邱玲玲 陳雯 支星 肖瑩

九江職業(yè)大學護理學院，江西 332000

肝纖維化是肝臟遭到各種致病原侵襲，引起肝臟損害與炎性反應后，導致肝臟結構和肝功能異常改變的病理過程。在慢性肝病-肝纖維化-肝硬化的病情演變過程中，肝纖維化是關鍵的中間環(huán)節(jié)。如何有效地阻斷肝纖維化的發(fā)生發(fā)展，積極治療和逆轉肝纖維化，受到國內外學者的高度重視，對防治肝硬化肝癌具有重要意義［1-3］。復方鱉甲軟肝片（Fufang Biejia Ruangan tablet，FFBJ）是原中國人民解放軍302醫(yī)院在30多年臨床治療經驗的基礎上研制而成的，它是國內第一個以治療肝纖維化和早期肝硬化為主的國家級中藥新藥，是《肝纖維化中西醫(yī)結合診療指南》［4］推薦的用于抗纖維化及早期肝硬化的藥物?，F已廣泛用于肝纖維化及多種臟器纖維化疾病的治療。該復方由鱉甲、莪術、三七、黃芪、赤芍、冬蟲夏草等11味中藥精制而成，組方復雜、成分繁多，但目前對FFBJ抗肝纖維化作用物質基礎及作用機制尚未完全闡明。

網絡藥理學是基于計算機虛擬計算、高通量組學數據分析，利用生物信息學方法，研究多成分-多靶點-多疾病的機制，在方法學上具有整體性、系統(tǒng)性的特點，現廣泛應用于中藥復方及單味藥的研究［5］。隨著網絡藥理學的完善與發(fā)展，中醫(yī)藥發(fā)揮臨床療效的分子及機制研究也逐漸變得可視化、效率化和標準化，其理論的建立為多靶點藥物的研究提供科學理論支持，也為研發(fā)新藥提供理論源泉［6］。本研究基于網絡藥理學的方法和技術，從系統(tǒng)生物整體的角度探討FFBJ的抗肝纖維化的作用機理，構建成分-靶點網絡，為深入探討FFBJ抗肝纖維化的作用機制提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 活性成分的篩選口服生物利用度（OB）和類藥性（DL）是藥物篩選、評價化合物成藥性的重要的動力學參數。因此，通過中藥系統(tǒng)藥理學技術平臺（TCMSP）和文獻檢索收集復方鱉甲軟肝片11味藥的所有化合物，并根據其ADME性質進行篩選，以OB≥30%和DL≥0.18為篩選標準，篩選出活性成分。

1.2 潛在作用靶點的預測反向藥效團匹配方法（PharmMapper）是通過對Targetbank、Drugbank、Binding DB和PDTD 4大數據庫進行快速檢索而獲得藥物靶點信息。該服務器內含7 000多個藥效團模型，涵蓋110種臨床適應證，具有運算速度快、靶點信息全面等優(yōu)點。本研究挖掘TCMSP數據庫中FFBJ活性成分的潛在靶點，并登陸PharmMapper服務器 （http：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/），上傳FFBJ的活性成分sdf格式文件，采用“反向藥效團匹配方法”得到虛擬篩選結果，將兩部分數據進行整合。同時使用蛋白質數據庫（UniProt）中UniProtKB搜索功能（https：//www.uniprot.org/），通過輸入靶點名稱并限定物種為人，將檢索得到的靶點校正為其官方名稱，經上述數據庫檢索和轉化，獲取與活性成分相關的靶點信息。

1.3 肝纖維化疾病相關靶點獲取登錄Drugbank數據庫（https：//www.drugbank.ca）和OMIM數據庫（https：//omim.org），以“Hepatic fibrosis”為關鍵詞檢索與肝纖維化相關的靶點基因，作為肝纖維化的靶基因。

1.4 活性成分-靶點網絡構建與分析將獲得的FFBJ活性成分相關靶點與肝纖維化靶點基因相映射，使用Venn作圖分析，獲得二者交集靶點基因，然后使用Cytoscape 3.7.0軟件構建中藥-活性成分-靶點網絡圖，并根據化合物與靶點連接情況進行拓撲分析，預測FFBJ抗肝纖維化的關鍵活性成分和關鍵靶點。

