丘苑新 張澤雄 何 娣 蔡健常 柳建良

(仲愷農業(yè)工程學院現(xiàn)代農業(yè)工程創(chuàng)新研究院，廣東 廣州 510225)

柚子[Citrusmaxima(Burm)Merr.]屬于蕓香科柑橘屬，有著“天然水果罐頭”之美譽[1]，其氣味芬芳，口感酸甜，具有極高的營養(yǎng)及藥用價值[2]。柚樹葉富含精油、黃酮等物質，其中黃酮類化合物具有抑制多種細菌、真菌、病原體等致病微生物的作用，還具有抗腫瘤的作用，被廣泛應用于臨床上[3-4]。此外，黃酮類化合物還能與其他藥物、維生素等復配發(fā)揮協(xié)同作用，顯著提高其生物活性[5]。常見的黃酮提取方法有超聲波輔助提取法[6]、超臨界提取法[7]、有機溶劑提取法[8]、微波輔助提取法[9]及堿提酸沉法[10]。超聲輔助提取法是一種高效、環(huán)保的提取技術，常用于提取熱不穩(wěn)定性的成分[11]，周旋等[12]通過超聲輔助法提取女貞子總黃酮并進行抗氧化活性研究；Luis等[13]采用超聲輔助提取藤黃總黃酮并將其提取率提高了3倍以上。目前，有關柚樹葉的研究主要集中在精油的提取方面，如郭剛軍等[14]運用超臨界萃取柚樹葉精油并進行GC-MS分析；黃桂平等[15]采用微波輻射法提取柚樹葉香精油，其得率達1.03%；Tan等[16]通過微波輔助水解法提取柚樹葉精油，并采用響應面法進行工藝優(yōu)化。而關于柚樹葉黃酮的報道較少，如周夢春等[17]僅對柚樹葉黃酮含量進行了測定，但并未進行提取工藝優(yōu)化與抗氧化、抑菌性能研究。研究擬以柚樹葉為原料，通過超聲輔助法提取總黃酮，優(yōu)化其工藝條件，并對提取物的抗氧化和抑菌能力進行探索，以期為更全面地開發(fā)利用柚樹葉黃酮提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮柚樹葉：采自廣東梅州市；

蘆丁標準品、鐵氰化鉀、磷酸鹽緩沖液(pH 6.82)：分析純，上海源葉生物技術有限公司；

無水乙醇、石油醚、氯化鋁、氯化鐵：分析純，廣州化學試劑廠；

三氯乙酸：分析純，天津市百世化工有限公司；

亞硝酸鈉：分析純，天津市永大化學試劑有限公司；

抗壞血酸：分析純，廣東光華科技股份有限公司；

金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌：仲愷農業(yè)工程學院微生物實驗室；

超聲波清洗機：YL-040S型，深圳市聚眾發(fā)商貿有限公司；

旋轉蒸發(fā)儀：：RV10型，武漢集思儀器設備有限公司；

生化培養(yǎng)箱：SPX-150型，上海悅豐儀器儀表有限公司；

低速離心機：SC-3610型，安徽中科中佳科學儀器有限公司；

分光光度計：UV-1800PC型，太原衡天力科貿有限公司；

高壓滅菌鍋：YXQ-LS-50SII型，上海博訊實業(yè)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 柚樹葉總黃酮提取工藝流程

柚樹葉清洗→65 ℃烘干至恒重→粉碎→取2.0 g樣品用乙醇浸提總黃酮(40 ℃、功率240 W)→減壓抽濾→離心(5 000 r/min、10 min)→測定上清液吸光度(510 nm)→石油醚脫脂、脫色→旋轉蒸發(fā)(50 ℃)→冷凍干燥

1.2.2 蘆丁標準曲線的繪制 根據(jù)文獻[18]并修改：精確稱取2.5 mg蘆丁標準品溶于25 mL體積分數(shù)為90%乙醇溶液中，制得0.1 mg/mL的蘆丁儲備液。分別吸取蘆丁儲備液0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL于10 mL容量瓶中，加入0.3 mL質量分數(shù)為5%的NaNO2溶液搖勻并靜置6 min；加入0.3 mL質量分數(shù)為5%的Al(NO3)3溶液搖勻并靜置6 min；加入4.0 mL濃度為1 mol/L的NaOH溶液并用體積分數(shù)為30%乙醇溶液定容，搖勻，靜置15 min。以未加蘆丁標準液的反應溶液作為參比溶液，測定510 nm處吸光度；以蘆丁質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，得y=15.160x+0.006，R2=0.999 8。

1.2.3 柚樹葉總黃酮提取量的測定 精確吸取1 mL柚樹葉提取液，按式(1)計算總黃酮提取量。

(1)

