龔 雯 唐 婕 韋雅淵 寧恩創(chuàng) 韋 璐
(1.廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院,廣西 南寧 530004;2.廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院,廣西 南寧 530007)
金花茶(CamelliaNitidissimaChi)屬山茶科山茶屬,是國家一級保護植物,主要分布于中國廣西壯族自治區(qū)[1]。由于含有特殊的色澤基因KNA,其花瓣呈金黃色半透明狀,被人們譽為“茶族皇后”“植物界的大熊貓”[2]。金花茶葉含有茶多糖、茶多酚、皂苷、黃酮等功能性成分,具有抗氧化[3]、降血糖[4]、降血脂[5]、降血壓[6]、護肝[7]等功能。
多糖(Polysaccharide)是一類對所有生物體都至關(guān)重要的生物大分子,在結(jié)構(gòu)上由醛糖或酮糖通過糖苷鍵連接而成[8]。金花茶多糖已被證實具有保肝[7]、降血脂[9]、抗氧化活性[10]等功能,但有關(guān)金花茶多糖不同分級的抗氧化性比較與分析尚未見報道。研究擬采用水提醇沉的方法提取金花茶粗多糖,通過DEAE-陰離子交換法對金花茶多糖進行分級純化,采用凝膠滲透色譜法(GPC)分析分子量,PMP柱前衍生高效液相色譜法分析單糖構(gòu)成,傅里葉紅外光譜法分析官能團,并對各多糖級分進行體外抗氧化活性分析,旨在為金花茶天然抗氧化劑的開發(fā)利用及金花茶高附加值產(chǎn)品的研發(fā)提供依據(jù)。
金花茶葉干制品:廣西桂人堂金花茶產(chǎn)業(yè)集團股份有限公司;
無水乙醇:分析純,成都市科隆化學(xué)品有限公司;
1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS):分析純,上海麥克林生化試劑有限公司;
雙氧水、過硫酸鉀、抗壞血酸、鄰苯三酚、Tris-HCl:分析純,國藥集團化學(xué)試劑有限公司;
DEAE-52纖維素:上海源葉生物科技有限公司。
電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱:DZF6021型,上海精宏實驗設(shè)備有限公司;
旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:EYELA N-3000型,上海亞榮生化儀器廠;
電子天平:TLE204E型,梅特勒—托利多儀器上海有限公司;
數(shù)控超聲波清洗機:JAC-300N型,山東省濟寧市奧波超聲電氣有限公司;
紫外可見分光光度計:HP-845型,上海儀電分析儀器有限公司;
光柵型多功能微孔板檢測儀(酶標(biāo)儀):InfiniteM200PRO型,奧地利TECAN公司;
高效液相色譜儀:Waters2969型,安捷倫科技有限公司;
示差折光檢測器:2414型,美國Waters Corporation公司。
1.3.1 金花茶粗多糖提取 參照劉茜等[11]的方法并稍作修改。
金花茶葉干制品→剪切碾碎→熱水浸提[料液比(m金花茶葉∶V蒸餾水)1∶55(g/mL),時間2.5 h,溫度92 ℃]→旋蒸濃縮(濃縮比10∶1)→醇沉(4倍體積乙醇)→離心→復(fù)溶→Sevage法脫蛋白→聚酰胺樹脂吸附脫色→離心過濾→透析→冷凍干燥→粗多糖
1.3.2 金花茶多糖分離、純化 參照田曉春[12]的方法并稍作修改。配制15 mg/mL的金花茶粗多糖溶液10 mL,離心,取上清液緩慢加入2.6 cm×60 cm的DEAE-52 纖維素層析柱中,按流速15 mL/h,20 min/管,以去離子水、0.1,0.2,0.3,0.4,0.5 mol/L的NaCl溶液依次進行梯度洗脫。以管數(shù)為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo)繪制洗脫曲線,收集濃縮同一峰洗脫液,透析并凍干,獲得多糖組分,按式(1)計算多糖回收率。
(1)
式中:
c——回收率,%;
m——回收樣品質(zhì)量,mg;