1.5 關鍵靶點的基因本體（GO）和基因組百科全書（KEGG）富集分析 GO分析主要用于注釋基因的功能，包括細胞功能、分子功能和生物功能，已被廣泛應用于生物基因功能分類［12］。使用clusterprofiler對FFBJ治療肝纖維化的靶基因進行GO富集分析和KEGG通路富集分析，以研究其主要生物學過程和代謝通路，以統(tǒng)計學超幾何分布定量（P值）篩選P＜0.05的生物過程及信號通路，用半編程性質的腳本軟件Rproject繪圖將其可視化。

2 結 果

2.1 FFBJ活性成分的篩選 通過TCMSP數據庫篩選出FFBJ中的活性成分，得到符合條件的成分43個。另外，Ginsenoside Rb1、Ginsenoside Rg1、Notoginsenoside R1、Ginsenoside Re、Adenosine雖然其OB值相對較低，但有文獻報道這5種化合物為FFBJ中的活性成分且含量較高［5］，因此共篩選出48個活性成分，見表1。

表1 FFBJ的主要活性成分

2.2 FFBJ中主要活性成分的潛在作用靶點信息 將PharmMapper返回的各個活性成分的潛在作用靶點根據匹配度fit score由高到低進行排序，每個成分取前30個靶點。并與TCMSP數據庫中整理出所有活性成分的潛在靶點進行對比分析，再將所獲得的活性成分預測靶點導入Uniprot數據庫進行基因標準化，去除重復值，歸納總結篩選出931個潛在靶點。

2.3 肝纖維化疾病相關靶點獲取 使用Drugbank、OMIM數據庫收集到肝纖維化潛在靶點，合并去重復后共得到1 117個肝纖維化的相關靶點。

2.4 活性成分-靶點網絡構建與分析 將931個FFBJ化合物作用靶點與1 117個肝纖維化靶點基因進行Venn分析，獲得藥物-疾病交集基因70個，從而得到FFBJ治療肝纖維化的相關作用靶標，將其定義為“關鍵靶點”，對應FFBJ的44個活性成分（Frutinone A、Peroxyergosterol、Ginsenoside Rg1、Perlolyrine 4個成分未找到交集靶點參與相互作用）。

將FFBJ的活性成分、關鍵靶點導入Cytoscape軟件，構建“活性成分-靶點”網絡圖，見圖1。在網絡圖中，綠色六邊形代表活性成分所作用的靶點，紫色長方形代表FFBJ所含有的活性成分。分析網絡圖，可知網絡圖中共包含節(jié)點（node）114個，節(jié)點與節(jié)點之間的作用關系，即邊（edge）384條，展示了FFBJ治療肝纖維化多成分、多靶點的作用。借助Cytoscape對活性成分-靶點網絡進行拓撲分析，得到自由度、介數、中心度均大于平均值的成分的交集，篩選出可能是FFBJ治療肝纖維化的關鍵活性成分18 個 ，即 Calycosin、Formononetin、Ginsenoside Re、alexandrin_qt、ginsenoside Rg5_qt、bisdemethoxycurcumin、Mandenol、DFV、Spinasterol、CLR、adhyperforin、7-Methoxy-2-methyl isoflavone、Mairin、ZINC03860434、quindoline、24-Ethylcholest-4-en-3-one、hyperforin、poriferast-5-en-3beta-ol。同法篩選出可能是FFBJ治療肝纖維化的關鍵靶點20個，即ADK、RXRA、CASP3、MMP2、CYP2C9、MAP2K1、NR3C1、FECH、NR1H4、VDR、RBP4、GC、TGFB2、NR1I2、PPARA、GRB2、IL2、SHBG、SULT2A1、NR3C2。