式中：

g——總黃酮提取量，mg/g；

c——總黃酮質量濃度，mg/mL；

n——稀釋倍數(shù)；

m——柚樹葉干粉質量，g。

1.2.4 單因素試驗

(1)乙醇體積分數(shù)：固定提取時間40 min、料液比(m柚樹葉∶V乙醇)1∶20(g/mL)，探究乙醇體積分數(shù)(50%，60%，70%，80%，90%)對總黃酮提取量的影響。

(2)提取時間：固定乙醇體積分數(shù)60%、料液比(m柚樹葉∶V乙醇)1∶20(g/mL)，探究提取時間(20，30，40，50，60 min)對總黃酮提取量的影響。

(3)料液比：固定乙醇體積分數(shù)60%、提取時間40 min，探究料液比[1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30(g/mL)]對總黃酮提取量的影響。

1.2.5 正交試驗 在單因素試驗基礎上，選取提取時間、乙醇體積分數(shù)和料液比為因素進行正交試驗設計，以確定柚樹葉黃酮的最佳提取工藝。

1.2.6 抗氧化能力

(1)樣品制備：取最優(yōu)提取工藝下的提取液，加入25 mL 石油醚重復萃取3次，以除掉色素與脂溶性物質，旋轉蒸發(fā)以除掉乙醇和石油醚，冷凍干燥得黃酮類化合物干粉。用體積分數(shù)為30%乙醇溶解提純后的黃酮類化合物干粉，配制成黃酮類化合物質量濃度為0.147 mg/mL的溶液，同時配制總黃酮質量濃度為0.147 mg/mL未除雜的提取液與0.147 mg/mL的抗壞血酸溶液作為對照。

(2)總還原力測定：根據(jù)文獻[19]并修改。分別吸取樣品液0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL于15 mL離心管中，用蒸餾水將各離心管液體補足至1 mL，復配溶液中黃酮質量濃度依次為0.000，0.029，0.059，0.088，0.118，0.147 mg/mL，依次加入0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.82)2.5 mL，搖勻，加入質量分數(shù)為1%的K3[Fe(CN)6]溶液2.5 mL，搖勻，50 ℃水浴20 min，加入體積分數(shù)為10%的CCl3COOH溶液2.5 mL，3 000 r/min離心10 min。分別取離心后上清液2.5 mL于10 mL試管中，加入質量分數(shù)為0.1%的FeCl3溶液0.5 mL，定容至10 mL，搖勻，靜置15 min。以未加樣品液的反應溶液作為參比溶液，測定700 nm處吸光度。

1.2.7 抑菌能力

(1)柚樹葉提取液的制備：取除色脫脂后的黃酮類化合物干粉，用體積分數(shù)為30%乙醇溶解，配成黃酮類化合物質量濃度為0.147 mg/mL，同時配制總黃酮質量濃度為0.147 mg/mL的未除雜提取液作為對照。

(2)菌懸液制備：金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌經(jīng)兩次活化，菌液用生理鹽水稀釋，于血球計數(shù)板計數(shù)，選取菌液濃度為(1×106～4×106CFU/mL，接種時，將菌液濃度稀釋至106CFU/mL。

(3)抑菌圈測定：采用牛津杯法[20]。以體積分數(shù)30%乙醇為空白對照，青霉素為陽性對照。

(4)最低抑菌濃度：采用二倍稀釋法[21]，將柚樹葉黃酮類化合物提取液用體積分數(shù)30%乙醇稀釋為原液的100.0%，50.0%，25.0%，12.5% 4個濃度，觀察各提取液濃度下的培養(yǎng)皿是否出現(xiàn)抑菌圈。

1.3 數(shù)據(jù)處理

運用SPSS 25.0、Origin 9.5軟件進行數(shù)據(jù)處理及圖形繪制。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 乙醇體積分數(shù)對柚樹葉黃酮提取量的影響 由圖1 可知，柚樹葉總黃酮提取量隨乙醇體積分數(shù)的增加呈先升高后降低趨勢，最高達到10.24 mg/g。當乙醇體積分數(shù)為50%～80%時，柚樹葉總黃酮提取量逐漸升高，可能是隨著乙醇體積分數(shù)的增加，醇溶性黃酮類化合物加速溶解[22]。繼續(xù)增大乙醇體積分數(shù)，總黃酮提取量減小，說明乙醇體積分數(shù)較大時，溶劑的極性降低，大量的脂溶性和醇溶性成分溶出，黃酮類化合物溶解度降低，從而導致總黃酮提取量減小[23]。因此，提取柚樹葉總黃酮的乙醇體積分數(shù)以80%為宜。