M——上樣量,mg。
1.3.3 多糖組分理化指標(biāo)測定
(1)總糖含量:采用苯酚硫酸法[13]。
(2)糖醛酸含量:采用咔唑硫酸法[14]。
(3)蛋白質(zhì)含量:采用考馬斯亮藍法[15]。
(4)多酚含量:采用福林酚法[16]。
(5)還原糖含量:采用DNS法[17]。
1.3.4 金花茶多糖分子量分析 參照邵淑宏[18]的凝膠滲透色譜法(GPC)并稍作修改。超純水配置1 mg/mL多糖溶液,過0.22 μm濾膜后待測。色譜條件:色譜柱為TSKgel-G400PWXL,RID-10A示差檢測器,柱溫為常溫,流動相為超純水,流速0.5 mL/min。
1.3.5 金花茶多糖單糖組成測定 參照黃小蘭等[19]的PMP柱前衍生高效液相色譜法并稍作修改。
(1)多糖水解:取金花茶多糖約10 mg,加入2 mol/L的硫酸溶液2 mL,105 ℃水浴6 h,加入4 mol/L的氫氧化鈉溶液2 mL,備用。
(2)衍生化:取單糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液、金花茶多糖水解儲備液、單糖混合物標(biāo)準(zhǔn)液各400 μL,加入0.5 mol/L的PMP甲醇溶液200 μL,0.3 mol/L的NaOH溶液200 μL,混勻。70 ℃水浴100 min,冷卻至室溫,添加0.3 mol/L的鹽酸200 μL中和溶液。添加氯仿1 mL,渦旋混勻30 s,靜置,棄下層。反復(fù)萃取3次,取水層溶液過0.22 μm 濾膜,待HPLC進樣分析。
(3)色譜條件:色譜柱為VenusilMP-C18,2.1 mm×30 mm,5 μm,采用Agilent 1200色譜系統(tǒng),測定波長250 nm,柱溫30 ℃,流量1 mL/min,流動相為0.05 mol/L 的磷酸鹽緩沖溶—乙腈(V磷酸鹽緩沖液∶V乙腈為83∶17),樣本數(shù)量15 μL,持續(xù)時間80 min。
1.3.6 傅里葉紅外光譜 稱取干燥樣品1 mg,加入約100 mg KBr研磨并封閉樣品顆粒,制成透明壓片,于400~4 000 cm-1內(nèi)進行光譜掃描。
1.3.7 金花茶多糖的抗氧化性
(2)
式中:
A0——鄰苯三酚自氧化速率;
AX——加入金花茶多糖后鄰苯三酚自氧化速率。
(2)ABTS+·清除能力:參照文獻[21]。按式(3)計算ABTS+·清除率。
(3)
式中:
C2——ABTS+·清除率,%;
As——樣品組吸光值;
A0——空白組吸光值。
(3)DPPH·清除能力:參照文獻[21]。按式(4)計算DPPH·清除率。
(4)
式中:
C3——DPPH·清除率,%;
As——樣品液組吸光值;
Ab——樣品對照組吸光值;
Ac——空白組吸光值。
(4)·OH清除能力:參照文獻[21]。按式(5)計算·OH 清除率。
(5)
式中:
C4——DPPH·的清除率,%;
As——添加樣品溶液和水楊酸鈉溶液組的吸光值;
Ab——不添加水楊酸鈉溶液,而用 0.3 mL去離子水取代組的吸光值;
Ac——用去離子水代替樣品溶液組的吸光值。
各試驗均重復(fù)3次,采用SPSS 19.0和Origin 10.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行分析和作圖,并計算半數(shù)抑制濃度IC50值。
以DEAE-52纖維素對金花茶粗多糖進行分離,得到洗脫曲線如圖1所示。將洗脫液中含量較多的多糖分別收集、濃縮、透析、凍干后得到3個多糖級分,分別為去離子水洗脫的TPS1、0.2 mol/L NaCl溶液洗脫的TPS2、0.3 mol/L NaCl溶液洗脫的TPS3,測定其理化指標(biāo)和回收率見表1。由表1可知,各多糖級分的中性糖和酸性糖含量存在差異:TPS1中中性糖成分較多,TPS2和TPS3中糖醛酸含量較高,且糖醛酸含量TPS3>TPS2。這可能是因為洗脫液鹽濃度越高,得到的多糖酸性強度越強,糖鏈上含有的酸性基團如硫酸基、羧基也越多[22-23]。
表1 TPS1、TPS2、TPS3的化學(xué)組成及回收率?