圖1 FFBJ活性成分-靶點網絡圖

2.5 FFBJ治療肝纖維化作用靶點的GO功能分析與KEGG富集分析 70個藥物活性成分-疾病交集基因影響了92個生物學過程（P＜0.05），選取排名前20的功能信息繪制柱狀圖，如圖2。結果顯示，FFBJ所涉及的生物信息學功能與過程包括類固醇激素受體活性、核受體活性、轉錄因子活性、激素受體粘合物、肽內切酶活性、細胞因子受體粘合物、類固醇粘合物、蛋白質酪氨酸激酶活性、細胞核激素受體粘合物、羧酸粘合物、有機酸粘合物、轉錄共激活劑活性、絲氨酸、蘇氨酸激酶活性等生物過程。

圖2 GO功能富集分析柱狀圖

KEGG富集分析發(fā)現FFBJ治療肝纖維化70個關鍵靶點顯著富集（P＜0.05）在128條通路上，其中包括PI3K-Akt、癌癥蛋白聚糖、絲氨酸蛋白激酶（MAPK）、乙型肝炎、前列腺癌、IL-17、內分泌抵抗、松弛激素、FoxO、腎素、弓形蟲病通路、卡波西肉瘤聯合皰疹病毒感染、TGF-β1、PPAR與Janus激酶/信號轉導與轉錄激活因子（JAK/STAR）等多條信號通路。圖3展示了前20位KEGG通路富集分析結果，其中參與PI3K-Akt信號通路的關鍵靶點數量最多，共18個，包括MAP2K1、FGFR1、GRB2、JAK2、IL2、MAPK1、PIK3CG、IGF1等，且靶點MAP2K1、MAPK1、MAPK8、GRB2、MAPK14在前20的信號通路里涉及10個以上的信號通路；靶點CASP3、TGFB2、MDM2、SRC、IGF1、MMP9、MAP2K1、FGFR1、JAK2、HSP90AA1、GSK3B、SRC、MMP2、MET、CDK在前20的信號通路里涉及5個以上的信號通路。

圖3 FFBJ治療肝纖維化關鍵靶點參與的通路富集信息氣泡圖

3 討 論

復方鱉甲軟肝片由鱉甲、赤芍、冬蟲夏草、三七、紫河車、黃芪、當歸、連翹、莪術、黨參、板藍根11味中藥組成，是首個用于肝纖維化治療的中藥制劑，其臨床療效顯著。因

此，本研究基于網絡藥理學的方法，借助數據庫和軟件對FFBJ抗肝纖維化的作用機制進行探討具有重要意義。

采用Cytoscape 3.7.0軟件構建活性成分-靶點網絡并進行拓撲分析，共預測到FFBJ治療肝纖維化的18個活性成分和20個關鍵靶點。通過Rproject對靶點基因進行GO富集分析和KEGG代謝通路分析，得到GO中92個生物過程條目和128條KEGG通路。圖1表明，FFBJ抗肝纖維化的活性成分和靶基因之間是一個復雜的網絡，交互作用顯著，可見FFBJ治療肝纖維化具有多成分、多靶點的特點。李艷等［7］表明黃芪的主要成分為黃酮類，可通過抗脂質過氧化，減少肝細胞變性、壞死，產生抗肝纖維化作用。本研究得到的活性成分中的毛蕊異黃酮、芒柄花素度值較高（依次為10、18），均屬于黃芪黃酮類成分，這就從理論上印證上述研究結果。Yuan等［8］發(fā)現人參皂苷、三七皂苷可通過Notch、TGF-β1/Smad3等信號通路顯著抑制肝成纖維細胞發(fā)揮抗肝纖維化作用，而本研究也預測出了抗肝纖維化的皂苷類成分如人參皂苷Re、人參皂苷Rg5。此外筆者還發(fā)現FFBJ中未見報道的Mandenol、bisdemethoxycurcumin、adhyperforin、Mairin、Spinasterol、7-Methoxy-2-methyl isoflavone、CLR、ZINC03860434、quindoline、hyperforin 24-Ethylcholest-4-en-3-one度值較大（大于9），連接靶點多、類藥性也較高，提示這些化合物也可能是FFBJ潛在的抗肝纖維化活性成分，有必要進行后續(xù)試驗驗證。