圖1 乙醇體積分數(shù)對黃酮提取量的影響

2.1.2 提取時間對柚樹葉黃酮提取量的影響 由圖2可知，總黃酮提取量隨提取時間的延長先增加后減少。當提取時間為20～50 min時，柚樹葉細胞壁逐漸被破壞，黃酮類物質在超聲波作用下不斷溶出并在50 min時全部溶出，故總黃酮提取量逐漸增加[24]；若繼續(xù)延長提取時間，長時間的超聲會使黃酮結構發(fā)生破壞或者發(fā)生降解使提取率下降[25]。因此，提取柚樹葉總黃酮的提取時間以50 min 為宜。

圖2 提取時間對黃酮提取量的影響

2.1.3 料液比對柚樹葉黃酮提取量的影響 由圖3可知，隨著料液比的增加，總黃酮提取量不斷升高。隨著溶劑的增加，柚樹葉粉末與溶液更加充分接觸，黃酮析出速率加快，黃酮提取量逐漸升高；當料液比(m柚樹葉∶V乙醇)<1∶20(g/mL)時，黃酮提取量顯著提高；當料液比(m柚樹葉∶V乙醇)>1∶20(g/mL)時，黃酮提取量不僅增加緩慢，而且會大大增加提取成本[26]。因此，最佳的料液比(m柚樹葉∶V乙醇)為1∶20(g/mL)。

圖3 料液比對黃酮提取量的影響

2.2 正交試驗

根據(jù)單因素試驗結果，選取乙醇體積分數(shù)、提取時間和料液比為因素，總黃酮提取量為響應值進行三因素三水平正交試驗設計。因素水平表見表1，正交試驗設計與結果見表2。

表1 因素水平表

由表2可知，柚樹葉總黃酮提取量的主次因素為乙醇體積分數(shù)>提取時間>料液比，最佳提取條件為A3B3C2，即乙醇體積分數(shù)80%、提取時間50 min、料液比(m柚樹葉∶V乙醇)1∶25(g/mL)。最佳提取條件下進行3次平行試驗，測得總黃酮提取量平均值為11.746 mg/g，高于正交試驗中的任一結果，符合最優(yōu)條件，表明正交試驗得出的最佳工藝結果具有可靠性。

表2 柚樹葉總黃酮提取正交試驗設計與結果

2.3 抗氧化能力

由圖4可知，隨著樣品液質量濃度的升高，其總還原能力逐漸增強，證明該抗氧化活性的樣品與其添加量有良好的量效關系。未除雜的提取液總還原力約是初步除雜樣品液的50%，當樣品質量濃度>0.088 mg/mL時，抗氧化活性隨樣品質量濃度的增加逐漸趨于平緩，可能是未除雜的提取液中含有色素及脂類的干擾，降低了其抗氧化活性。而除去色素與脂類的樣品液，其總還原力略高于抗壞血酸，約是同等質量濃度抗壞血酸的1.25倍。初步除雜后的提取液在高濃度時依然能保持較好的還原能力，若進一步提純柚樹葉黃酮類化合物，其抗氧化能力將會更強。

圖4 總還原力測定結果

2.4 抑菌能力

由表3可知，柚樹葉黃酮類化合物提取液在大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌的培養(yǎng)基中均出現(xiàn)了抑菌圈，其對3種菌有一定的生長抑制作用。未經(jīng)除雜的提取液抑菌效果較差，金黃色葡萄球菌表現(xiàn)為中度敏感、大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌表現(xiàn)為低度敏感，但有抑菌圈出現(xiàn)，說明仍有一定抑菌效果。而除掉色素和脂類物質的提取液抑菌效果較好，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出高度敏感，鼠傷寒沙門氏菌表現(xiàn)出中度敏感。3種細菌對于同等質量濃度的青霉素均表現(xiàn)出高度敏感，在總體抑菌活性上：青霉素>提取液(除色素和脂類)>提取液(未經(jīng)處理)>體積分數(shù)30%乙醇；柚樹葉黃酮提取液的最低抑菌質量濃度(MIC)為 0.074 mg/mL。

表3 柚樹葉黃酮類化合物的抑菌效果

3 結論

試驗表明，通過正交試驗優(yōu)化的柚樹葉總黃酮最佳工藝條件為：乙醇體積分數(shù)80%，超聲時間50 min，料液比(m柚樹葉∶V乙醇)為1∶25(g/mL)，此條件下總黃酮提取量為11.746 mg/g。柚樹葉總黃酮提取液的質量濃度越大，其總還原力越強，經(jīng)除去色素、脂類的柚樹葉總黃酮提取液的總還原力高于未經(jīng)處理的提取液和抗壞血酸，是抗壞血酸的1.25倍。總黃酮提取液的抑菌效果與其質量濃度呈正相關，其對金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌、大腸桿菌具有不同程度的抑制作用，其中對金黃色葡萄球菌的抑制作用最強，最低抑菌質量濃度為0.074 mg/mL。綜上，柚樹葉總黃酮具有良好的抗氧化和抑菌能力，后續(xù)將對其他方面的性質進行進一步研究。