向麗萍 范斌強 楊志龍 伍 強 余有貴

(1.邵陽學(xué)院食品與化學(xué)工程學(xué)院，湖南 邵陽 422000；2.生態(tài)釀酒技術(shù)與應(yīng)用湖南省重點實驗室，湖南 邵陽 422000；3.湖南湘窖酒業(yè)有限公司，湖南 邵陽 422000)

固態(tài)發(fā)酵中真菌種群主要來源于大曲[1]，大曲中的微生物主要來自原料、器具、空氣、水等[2]，其微生物種類、數(shù)量以及群落結(jié)構(gòu)對大曲品質(zhì)有直接影響[3]。根據(jù)群落結(jié)構(gòu)和功能不同，可以將大曲中的微生物分為霉菌、酵母菌、細(xì)菌等[4]。大曲中酵母優(yōu)勢菌群主要為釀酒酵母和東方伊薩酵母[5]，酵母是白酒釀造過程中主要的功能菌[6]；產(chǎn)酯酵母又叫生香酵母，能促進酯類的生成，形成白酒的特征風(fēng)味物質(zhì)[7]。朱文優(yōu)[8]通過比較夏秋兩季高溫大曲中的真菌群落結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵前期Pichia、Saccharomycopsis和Wickerhamomyces是夏秋兩季大曲中的主要真菌；Pichia是秋季大曲整個生產(chǎn)過程中的主要真菌類群，Thermoascus是夏季大曲發(fā)酵后期的優(yōu)勢真菌類群。劉建學(xué)等[9]從濃香型白酒酒醅中篩選出兩株高產(chǎn)酯的戴爾有孢圓酵母(Torulasporadelbrueckii)。伍強等[10]從野生獼猴桃中篩選鑒定出一株適于獼猴桃果酒發(fā)酵的釀酒酵母，制成的果酒產(chǎn)品具有良好的ACE抑制活性。董琪等[11]從濃香型大曲中分離得到一株可耐受42 ℃高溫且具有一定發(fā)酵產(chǎn)酒能力的酵母菌，該菌株經(jīng)鑒定為Zygosaccharomycescidri。陽秀蓮等[12]從不同楊梅鮮果及果園環(huán)境中篩選得出一株發(fā)酵性能好耐受性強的釀酒酵母RY1。劉延波等[13]從中高溫大曲中分離得到一株名為Pichiakudriavzevii的酵母菌且具有很好的耐高溫耐乙醇性能。應(yīng)靜等[14]用5種不同的商業(yè)酵母菌發(fā)酵甘蔗酒，確定出兩株酵母菌更適宜用于甘蔗酒釀造。

濃香型白酒回糟酸度高，導(dǎo)致酵母菌產(chǎn)酒率低，丟糟殘余淀粉含量高，影響企業(yè)的經(jīng)濟效益及生態(tài)效益。目前，對大曲中酵母菌研究大多集中在分離篩選、鑒定[15-16]等方面，也有對其耐高溫、耐乙醇、耐酸等特性進行研究的[17-18]。將耐高溫、耐酸性等耐受性較好的酵母菌應(yīng)用于濃香型白酒生產(chǎn)中，對解決濃香型白酒中回糟酸度高、殘余淀粉含量高的現(xiàn)狀具有重要意義。研究擬以中高溫大曲為研究對象，通過平板劃線純化、WL培養(yǎng)基形態(tài)觀察及顯微鏡觀察對中高溫大曲中酵母菌進行初步鑒定，再通過TTC培養(yǎng)基染色篩選、差異酸度培養(yǎng)基篩選適用于回糟發(fā)酵耐酸性產(chǎn)酒精能力強的酵母菌，并進行分子生物學(xué)鑒定、生物學(xué)特性及回糟發(fā)酵小試研究，為進一步提高濃香型白酒回糟發(fā)酵出酒率提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

中高溫大曲：4個月成品曲，湖南省湘窖酒業(yè)有限公司；

黃水：湖南省湘窖酒業(yè)有限公司；

蛋白胨、葡萄糖、酵母膏、瓊脂等培養(yǎng)基配制試劑：分析純，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；

美蘭染液：青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；

香柏油：上海生物制品研究所有限責(zé)任公司；

TTC：化學(xué)純，博立生物制品有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

分離培養(yǎng)基：采用YEPD培養(yǎng)基，115 ℃滅菌20 min；

形態(tài)鑒定培養(yǎng)基：采用WL培養(yǎng)基，121 ℃滅菌20 min；

高粱汁培養(yǎng)基：500 g高粱粉與4倍體積蒸餾水充分混合，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%液化酶攪拌均勻，80 ℃水浴酶解2 h，再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的糖化酶攪拌均勻，60 ℃水浴酶解4 h，離心過濾，加水稀釋至糖度為10～12 °Bx；

