不同胎齡新生兒血氨基酸代謝譜分析結(jié)果 圖2為不同胎齡新生兒血氨基酸代謝全譜數(shù)據(jù)的OPLS-DA得分圖。由圖2可看出，早產(chǎn)組與足月組新生兒血氨基酸水平分布在兩個(gè)區(qū)域，表明早產(chǎn)組與足月組新生兒血氨基酸水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而早產(chǎn)兩組新生兒（＜32周與32～36+6周）血氨基酸分布在同一個(gè)區(qū)域，表明不同胎齡的早產(chǎn)新生兒血氨基酸水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 不同胎齡新生兒血氨基酸水平OPLS-DA聚類圖

2.2 不同孕周母親及新生兒血氨基酸差異物質(zhì)分析變量重要性得分圖是使用OPLS-DA模型進(jìn)行有監(jiān)督性分析方法中評(píng)價(jià)變量貢獻(xiàn)最常用的方法，根據(jù)VIP大于1.0對(duì)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的物質(zhì)進(jìn)行篩選。本研究不同孕周母親及新生兒血氨基酸23個(gè)物質(zhì)，經(jīng)OPLS-DA模型分析后，不同孕周母親獲得丙氨酸、甘氨酸、谷氨酸、脯氨酸、纈氨酸、亮氨酸共6種權(quán)重大于1的差異代謝物（圖3）；不同胎齡新生兒獲得脯氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、組氨酸共5種權(quán)重大于1的差異代謝物（圖4）。

圖3 不同孕周母親血氨基酸權(quán)重圖（權(quán)重大于1）

圖4 不同胎齡新生兒血氨基酸權(quán)重圖（權(quán)重大于1）

2.3 不同孕周母親及新生兒血氨基酸差異物質(zhì)水平對(duì)不同孕周母親及新生兒進(jìn)行代謝組學(xué)分析，分別得到6個(gè)、5個(gè)差異代謝物，這些氨基酸水平數(shù)值見表1、2。由表中數(shù)據(jù)可看出，與孕周不足月的母親相比，孕周足月母親的丙氨酸、甘氨酸、谷氨酸、脯氨酸、纈氨酸、亮氨酸水平升高；新生兒組有5個(gè)權(quán)重較大的物質(zhì)，與早產(chǎn)新生兒相比，足月新生兒谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸水平升高，而脯氨酸、組氨酸水平降低。

表1 不同孕周母親血氨基酸差異物質(zhì)水平（μmol/L，±s）

表1 不同孕周母親血氨基酸差異物質(zhì)水平（μmol/L，±s）

組別＜32周32～36+6周≥37周F值P值例數(shù)22 59 62丙氨酸139.12±20.00 137.59±27.72 244.67±84.83 56.86＜0.001甘氨酸129.52±35.00 117.59±24.81 165.76±61.67 17.45＜0.001谷氨酸193.51±25.52 188.05±40.25 238.40±73.79 13.43＜0.001脯氨酸99.94±18.92 104.69±20.83 137.41±41.31 20.98＜0.001纈氨酸83.60±12.96 84.76±13.11 112.17±25.63 35.29＜0.001亮氨酸93.82±20.06 94.65±18.28 112.62±35.94 7.64 0.001

3 討 論

近年來，串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)發(fā)展迅速，有靈敏度高、特異性高和檢測(cè)快速的優(yōu)點(diǎn)［3-4］。國(guó)內(nèi)外有多篇研究應(yīng)用該技術(shù)對(duì)尿液、血液、羊水和細(xì)胞等樣本中的氨基酸、有機(jī)酸、脂肪酸和類固醇激素等代謝物進(jìn)行檢測(cè)［5-6］，能更早期、精準(zhǔn)地識(shí)別和預(yù)測(cè)某些疾病，對(duì)減少疾病嚴(yán)重程度和并發(fā)癥的發(fā)生至關(guān)重要。因此，本研究基于MS/MS的代謝組平臺(tái)，對(duì)不同孕周的母親及其新生兒血氨基酸進(jìn)行分析，研究血氨基酸水平的差異，幫助評(píng)估在不同孕周母親及新生兒血氨基酸代謝的狀態(tài)，為進(jìn)一步的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充提供參考。

表2 不同胎齡新生兒血氨基酸差異物質(zhì)水平（μmol/L，±s）

表2 不同胎齡新生兒血氨基酸差異物質(zhì)水平（μmol/L，±s）

組別＜32周32～36+6周≥37周F值P值例數(shù)22 59 62脯氨酸431.63±235.66 571.62±228.19 190.83±117.11 61.88＜0.001谷氨酸151.40±34.43 177.98±44.23 319.06±104.78 67.89＜0.001甘氨酸144.84±48.13 172.51±44.88 277.98±129.10 27.27＜0.001丙氨酸184.11±54.80 201.22±50.75 307.47±127.38 25.42＜0.001組氨酸150.78±103.77 143.15±90.69 34.00±15.87 42.42＜0.001