Venn分析得到FFBJ作用靶點與肝纖維化靶點的交集基因共70個，經拓撲分析得到20個關鍵靶點，其中MAP2K1、NR3C1、FECH、RXRA、RBP4、TGFB2、PPARA（大于8）等靶基因度值較大，可能是FFBJ治療肝纖維化的重要靶點。進一步提煉FFBJ治療肝纖維化的生物學過程，發(fā)現其涉及類固醇激素受體活性、轉錄因子活性、細胞因子受體黏合物、蛋白質酪氨酸激酶活性、絲氨酸/蘇氨酸激酶活性等生物過程，這與肝纖維化疾病的發(fā)展有一定關聯性。另外，通過對70個交集基因進行KEGG信號通路富集分析，發(fā)現128條信號通路與肝纖維化的發(fā)病顯著相關（均P＜0.05），包括PI3K-Akt、癌癥蛋白多糖、MAPK、乙型肝炎、IL-17、TGF-β1、PPAR、JAK/STAT等信號通路。而拓撲分析得到的關鍵靶點在上述信號通路中多次富集，如靶點RXRA、CASP3、MMP2、MAP2K1、TGFB2、GRB2、IL2。肝纖維化主要病理特征為細胞外基質（extracellular matrix，ECM）分泌增加以及降解減少，引起ECM大量沉積，而肝星狀細胞（hepatic stellate cell，HSC）是分泌ECM的主要效應細胞，在肝纖維化過程中起著關鍵作用。肝纖維化是多種細胞因子和多條信號通路共同參與、交互作用的復雜過程，從而實現逆轉肝纖維化的可能。盧瑋等［9］綜述肝纖維化相關重要的 主要信號通路，如MAPK、PI3K/Akt、IL-17、TGF-β1、PPAR、JAK/TAT等信號通路。這與本研究中FFBJ肝維化靶點的KEGG代謝通路富集結果幾乎一致，表明FFBJ具有多靶點、多通路抗肝纖維化的潛能。

TGF-β1/Smads信號通路是TGF-β1促纖維化作用中最經典的途徑，通過作用于HSC表面的TGF-β1受體進而引發(fā)促纖維化效應，在HSC的活化與增殖、ECM的沉積和肝纖維化的發(fā)展過程中具有重要意義。本研究中GO富集分析的生物學過程也涉及TGF-β1轉錄因子活性和關鍵靶點TGFB2。研究表明FFBJ藥物血清能顯著抑制HSC分泌TGF-β1，抑制肝Kupffer細胞活化，起到抗肝纖維化的作用［10］。且試驗證實黃芪總黃酮、黃芪多糖、黃芪甲苷、莪術油、赤芍總苷（芍藥苷）、人參皂苷、阿魏酸鈉均可通過抑TGF-β1/Smad信號通路的激活，下調TGF-β1、Smad2等蛋白使得HSCs的活化受到抑制［11-12］。此外，FFBJ中動物藥成分如蟲草多糖、鱉甲水煎液均有報道通過調節(jié)TGF-β1下游信號通路，減少ECM的合成，達到治療肝纖維化的效果［13］。

MAPK能夠通過HSC活化、增殖、凋亡等過程參與肝纖維化的形成與逆轉，包括細胞外信號調節(jié)蛋白激酶（ERK）、p38 MAPK和c-Junnh2末端激酶（JNK）3大類，是介導信號轉導的高度保守調節(jié)因子。Li等［14］報道黃芪甲苷Ⅳ通過抑制氧化應激的產生和相關的p38MAPK活化來抑制HSC活化，Boye等［15］認為黃芪甲苷可通過調節(jié)TGF-β1/Smad途徑改善肝纖維化和肝細胞癌。