TTC培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，蛋白胨10 g，酵母膏5 g，瓊脂7.5 g，水500 mL，121 ℃滅菌20 min，無菌環(huán)境加入0.25 g TTC。

1.3 儀器與設(shè)備

高壓蒸汽滅菌鍋：G154-DWS型，致微(廈門)儀器有限公司；

便攜式pH計：LE438型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司；

紫外分光光度計：UV-3802型，重慶萬達儀器有限公司；

電子式液體密度計：BHOM-SJ04型，石家莊市百亨通用儀器儀表制造有限公司；

電子顯微鏡：AE2000+MoticamS3型，麥克奧迪實業(yè)集團有限公司；

單人單面垂直凈化工作臺：SW-CJ-1FD型，蘇州博萊爾凈化設(shè)備有限公司；

電熱恒溫水浴鍋：H21-6型，北京市東霞電子儀表廠；

萬能粉碎機：FW-400A型，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；

恒溫培養(yǎng)箱：SCIENTZ-18N型，北京科偉永興儀器有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 中高溫大曲中酵母菌的分離純化與初篩 無菌條件下稱取25.0 g成品曲樣品至裝有225 mL無菌水的錐形瓶內(nèi)，充分搖勻，同時制備10-2，10-3，10-4，10-5，10-6倍的稀釋樣品勻液，吸取0.1 mL稀釋液涂布至YEPD富集培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h。挑選符合酵母形態(tài)的單菌落菌株進行平板劃線3次，獲得純種菌株。采用TTC培養(yǎng)基篩選，菌株顏色越深其產(chǎn)酒精能力越好，通過觀察菌落顏色篩選產(chǎn)酒精能力較強的純化菌株。將純化菌株接種于WL培養(yǎng)基中，觀察菌落形態(tài)，通過顯微鏡觀察確定細(xì)胞結(jié)構(gòu)，并對其進行初步分類。將純化的菌株轉(zhuǎn)移到Y(jié)EPD斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待菌株菌落生成后，置于4 ℃冰箱保藏。

1.4.2 耐酸性酵母菌的復(fù)篩 將純化菌株接種于YEPD液體培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫培養(yǎng)1 d，調(diào)整種子活化液濃度為1.0×107CFU/mL，采用富含有機酸的黃水調(diào)節(jié)YEPD液體培養(yǎng)基的pH，設(shè)置差異酸度梯度為pH 2.5，3.0，3.5，4.0，4.5。以體積分?jǐn)?shù)2%的接種量將活化液接種至差異酸度YEPD培養(yǎng)基中，同時空白對照，28 ℃恒溫培養(yǎng)3 d，利用紫外分光光度計測定560 nm下菌液的OD值，OD值越大，酵母菌的生長活性越強，酵母菌的耐酸性越強。

將純化菌株接種于YEPD液體培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫培養(yǎng)1 d，調(diào)整種子活化液濃度為1.0×107CFU/mL，采用富含有機酸的黃水調(diào)節(jié)高粱汁培養(yǎng)基的pH，設(shè)置差異酸度梯度為pH 2.5，3.0，3.5，4.0，模擬真實白酒發(fā)酵酸性環(huán)境。以體積分?jǐn)?shù)2%的接種量將活化液接種至差異酸度高粱汁培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫發(fā)酵9 d，蒸餾后檢測酒精度，每組進行3次重復(fù)。選取酸性環(huán)境下產(chǎn)酒精能力較高的酵母菌進行進一步研究。

1.4.3 酵母菌分子生物學(xué)鑒定 將篩選得到的酵母菌送至北京六合華大基因有限公司進行基因測序，采用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)進行PCR擴增，PCR擴增體系為：Super Mix 15 μL，Primer F(10p)1 μL，Primer R(10p)1 μL，模板(ng/μL)1 μL，ddH2O 12 μL。PCR擴增條件：96 ℃、10 min；96 ℃、20 s，56 ℃、20 s，72 ℃、30 s，35個循環(huán)；72 ℃、10 min，對PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠檢測，純化后測序。并在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行同源序列比對，采用MEGA.7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4.4 耐酸性酵母菌的生物學(xué)特性研究

(1)耐酸性：配制pH 2.5，3.0，3.5，4.0，4.5的高粱汁培養(yǎng)基，滅菌后待用。無菌條件下，以體積分?jǐn)?shù)2%的接種量將篩得的酵母菌種子液加入盛有100 mL差異酸度高粱汁培養(yǎng)基的錐形瓶中，28 ℃恒溫培養(yǎng)2～3 d，測定OD560 nm值，每組平行3次。

(2)耐高溫性：無菌條件下，以體積分?jǐn)?shù)2%的接種量分別將篩得酵母菌種子液加入含有100 mL的高粱汁培養(yǎng)基的錐形瓶中，分別置于36，40，44，48，52 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d，測定OD560 nm值，每組平行3次。