本研究發(fā)現(xiàn)，在母親方面，孕周足月母親的丙氨酸、甘氨酸、谷氨酸、脯氨酸、纈氨酸、亮氨酸水平高于孕周不足月母親；在新生兒方面，足月新生兒的谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸水平高于早產(chǎn)新生兒，脯氨酸、組氨酸水平低于早產(chǎn)新生兒。然而不論是母親還是新生兒，孕32周前與32～36+6周的血氨基酸水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這提示早產(chǎn)與足月的母親/新生兒的氨基酸代謝差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，主要集中體現(xiàn)在上述7種氨基酸。

丙氨酸是一種生糖氨基酸，在人體內(nèi)最經(jīng)典的代謝途徑為丙氨酸-葡萄糖循環(huán)，在肝臟丙氨酸能夠迅速轉(zhuǎn)化葡萄糖為機(jī)體供能［7］，足月時(shí)母親及新生兒的丙氨酸水平升高，提示足月時(shí)胎兒發(fā)育對(duì)葡萄糖的需求更大，需要更高的丙氨酸進(jìn)行糖異生提供能量。

甘氨酸是結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單的一種人體非必需氨基酸，研究認(rèn)為甘氨酸可用于血紅素、蛋白質(zhì)、核酸的生物合成［8］，還能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞因子、超氧化物的產(chǎn)生和免疫功能［9］，另外甘氨酸還是抑制性神經(jīng)遞質(zhì)［10］，因此甘氨酸在生物合成、抗氧化反應(yīng)、神經(jīng)調(diào)節(jié)等方面具有重要作用，足月時(shí)母親及新生兒的甘氨酸水平均升高，提示可能足月時(shí)胎兒進(jìn)行大量的蛋白合成、體內(nèi)代謝活躍、存在氧化應(yīng)激，需要更多的甘氨酸。

谷氨酸是一種酸性氨基酸，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)含量最多的氨基酸，參與誘導(dǎo)突觸形態(tài)及功能的變化、影響自主運(yùn)動(dòng)神經(jīng)系統(tǒng)。谷氨酸不能透過血腦屏障，飲食中的谷氨酸主要為腸細(xì)胞代謝，為腸上皮細(xì)胞的主要能源物質(zhì)［11］。有研究者提出胎盤和胎兒肝臟之間的Glu-Gln循環(huán)假說，谷氨酸和谷氨酰胺是胎盤和胎兒肝臟能量的主要來源，可以為嘌呤合成提供氮源［12］。研究發(fā)現(xiàn)，宮內(nèi)生長(zhǎng)遲緩的母體谷氨酸濃度顯著降低［13］。本研究中足月母親及新生兒的谷氨酸水平均升高，提示谷氨酸對(duì)胎兒體質(zhì)量、神經(jīng)發(fā)育、代謝具有重要意義。

脯氨酸是一種環(huán)狀的亞氨基酸，在蛋白合成、抗氧化、機(jī)體新陳代謝等方面具有重要調(diào)控作用，研究發(fā)現(xiàn)適量添加脯氨酸可以促進(jìn)胚胎、胎盤、孕體的生長(zhǎng)發(fā)育［14］。組氨酸被稱為半必需氨基酸，由于僅依靠體內(nèi)合成而不從食物攝取則無法滿足機(jī)體生長(zhǎng)需要，因此組氨酸對(duì)嬰幼兒的生長(zhǎng)發(fā)育也至關(guān)重要。本研究中，脯氨酸水平在足月母親體內(nèi)水平升高，而在足月新生兒體內(nèi)水平降低，表明孕足月時(shí)胎兒生長(zhǎng)發(fā)育迅速，對(duì)脯氨酸需求高，足月新生兒由于其自身大量消耗，而此時(shí)攝入相對(duì)不足，使得體內(nèi)脯氨酸及組氨酸水平降低。

對(duì)比母嬰上述幾種差異權(quán)重較大的氨基酸水平，發(fā)現(xiàn)脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸在新生兒中的水平均高于孕母，尤其是脯氨酸；而新生兒谷氨酸水平低于孕母。這提示胎兒在整個(gè)發(fā)育過程中，需要大量氨基酸的供給以完成蛋白合成、新陳代謝、自身生長(zhǎng)發(fā)育，因此在母嬰之間多種氨基酸呈現(xiàn)主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)過程。而谷氨酸雖然是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的重要氨基酸，但有研究提示過高的谷氨酸會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)毒性，其水平是判斷缺氧缺血性腦病病情嚴(yán)重程度及預(yù)后的客觀指標(biāo)［15-16］，因此新生兒谷氨酸水平低于孕母。

在漫長(zhǎng)的妊娠周期，孕婦各個(gè)器官都由于妊娠而產(chǎn)生巨大變化，但目前尚未有研究探討妊娠期婦女及其新生兒的代謝情況，本研究對(duì)不同孕周母親及其新生兒血氨基酸水平進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)早產(chǎn)與足月的母親/新生兒的氨基酸代謝有明顯差異，可初步評(píng)估母嬰血氨基酸代謝情況，為妊娠期營(yíng)養(yǎng)或新生兒期營(yíng)養(yǎng)提供參考，助力于孕體及胎兒的健康生長(zhǎng)發(fā)育。孕母與新生兒血氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)通路及機(jī)制尚不明確，有待更深入的分子研究。

利益沖突：作者已申明文章無相關(guān)利益沖突。