JAK/STAT信號通路是近年來發(fā)現的一條重要的細胞內信號轉導通路，該通路參與多種細胞的炎性反應并調節(jié)細胞的增殖、分化、凋亡，是眾多細胞因子信號轉導的共同途徑。動物實驗顯示三七總皂苷能夠降低肝纖維化大鼠血清中AST、ALT的表達，下調肝組織中α-SMA、TGF-β1的水平，其作用機制可能是通過JAK/STAT信號通路誘導HSCs凋亡，產生抗纖維化作用［16］。

PPAR-γ信號通路是抗肝纖維化的重要信號通路，可維持HSC處于靜止狀態(tài)，一旦PPAR-γ基因被抑制，PPAR-γ的表達減少，HSC轉變?yōu)榧せ顮顟B(tài)。此外，還有研究表明，PPAR-γ激動劑可以抑制TGF-β1所誘導的ECM表達上調，發(fā)揮其抗纖維化作用。成揚和汪美鳳［17］證實黃芪提取物可通過PPAR-γ和RXR信號通路產生抗大鼠肝纖維化的作用。孫利兵［18］發(fā)現含有槲皮素和毛蕊異黃酮的沙苑子黃酮（FAC）能抑制β-catenin的表達而導致Wnt信號通路下游靶細胞PPAR-γ表達增加，進而抑制HSC的增殖。

特異性阻斷PI3K/Akt信號通路能夠抑制HSC的增殖、遷移，促進HSC的凋亡。在本研究中，PI3K-Akt信號通路上富集的核心靶點數最多，達18個，包括RXRA、MAPK1PIK3CG、IGF1、IL-4、JAK2、KDR等。本研究還發(fā)現了IL-17通路（富集靶點數11個），Meng等［19］在大量動物實驗研究中發(fā)現，IL-17通過激活KCs和HSCs中的NF-κB/STAT3發(fā)揮促炎和促纖維化作用。NF-κB是不同炎癥因子發(fā)揮促炎反應導致纖維化的共同信號通路。楊瑩［20］研究發(fā)現，鱉甲寡肽I-C-f-6能夠上調炎性抑制因子IL-4、IL-10的表達，抑制腫瘤壞死因子的合成，下調核轉錄因子Kappa B（NF-κB）的表達，提高機體的抗炎能力。Zhang等［21］發(fā)現木犀草素通過調控Nrf2/NF-κB/P53通路減輕氯化汞誘導的肝損傷。邵丹陽證實［22］芍藥苷能降低肝纖維化基本指標α-SMA、Collagen-I的表達，有效地抑制促炎因子的釋放，可能通過調控LXRs-STAT3信號通路改善肝纖維化的發(fā)展進程。Hou等［23］研究顯示，人參皂苷Rb1可通過抑制NF-κB信號通路來完成對炎性反應的應答，促進HSC凋亡。羅飄等［24］研究表明Rg1通過調節(jié)NF-κB/VCAM-1信號途徑抑制炎癥損傷，減輕膽汁淤積性肝纖維化。此外，癌癥蛋白多糖在本研究中富集靶點數也較多（16個靶點），蛋白多糖是一類能連接蛋白骨架的多糖分子，如透明質酸酶（HA）、硫酸軟骨素等。HSC活化狀態(tài)下，合成分泌出大量HA，并加劇前膠蛋白合成，而HA可促進膠原白分子的聚集，使肝臟基底骨架不斷纖維化，而促進肝纖維化。

綜上所述，FFBJ抗肝纖維化的過程涉及多條通路、多個靶點以及多個生物過程，其中本研究預測的MAPK、TGF-β1、PPAR、JAK/STAT信號通路均在理論上得到了驗證，且報道的作用于這些通路的成分可能同樣存在于FFBJ中。而預測的通路PI3K/Akt、IL-17、癌癥蛋白多糖信號通路也有研究證實是抗肝纖維化的作用通路，但涉及的成分與FFBJ相關尚未得到證實；成分木犀草素、人參皂苷Rb1、Rg1、芍藥苷、鱉甲寡肽證實可通過NF-κB通路發(fā)揮抗肝纖維化作用，但該通路在本研究中未被預測到；這些均為未來實驗驗證FFBJ抗纖維化關鍵靶蛋白及作用機制提供了思路與線索。