(3)耐酒精能力：無菌條件下，分別配制100 mL酒精度為2%vol，4%vol，6%vol，8%vol，10%vol的高粱汁培養(yǎng)基，再接種體積分?jǐn)?shù)2%的篩得酵母菌種子液，28 ℃ 恒溫培養(yǎng)2～3 d。測定OD560 nm值，每組平行3次。

(4)生長曲線：無菌條件下，以體積分?jǐn)?shù)2%的接種量將篩得酵母菌種子液加入含有250 mL的YEPD液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，28 ℃恒溫培養(yǎng)，每隔2 h用無菌移液槍吸取1.00 mL培養(yǎng)液，稀釋5倍后，利用紫外分光光度計檢測OD560 nm值，以不接種的YEPD培養(yǎng)基為對照組，重復(fù)3次，繪制并對比分析酵母菌的生長曲線。

1.4.5 耐酸性酵母菌發(fā)酵小試研究 擴大培養(yǎng)篩得酵母菌，調(diào)整種子活化液中酵母菌濃度處于1×107CFU/mL。參照張海英[19]的方法，以湘窖濃香型白酒回糟為原料，以4.5%的回糟曲添加量、0.2%糖化酶添加量、0.5%酵母菌液添加量進行混合，同時以不添加酵母菌菌液為空白組，以商用安琪酵母菌液為對照組，每組平行3次，分裝至玻璃瓶中，封口后置于濃香型白酒泥窖窖池上層醅中，模擬真實回糟發(fā)酵環(huán)境，冬季發(fā)酵1個月。按照DB34/T 2264—2014《固態(tài)發(fā)酵酒醅分析方法》檢測糟醅殘余淀粉含量、還原糖含量及酒精度。

1.4.6 數(shù)據(jù)處理 試驗數(shù)據(jù)采用Origin和Word軟件進行圖表繪制，通過SPSS 軟件對數(shù)據(jù)進行顯著性分析，利用MEGA 7.0軟件對酵母菌測序序列進行系統(tǒng)發(fā)育樹的建立。

2 結(jié)果與分析

2.1 中高溫大曲中酵母菌的分離純化與初篩

從YEPD富集培養(yǎng)基上挑取25株菌種作進一步分離純化，分別編號為dq1～dq25，根據(jù)酵母菌的生長情況挑選出3株活性較強的酵母菌dq1、dq4和dq9，其中3株酵母菌在TTC培養(yǎng)基、YEPD培養(yǎng)基、WL培養(yǎng)基的菌落形態(tài)和細(xì)胞結(jié)構(gòu)見圖1。菌株dq1在TTC培養(yǎng)基上顯色較深于菌株dq4和dq9，其發(fā)酵能力較優(yōu)于其他兩株菌。3株菌株菌落皆呈乳白色，表面光滑濕潤，細(xì)胞呈圓形或橢圓形，符合《真菌手冊》中酵母菌的菌落與細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

從左至右依次為TTC培養(yǎng)基、YEPD培養(yǎng)基、WL培養(yǎng)基、細(xì)胞形態(tài)，從上至下依次為菌株dq1，dq4和dq9

2.2 中高溫大曲中酵母菌的復(fù)篩

由圖2可知，當(dāng)pH>2.5時，不同菌種生長活性存在顯著性差異(P<0.05)。由于不同酵母菌對酸性條件適應(yīng)能力不同，酵母菌因生長環(huán)境酸度不同其生長活性也不同。當(dāng)pH為2.5時，不同菌株的生長活性不存在顯著性差異(P>0.05)；當(dāng)pH為3.0時，3株酵母菌的OD560 nm值強于pH為2.5的，由于OD值越大，其生長活性越強，因此當(dāng)pH為3.0時，3株酵母菌的生長活性強于pH為2.5的。當(dāng)pH為3.0時，菌株dq1和dq4的生長活性顯著高于菌株dq9；當(dāng)pH為3.5時，菌株dq1的生長活性顯著強于其他兩株菌，說明菌株dq1的耐酸性最強，因此確定以菌株dq1和dq4進行產(chǎn)酒精能力篩選。

字母不同表示同一pH下不同菌株生長活性差異顯著(P<0.05)

對菌株dq1和dq4進行差異酸度高粱汁培養(yǎng)基篩選，其在不同pH下的高粱汁差異酸度培養(yǎng)基中的產(chǎn)酒精能力見圖3。由圖3可知，在pH 2.5和pH 4.0條件下，兩株菌株的產(chǎn)酒精能力無顯著性差異(P>0.05)。在pH 3.0時，菌株dq1的產(chǎn)酒精能力顯著大于菌株dq4的(P<0.05)；而pH 3.5時，菌株dq4的產(chǎn)酒精能力顯著強于菌株dq1的(P<0.05)。