圖1 金花茶粗多糖的洗脫曲線
采用凝膠滲透色譜(GPC)測定TPS1、TPS2、TPS3的純度及分子量,用葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品建立的校正曲線方程為:lgMw=-0.008 7t3+0.366 3t2-5.304 6t+31.37,R2=0.999 6。由圖2可知,TPS1是由兩個不同分子量(1.55×105,1.05×104Da)的組分構(gòu)成的混合多糖,TPS2和TPS3為均一組分,分子量分別為4.21×105,6.67×105Da。
圖2 TPS1、TPS2和TPS3的GPC分析圖譜
采用PMP柱前衍生高效液相色譜法測得TPS1、TPS2和TPS3的單糖構(gòu)成如表2所示,圖3為8種單糖標(biāo)準(zhǔn)品混合的PMP衍生物及3種金花茶多糖的HPLC圖譜。由表2、圖3可知,3種金花茶多糖級分的單糖種類及比例存在差異:TPS1主要由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖構(gòu)成,且未檢出葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸成分;TPS2與TPS3主要由鼠李糖、半乳糖醛酸、半乳糖、阿拉伯糖構(gòu)成,TPS3中半乳糖醛酸摩爾百分比高于TPS2。
1.甘露糖 2.核糖 3.鼠李糖 4.葡萄糖醛酸 5.半乳糖醛酸 6.葡萄糖 7.半乳糖 8.阿拉伯糖
表2 TPS1、TPS2、TPS3的單糖組成
圖4 TPS1、TPS2和TPS3的紅外光譜圖
圖5 樣品對的清除率
2.5.2 ABTS+·清除能力 由圖6可知,TPS1、TPS2和TPS3對ABTS+·具有一定的清除能力,且呈劑量依賴關(guān)系。當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為1 mg/mL時,TPS1、TPS2、TPS3和維生素C對ABTS+·的清除率分別為42.31%,62.27%,69.96%,94.79%,對ABTS+·清除能力的IC50值依次為TPS1(1.742 mg/mL)>TPS2(0.749 mg/mL)>TPS3(0.534 mg/mL)>維生素C(0.018 mg/mL)。葉潤等[29]研究發(fā)現(xiàn),油菜葉多糖對ABTS+·清除能力的IC50值為1.63 mg/mL;岳崢嶸等[30]研究發(fā)現(xiàn),鉚釘菇多糖對ABTS+·清除能力的IC50值為10.28 mg/mL。綜上,金花茶多糖具有一定的ABTS+·清除能力,其中TPS3的最佳。
圖6 樣品對ABTS+·的清除率
2.5.3 DPPH·清除能力 由圖7可知,TPS1、TPS2和TPS3對DPPH·具有較好的清除能力,且呈明顯的劑量依賴關(guān)系。當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為1 mg/mL時,TPS1、TPS2、TPS3和維生素C對DPPH·清除率分別為44.30%,65.10%,71.95%,99.90%,對DPPH·清除能力的IC50值依次為TPS1(1.748 mg/mL)>TPS2(0.725 mg/mL)>TPS3(0.557 mg/mL)>維生素C(0.006 mg/mL)。陳浩[31]研究表明普洱茶多糖對DPPH·清除能力的IC50值為1.45 mg/mL;張陽等[32]研究發(fā)現(xiàn),南酸棗多糖對DPPH·清除能力的IC50值為3.08 mg/mL。綜上,金花茶多糖具有較好的DPPH·清除能力,其中TPS3的最佳。
圖7 樣品對DPPH·的清除率
2.5.4 ·OH的清除能力 由圖8可知,TPS1、TPS2和TPS3具有較好的·OH清除能力,且呈明顯的量效關(guān)系。當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為1 mg/mL時,TPS1、TPS2、TPS3和維生素C對·OH的清除率分別為56.15%,77.28%,84.56%,89.40%,對·OH清除能力的IC50值依次為TPS1(0.989 mg/mL)>TPS2(0.583 mg/mL)>TPS3(0.233 mg/mL)>維生素C(0.012 mg/mL)。石玉濤[33]研究發(fā)現(xiàn),·OH清除率最高的茶多糖其IC50值為1.14 mg/mL;熊磊等[34]研究發(fā)現(xiàn)黃金茶多糖對·OH清除能力的IC50值為1.713 mg/mL。綜上,金花茶多糖具有較強的·OH清除作用,且TPS3較TPS2和TPS1具有更強的清除能力。
圖8 樣品對·OH的清除率
TPS1、TPS2和TPS3均具有一定的抗氧化性,但較陽性對照維生素C組存在一定差距,而這種差距來源于維生素C和多糖提供氫質(zhì)體及接收電子程度的難易程度[35]。3種金花茶多糖級分TPS1、TPS2和TPS3的抗氧化性各不相同,抗氧化性TPS13 結(jié)論