字母不同表示同一pH下不同菌株產(chǎn)酒精能力差異顯著(P<0.05)

結(jié)合差異酸度YEPD培養(yǎng)基中酵母菌生長活性篩選和差異酸度高粱汁發(fā)酵產(chǎn)酒精能力的篩選，確定酵母菌dq1為耐酸性較強、產(chǎn)酒精能力較優(yōu)的酵母菌，因此將酵母菌dq1進行分子生物學(xué)鑒定。

2.3 耐酸性酵母菌的分子生物學(xué)鑒定

根據(jù)測序結(jié)果，菌株dq1擴增產(chǎn)物的堿基長度約為750 bp，將所得序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫進行同源性比對并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖4。根據(jù)同源性對比發(fā)現(xiàn)菌株dq1與Saccharomycescerevisiae(MT322849.1)序列相似性達100%；與釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)聚于一支，鑒定所篩選的菌株dq1為釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。釀酒酵母是白酒發(fā)酵中至關(guān)重要的微生物，在發(fā)酵等行業(yè)中具有廣闊的應(yīng)用前景。

圖4 系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 耐酸性釀酒酵母的生物學(xué)特性分析

由圖5可知，菌株dq1在不同pH、溫度、酒精濃度下的生長活性存在顯著性差異(P<0.05)。菌株dq1在pH 3.0時的生長活性顯著大于pH 2.5時的，故菌株dq1能耐受pH 3.0的酸性，較葛隱等[20]研究中的耐酸性酵母菌的耐酸能力(pH 3.5)強，與李彥芹等[21]從酒醅中分離篩選得到酵母菌耐酸性一致；菌株dq1在48 ℃下的生長活性顯著大于52 ℃下的，因此菌株dq1能耐高溫48 ℃，優(yōu)于劉延波等[13]研究中耐高溫45 ℃酵母菌；菌株dq1在6%vol酒精度環(huán)境中的生長活性顯著大于8%vol時的，因此菌株dq1能耐酒精度6%vol，弱于伍強等[22]從野生獼猴桃中篩選出的釀酒酵母的耐酒精度12%vol；菌株dq1在2～8 h時處于對數(shù)增長期，適應(yīng)環(huán)境后迅速生長繁殖，14 h后處于穩(wěn)定期。

圖5 釀酒酵母dq1的生物學(xué)特性

2.5 耐酸性釀酒酵母的發(fā)酵小試分析

以濃香型白酒回糟糟醅為發(fā)酵原料，對發(fā)酵前后糟醅的淀粉及還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)進行檢測分析，同時對空白組、試驗組及對照組的糟醅進行蒸餾測其酒精度，相關(guān)結(jié)果如表1所示。

表1 優(yōu)良酵母菌發(fā)酵糟醅的理化指標(biāo)?

由表1可知，小試發(fā)酵后糟醅中的淀粉及還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著降低(P<0.05)，主要是依靠回糟曲中霉菌的糖化作用和回糟曲中酵母菌及試驗組添加的耐酸性釀酒酵母dq1的發(fā)酵作用。同時，釀酒酵母dq1試驗組的糟醅中淀粉和還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著低于空白組及安琪酵母對照組的(P<0.05)，而釀酒酵母dq1試驗組的糟醅中酒精含量顯著高于空白組及安琪酵母對照組的(P<0.05)，其中淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)較空白組降低了1.0%，殘?zhí)琴|(zhì)量分?jǐn)?shù)較空白組降低了1.3%，主要是因為回糟pH在3.0左右，而釀酒酵母dq1能耐酸性為pH 3.0，且在較低pH環(huán)境中能一定程度上進行發(fā)酵。綜上，酵母菌dq1在回糟發(fā)酵中能夠加強殘?zhí)抢寐剩行岣咴沲芯凭?，從而提高回糟出酒率?/p>

3 結(jié)論

通過對湖南省湘窖酒業(yè)有限公司中高溫大曲中酵母菌進行分離篩選及分子生物學(xué)鑒定，獲得一株優(yōu)良酵母菌dq1，經(jīng)鑒定為釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)；特性研究結(jié)果表明，釀酒酵母dq1可耐受pH 3.0、48 ℃，其pH和高溫耐受性具有明顯優(yōu)勢；回糟發(fā)酵小試研究中，釀酒酵母dq1的添加提高了回糟中14.9%的殘?zhí)抢寐?，可作為濃香型白酒回糟發(fā)酵的優(yōu)勢酵母菌。研究僅為小試，后續(xù)可將優(yōu)良酵母菌制備強化大曲用于中試試驗，進一步探究其對濃香型白酒回糟發(fā)酵的影響。